課件：金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)與計(jì)數(shù).ppt

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)與計(jì)數(shù),概況,葡萄球菌屬微球菌科，本菌有19個(gè)菌種，從人體上可檢出12個(gè)種。 葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血?jiǎng)游锏恼衬は嚓P(guān)系，有些種是人及動(dòng)物的條件致病菌。 金黃色葡萄球菌對(duì)人類有致病性，通常被稱為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱為化膿性球菌。,金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性,形態(tài)與染色： 金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑0.41.2m，大小不一，平均直徑約為0.8m。 革蘭氏染色陽(yáng)性，呈葡萄串狀排列。無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。,培養(yǎng)特性： 易培養(yǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。 需氧或兼性厭氧。 最適生長(zhǎng)溫度37C，最適生長(zhǎng)pH 7.4。耐鹽性強(qiáng)，在含1015%的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長(zhǎng)，可用于篩選菌種。 在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)1824，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落?？僧a(chǎn)生金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。,在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為型溶血。 可產(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周圍有白色沉淀環(huán)的菌落。 大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗(yàn)、 VP試驗(yàn)多為陽(yáng)性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽(yáng)性。,金黃色葡萄球菌的酶,金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱DNA酶。這兩種酶均與金黃色葡萄球菌的致病性有關(guān)。 血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān)。一般認(rèn)為，血漿凝固陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無(wú)致病力的菌株。血漿凝固酶對(duì)熱穩(wěn)定，能抵抗6030min甚至10030min后，仍能保存大部分活性。 耐熱DNA酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標(biāo)之一。該酶的最適pH為9.0。,金黃色葡萄球菌腸毒素：是金黃色葡萄球菌一種重要的致病物質(zhì)。本菌引起的食物中毒是因?yàn)槭称肺廴玖私瘘S葡萄球菌后，由細(xì)菌產(chǎn)生大量腸毒素而導(dǎo)致的。 近年報(bào)導(dǎo)表明，50%以上的金黃色葡萄球菌菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下可產(chǎn)生腸毒素，并且1個(gè)菌株能產(chǎn)生兩種或兩種以上的腸毒素。 腸毒素是一種可溶性蛋白質(zhì)，由單個(gè)無(wú)分枝的肽鏈組成。分子量約為3000左右。易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。,金黃色葡萄球菌的腸毒素,耐熱，經(jīng)100煮沸30min不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響。食物中的腸毒素耐熱性更強(qiáng)，一般烹調(diào)溫度不能將其破壞。218248 的油中需30min才能被破壞?？梢鸺毙晕改c炎。 根據(jù)腸毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E 5 個(gè)型。A型腸毒素引起的食物中毒較多，約占50%左右。其他依次為D、C、B和E型。也有AD、AB、AC、BC等。,A型腸毒素毒力較強(qiáng)，攝入1g即可引起中毒；B型毒力較弱攝入25g，才引起中毒。一般認(rèn)為引起人中毒的最小劑量是1.07.2g/kg。,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),金黃色葡萄球菌的檢測(cè)程序,檢樣25g(mL) 225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液,7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯,361,Baird-Parker平板，血平板,涂片染色,觀察溶血,血漿凝固酶試驗(yàn),報(bào)告,血平板1824h， Baird-Parker平板1824h或4548h。,BHI肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面,361,1824h,增菌培養(yǎng)基,7.5%氯化鈉肉湯：為葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基，因金黃色葡萄球有耐受高鹽的特性，因而能在此增菌液中生長(zhǎng)，除某些嗜高鹽的海洋菌外，大多數(shù)細(xì)菌都被增菌液中的高鹽所抑制。 胰酪胨大豆肉湯：含氯化鈉達(dá)10%，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氫二鉀和葡萄糖促進(jìn)葡萄球菌的生長(zhǎng)。,樣品的稀釋,固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225 mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000 r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225 mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。,增菌與分離培養(yǎng),增菌培養(yǎng)：吸取5mL上述樣品勻液，接種于50mL 7.5%氯化鈉肉湯或10%胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，361培養(yǎng)18h24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，污染嚴(yán)重時(shí)在10%胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長(zhǎng)。 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培養(yǎng)18h24h。Baird-Parker平板361培養(yǎng)18h24h或45h48h。,分離培養(yǎng)基,Baird-Parker瓊脂：培養(yǎng)基中含有卵黃亞碲酸鉀，能抑制大多數(shù)細(xì)菌的繁殖，并能促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)使其產(chǎn)生黑色和暈圈。培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉和甘氨酸也能促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。 金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)，直徑約23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的硬度，偶而可見(jiàn)無(wú)混濁帶和透明圈的非典型菌落。,長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。,金黃色葡萄球菌,空白培養(yǎng)基,分離培養(yǎng)基,血瓊脂：是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有5%的脫纖維血(羊血或兔血)。用于觀察金黃色葡萄球菌的溶血現(xiàn)象。金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上呈溶血。 金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：呈金黃色，有時(shí)也呈白色，大而突起，圓形、不透明、表面光滑，周圍有透明的溶血環(huán)。,金黃色葡萄球菌的重要鑒定- 血漿凝固酶試驗(yàn),試驗(yàn)原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細(xì)菌表面 ，產(chǎn)生凝固。 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，為結(jié)合凝固酶；另一種是菌細(xì)胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。,血漿凝固酶試驗(yàn),挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5mL BHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，361培養(yǎng)18 h24 h。 取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入可疑菌落的BHI培養(yǎng)物0.2mL0.3mL，振蕩搖勻，置361溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽(yáng)性結(jié)果。,同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。 結(jié)果如可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培養(yǎng)18h48h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。,結(jié)果報(bào)告,如血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，可判定為金黃色葡萄球菌 。 報(bào)告在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。,影響血漿凝固酶試驗(yàn)的因素,血漿：血漿凝固酶試驗(yàn)可選用人血漿或兔血漿。用人血漿出現(xiàn)凝固的時(shí)間短，約93.6%的陽(yáng)性菌在1h內(nèi)出現(xiàn)凝固。用兔血漿1h內(nèi)出現(xiàn)凝固的陽(yáng)性菌株僅達(dá)86%，大部分菌株可在6h內(nèi)出現(xiàn)凝固。 若被檢菌為陳舊的培養(yǎng)物（超過(guò)1824h），或生長(zhǎng)不良，可能造成凝固酶活性低，出現(xiàn)假陰性。,不能使用甘露醇氯化鈉瓊脂上的菌落做血漿凝固酶的實(shí)驗(yàn)，因所有高鹽培養(yǎng)基都可以抑制A蛋白的產(chǎn)生，造成假陰性結(jié)果。 不要用力振搖試管，以免凝塊振碎。 實(shí)驗(yàn)必需設(shè)陽(yáng)性(標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌)、陰性(白色葡萄球菌)、空白(肉湯)對(duì)照。 玻片法只能檢測(cè)結(jié)合凝固酶，而試管法可檢測(cè)兩種凝固酶。因此，兩種試驗(yàn)所得結(jié)果可完全不同。 玻片法只用于篩選。,金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù),第一法 Baird Parker 平板法 第二法MPN法 第三法PetrifilmTM測(cè)試片法,第一法:平板計(jì)數(shù)法,檢驗(yàn)程序,檢樣25g(mL) 225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液,10倍稀釋,選擇三個(gè)連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種Baird-Parker平板,計(jì)數(shù)及血漿酶試驗(yàn),報(bào)告,361,4548h,樣品的接種、培養(yǎng)與典型菌落的確認(rèn),根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml，以0.3，0.3，0.4ml接種量，分別加入三塊Baird-Parker平板，用L棒涂布整個(gè)平板，(注意不要觸及平板的邊緣)。 接種前應(yīng)注意保持平板的干燥(可在2050的培養(yǎng)箱中干燥)，通常情況下涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板置361培養(yǎng)1h后，再反轉(zhuǎn)平板，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 培養(yǎng)溫度與時(shí)間：361，4548h。 典型菌落確認(rèn)：從典型菌落中任選五個(gè)菌落（小于五個(gè)全選），分別接種到5mLBHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，361培養(yǎng)1824h后進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。,典型菌落計(jì)數(shù)與計(jì)算公式的應(yīng)用,計(jì)數(shù)范圍要求：選擇合計(jì)菌落數(shù)在20200的平板，計(jì)數(shù)典型菌落。,公式一的使用范圍： -最低稀釋度平板的菌落小于20 cfu，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落； -某一稀釋度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，但上一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落； -某一稀釋度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，且上一稀釋度平板上有典型菌落，其平板上的菌落數(shù)不在20 cfu200 cfu之間，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；,公式一,T=AB/Cd T:樣品中金黃色葡萄球菌落數(shù)； A:某一稀釋度典型菌落的總數(shù) ； B:某一稀釋度血漿凝固酶陽(yáng)性的菌落數(shù) ； C:某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)； d:某一稀釋度。,公式應(yīng)用例一,公式一： T=AB/Cd T=65450.1=520,高、低稀釋度平板均有典型菌落，但其中高稀釋度二平板的菌落數(shù)均不在20200之間，選擇低稀釋度的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。,N=T/1.1d T：兩個(gè)稀釋度平板上確認(rèn)的金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)之和； d：稀釋因子(第一稀釋度)。 公式二的使用范圍：平板菌落數(shù)均在20 cfu200 cfu之間。 公式引用于ISO 6888-1:1999(E),公式二,公式應(yīng)用例二,公式二： N=T/1.1d T1=18335=110 T2=2145=17 T= T1+ T2=110+17=127 N=T/1.1d=1271.10.1=1200,所有稀釋度平板合計(jì)菌落數(shù)均在20200間：,結(jié)果報(bào)告,單位：cfu/g或者cfu/mL；若T或者N為0，報(bào)告1d-1 cfu/mL(g)。,第二法 MPN法,MPN檢驗(yàn)程序,25g(mL)檢樣+225mL稀釋液， 勻質(zhì),10倍系列稀釋,選擇3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，吸1mL樣液，每稀釋度各接種3管胰酪胨大豆肉湯，樣品的最高稀釋度，能達(dá)到獲得陰性終點(diǎn),361,4548h,接種Baird-Parker平板,血漿凝固酶試驗(yàn),4548h,361,查MPN表,報(bào)告結(jié)果,接種和培養(yǎng),根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml接種到胰酪大豆肉湯管，每稀釋度接種3管。361培養(yǎng)4548h。 用接種環(huán)從有細(xì)菌生長(zhǎng)的各管中，移取1環(huán)分別接種于Baird-Parker平板361培養(yǎng)4548h。 確認(rèn)典型菌落，并從典型菌落中至少挑取1個(gè)菌落做血漿凝固酶試驗(yàn)。,結(jié)果報(bào)告,計(jì)算血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性菌落對(duì)應(yīng)的管數(shù)，查MPN檢索表。 結(jié)果報(bào)告： MPN/g或MPN /mL,注意要點(diǎn),MPN法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品。 “樣品的最高稀釋度，能達(dá)到獲得陰性終點(diǎn)”的理解： -盡可能避免1100MPN/g或ml的出現(xiàn)。 -方便MPN表的查找。,第三法PetrifilmTM測(cè)試片法,適用范圍,PetrifilmTM測(cè)試片法適用于肉及其制品，奶制品等。,PetrifilmTM測(cè)試片法檢驗(yàn)程序,檢樣25g(mL)+225mL稀釋，勻質(zhì)，10倍系列稀釋,選擇適宜稀釋度的樣品勻液，各取1mL分別加入紙片,361,242h,判讀,沒(méi)有菌落,只有典型紫紅色菌落,將所有紫紅色菌落計(jì)數(shù)為金黃色葡萄球菌,除典型紫紅色菌落外其他顏色的菌落,加入確認(rèn)反應(yīng)片， 361，培養(yǎng)13h,有粉紅色菌暈的菌落計(jì)數(shù)為金黃色葡萄球菌,報(bào)告,第三法 PetrifilmTM測(cè)試片法,金黃色葡萄球菌PetrifilmTM測(cè)試片，含具有顯色功能、經(jīng)改良的Baird-Parker培養(yǎng)基，對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的選擇。金黃色葡萄球菌在測(cè)試片上生成為暗紫紅色的菌落，可以直接完成鑒定和計(jì)數(shù)。,金黃色葡萄球菌PetrifilmTM確認(rèn)反應(yīng)片,金黃色葡萄球菌PetrifilmTM確認(rèn)反應(yīng)片含有顯色劑和耐熱去氧核糖核酸(DNA)，金黃色葡萄球菌可生產(chǎn)耐熱DNA酶，此酶與反應(yīng)片上的顯色劑反應(yīng)，形成粉紅色環(huán)。而其他細(xì)菌因不產(chǎn)生耐熱DNA酶沒(méi)有該反應(yīng)。但在葡萄球菌屬中，豬葡萄球菌、中間葡萄球菌也會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。,計(jì)數(shù)與結(jié)果報(bào)告,菌落計(jì)數(shù): 到培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目視、或用放大鏡輔助計(jì)數(shù)； 選取菌落數(shù)在15150之間的測(cè)試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。 選擇菌落數(shù)在15150之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之； 如果所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15， 則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；,如果所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以()1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之； 如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150個(gè)時(shí)，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之，計(jì)數(shù)菌落數(shù)大于150個(gè)的測(cè)試片時(shí)，可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以30即為測(cè)試片上估算的金黃色葡萄球菌數(shù) (圓形生長(zhǎng)面積為30 cm2)。 最終菌落濃度的單位以”cfu/g (mL