熒光偏振和多重聚合酶鏈技術(shù)在肺炎支原體、肺炎衣原體檢測(cè)中的應(yīng)用.doc

精品論文，值得推薦熒光偏振和多重聚合酶鏈技術(shù)在肺炎支原體、肺炎衣原體檢測(cè)中的應(yīng)用 作者：姜怡王玲伍雪艷閆小君董秀珍 【摘要】 目的: 應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)和熒光偏振檢測(cè)技術(shù)建立一種方便可靠、簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的肺炎支原體、肺炎衣原體DNA同步檢測(cè)方法. 方法: 以與肺炎衣原體、肺炎支原體16SRNA序列互補(bǔ)的特異、無(wú)交叉反應(yīng)的兩對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中行多重聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增陰陽(yáng)性對(duì)照及521例患兒咽喉分泌物，將熒光偏振檢測(cè)技術(shù)與模板指導(dǎo)的DNA末端延伸反應(yīng)（TDI FP）結(jié)合，對(duì)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，并與測(cè)序方法結(jié)果比較. 結(jié)果: 應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)和TDI FP技術(shù)檢測(cè)患者521例，肺炎衣原體感染陽(yáng)性121例，肺炎支原體感染陽(yáng)性113例，與測(cè)序檢測(cè)方法符合率100%，其中肺炎衣原體、肺炎支原體雙重感染陽(yáng)性10例. 結(jié)論: 建立了基于熒光偏振技術(shù)檢測(cè)肺炎衣原體、肺炎支原體的新方法，具有良好的特異性,方便簡(jiǎn)單,無(wú)需標(biāo)記探針,可用于臨床檢測(cè). 【關(guān)鍵詞】 肺炎衣原體；肺炎支原體；熒光偏振；多重聚合酶鏈反應(yīng) 【Abstract】 AIM: To develop a simple，economical，accurate and practical method for the detection of Mycoplasma pneumoniae (MP) and Chlamydia pneumoniae (CP) using Templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization （TDIFP） and a multiple PCR. METHODS: Twopair primers of MP and CP were used to amplify DNA of positive and negative controls and 521 samples by a multiple PCR, then the PCR products were identified by TDIFP：MP and CP specific probe hybridization and special fluorogenic label ddNTP incorporation. A fluorogenic ddNTP was directly added to the end of probe under the direction of template. The results were measured by a fluorescencepolarization microplate reader and compared with the results of sequencing. RESULTS: There were 113 patients infected with MP, 121 patients infected with CP, 10 with double infections. Compared with the results of sequencing, the results measured by TDIFP showed an excellent overall agreement when single infection was taken into account. The proposed method could detect single or multiple infection by a multiple PCR, but DNA sequencing method was limited. TDIFP method reached the detection level (10 copies) and the data of FP values showed excellent reproducibility. CONCLUSION: The proposed method allows a sensitive, special, simple and economical detection of MP and CP by a multiplePCR without any use of label probes. It is expected to be an extremely useful tool in clinic. 【Keywords】 Mycoplasma pneumoniae; Chlamydophila pneumoniae; fluorescenc polarization, multiple PCR 0引言 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)和肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, CP)是引發(fā)呼吸道感染的常見(jiàn)病因，患者的起始癥狀及胸部X線特征與其他病原體特別是SARS病毒引起的呼吸道感染極其相似而易誤診. 因此，及早快速準(zhǔn)確地檢測(cè)MP,CP感染，對(duì)鑒別診斷和預(yù)防控制相關(guān)疾病非常重要1-2. 我們采用熒光偏振檢測(cè)與模板指導(dǎo)的末端延伸反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合（TDIFP）的方法，建立了在同一反應(yīng)體系中應(yīng)用多重引物，同步檢測(cè)MP,CP感染的方法. 1材料和方法 1.1材料 標(biāo)本采集于在第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院、西京醫(yī)院、西安交通大學(xué)第二醫(yī)院兒科的就診患者521例,在24 h內(nèi)未使用任何抗生素. 用無(wú)菌咽試子插入咽喉處旋轉(zhuǎn)涂抹, 停留1 min后取出試子重懸于500 L PBS中，置于-20備檢. pGEMTEasy Vector System TA Cloning試劑盒(Promega Corporation公司)，BigDye Terminator Cycle Sequenceing試劑盒、ABI 377（美國(guó)AB公司），ddGTPR110/ddCTPTAMRA,核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶、熒光偏振檢測(cè)儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）. 含CP，MP保守區(qū)基因質(zhì)粒由本研究所提供. DNA引物及探針由上海博亞公司合成，據(jù)GenBank基因序列及引物合成原則選取CP(CP 16S ribosomal RNA)，MP(MP 16S ribosomal RNA)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)各自特異、互不交叉的引物、探針及摻入堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為160, 275 bp. CP：引物5 tatttgacaactgtagaaatacagc 3， 5 ttagagttccccaccctaagtgctggc 3，探針5 cgcaaggacagatacacaggtgctgcatgg 3，摻入堿基ddCTPTAMRA，MP：引物5 aaaggacctgcaagggttcgttat 3，5 ctctagccattacctgctaaagtc 3，探針5 agtagaatagccacaatgggactgacac 3，摻入堿基ddGTPR110. 1.2方法 1.2.1DNA的提取及多重PCR擴(kuò)增將分泌物在500 L PBS中反復(fù)震蕩洗滌擠干，12 000 g離心2 min, 棄上清， 沉淀震蕩重懸于200 L PBS中， -20反復(fù)凍融3次, 煮沸, 12 000 g離心5 min, 留上清作模板. 取DNA模板5 L，擴(kuò)增靶片段DNA. 擴(kuò)增條件：dNTP 150 mol/L，引物各20 pmol/L，MgCl2 2.0 mmol/L. 94 5 min變性, 94 1 min，50 2 min, 72 5 min，30個(gè)循環(huán). 含CP，MP16SRNA基因質(zhì)粒DNA混合物為陽(yáng)性對(duì)照，不含待測(cè)靶基因的同源質(zhì)粒DNA為陰性對(duì)照. 1.2.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析采用CP,MP特異序列雜交與模板指導(dǎo)的末端堿基摻入延伸反應(yīng)（TDIFP）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分析. PCR產(chǎn)物與核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶37孵育1 h，消化剩余的引物和dNTP，95 15 min滅活酶活性. 然后以此產(chǎn)物為模板，分別以CP,MP特異探針及標(biāo)記的ddGTPR110/ddCTPTAMRA為底物，在DNA聚合酶及其緩沖液中于95 2 min, 95 15 s，45 30 s,25個(gè)循環(huán)，特異序列雜交并引導(dǎo)模板指導(dǎo)的末端堿基ddGTPR110/ddCTPTAMRA摻入延伸反應(yīng)(圖1)，分別于波長(zhǎng)535,595 nm 檢測(cè)R110,TAMRA摻入熒光偏振值（mp）. 1.2.3敏感性測(cè)定以10倍比例分別將CP,MP陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)粒倍比稀釋直至10ag(1拷貝)，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行TDIFP法分析判讀. 1.2.4重復(fù)性測(cè)定分別對(duì)陰陽(yáng)性對(duì)照及521例標(biāo)本的熒光偏振值重復(fù)檢測(cè)10次，觀察FP變化. 1.2.5與測(cè)序方法對(duì)比應(yīng)用試劑盒將隨機(jī)抽取TDIFP檢測(cè)CP,MP陽(yáng)性各50例標(biāo)本PCR產(chǎn)物連接至pGEMTEasy質(zhì)粒載體中，測(cè)定插入片段的DNA序列，在NCBI BLAST2.0中確定所測(cè)序列，并與TDIFP方法檢測(cè)結(jié)果比較. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 檢測(cè)結(jié)果用SPSS 10.0軟件經(jīng)2檢驗(yàn). 2結(jié)果 21TDIFP法檢測(cè)檢測(cè)陰、陽(yáng)性對(duì)照與標(biāo)本DNA經(jīng)2對(duì)引物擴(kuò)增后，分別與CP,MP的特異探針及熒光標(biāo)記堿基反應(yīng)，分別檢測(cè)R110，TAMRA熒光偏振值. 陰性對(duì)照無(wú)特異的雜交反應(yīng)并ddGTPR110/ddCTPTAMRA摻入，TAMRA，R110值均未增高，CP,MP陽(yáng)性對(duì)照分別與相應(yīng)特異的探針發(fā)生雜交反應(yīng)并ddGTPR110或ddCTPTAMRA摻入，R110或TAMRA值分別增高；TAMRA及R110值均增高, 則CP,MP雙重陽(yáng)性(表1). 521例標(biāo)本中CP感染陽(yáng)性121例，MP感染陽(yáng)性113例，其中CP,MP雙重感染陽(yáng)性10例.表1對(duì)照與標(biāo)本的R110，TAMRA熒光偏振值（略） 2.2敏感性測(cè)定對(duì)陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒倍比稀釋的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的TDIFP分析表明，該法敏感度可達(dá)10拷貝. 2.3重復(fù)性測(cè)定在521例標(biāo)本中，熒光偏振值檢測(cè)10次的變化幅度小于10 mp，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2.4與測(cè)序方法對(duì)比50例單純CP，MP感染與測(cè)序方法符合率達(dá)98% (P>0.05). 3討論 CP，MP是引發(fā)急性呼吸、循環(huán)系統(tǒng)感染的主要病原體，在無(wú)實(shí)驗(yàn)室依據(jù)時(shí)臨床難以與其他病原進(jìn)行鑒別3-4. 傳統(tǒng)的抗原檢測(cè)易受到采樣、運(yùn)送、保存、用藥及抗原交叉反應(yīng)等多種因素的干擾. 基因診斷直接檢測(cè)臨床標(biāo)本感染病原體的基因, 屬病因診斷，在疾病預(yù)防、診斷及療效考核等各方面都有重要意義5. 經(jīng)典的采用瓊脂糖凝膠電泳等手段對(duì)檢測(cè)結(jié)果觀察分析，人為誤差大，假陽(yáng)性、假陰性率高，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)需特異標(biāo)記的探針，實(shí)驗(yàn)成本增加，價(jià)格昂貴6. 熒光偏振技術(shù)檢測(cè)偏振光強(qiáng)度而非熒光強(qiáng)度，靈敏度高，快速、簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確. TDI反應(yīng)是在DNA模板引導(dǎo)下的引物末端延伸反應(yīng)，通過(guò)引物擴(kuò)增、確定特異探針與靶DNA的識(shí)別雜交及在模扳指導(dǎo)下在特定位置特異鹼基摻入三重把關(guān)，決定基因型，從而確保反應(yīng)的特異性7. 我們?cè)谝淮蜳CR反應(yīng)體系中加入2對(duì)高度特異、互不交叉的CP, MP引物，針對(duì)2個(gè)靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再利用TDIFP基因檢測(cè)技術(shù)，使用2個(gè)特異探針及特異末端終止堿基，對(duì)PCR產(chǎn)物鑒定，檢測(cè)CP, MP，使得對(duì)感染的檢測(cè)快速、可靠、特異及操作簡(jiǎn)單，尤其能降低多重混合感染的漏診率和檢測(cè)成本，提高了檢驗(yàn)效率，與測(cè)序檢測(cè)方法符合率高, 敏感度高達(dá)10拷貝，不失為高通量的、臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)用的基因診斷新方法. 【參考文獻(xiàn)】 1陳小友，賈土妹，陳黎勤. 肺炎衣原體和肺炎支原體MP感染與兒童哮喘的關(guān)系J. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006， 18（10）：50-54. 2姚瑩. SARS診斷的鑒別思考J. 中國(guó)誤診學(xué)雜志，2005,5(5)：959-960. 3Liu G, Talkington DF, Fields BS,et al. Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in young children from China with communityacquired pneumoniaJ. Diagn Microbiol Infect Dis, 2005,52(1):7-14. 4Sinaniotis CA, Sinaniotis AC. Communityacquired pneumonia in childrenJ. 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