基因組學(xué)課件9.功能基因組學(xué).pptVIP

功能基因組學(xué) 中英聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 功能基因組學(xué) 功能基因組學(xué)，后基因組學(xué)(Post genomics)： 利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息和產(chǎn)物 通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能 生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向?qū)Χ?個(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。 功能基因組學(xué)的目的 基因功能發(fā)現(xiàn) 基因表達(dá)分析及突變檢測 從基因組整體水平上對(duì)基因的活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行闡述。 采用一些新的技術(shù)（SAGE、DNA芯片），對(duì)成千上 萬的基因表達(dá)進(jìn)行分析和比較 功能基因組學(xué)簡介 基因組DNA測序： 人類對(duì)自身基因組認(rèn)識(shí)的第一步。 功能基因組學(xué)： 從基因組信息與外界環(huán)境相互作用的高度，闡 明基因組的功能。 功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容： 人類基因組 DNA 序列變異性研究 基因組調(diào)控的研究 模式生物體表達(dá)的研究 生物信息學(xué) 功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容 基因的識(shí)別 估計(jì)基因的功能 基因功能的確定 基因的識(shí)別 預(yù)測基因組的全部編碼區(qū)或稱開放閱讀框 架，目前基因組功能注釋的一個(gè)主要方面。 一是評(píng)估未知DNA 片段編碼可能性的概 率型方法，另一類是通過同源性比較搜尋蛋白 質(zhì)庫 / dbEST 庫找尋編碼區(qū)。 研究表明：鑒定和發(fā)現(xiàn)表達(dá)基因最快的途 徑是確定cDNA 的部分序列，即EST ，這種序 列在大多數(shù)情況下已足夠用于確認(rèn)對(duì)應(yīng)的基因 。 基因的識(shí)別 EST 策略：一種快速有效地在一個(gè)基因 組中抽樣獲取有效基因序列的方法。 特點(diǎn)：可以用一個(gè)未知功能的cDNA, 確 定一個(gè)短的DNA序列如300400bp,而后，這 些短的序列可以用作標(biāo)簽去檢索已知的數(shù)據(jù) 庫確定一個(gè)特異的基因。 表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST) 鑒定和發(fā)現(xiàn)表達(dá)基因的最快途徑 隨機(jī)挑選的cDNA克隆進(jìn)行一端或二端長為300 500pb的測序，這種序列在大多數(shù)情況下已足夠確 認(rèn)對(duì)應(yīng)的基因 通常從已有的cDNA文庫中隨機(jī)取出幾百或幾千個(gè) 克隆，1次測序產(chǎn)生。 只含有基因的外顯子，cDNA克隆的測序分析可以 了解基因的表達(dá)情況 EST的數(shù)目可以提示它所代表的基因表達(dá)的拷貝數(shù) 。一個(gè)基因在組織中表達(dá)的次數(shù)越多，其相應(yīng)的 EST也越多。 EST應(yīng)用 目前主要被用于尋找新基因和了解基因的表達(dá) 概況 步驟如下: 建立某種生物材料或組織的cDNA文庫，從文庫中 隨機(jī)取出足夠量的cDNA克隆進(jìn)行自動(dòng)測序，將所 得的EST數(shù)據(jù)與dbEST等數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)比較,確定哪 些代表已知基因，哪些代表未知基因，進(jìn)一步分析 全部EST以獲得生物或組織的基因表達(dá)概況，并深 入研究未知基因 用EST和cDNA序列與己知的DNA序列進(jìn)行序列相 似性比較,可以確定很多基因的內(nèi)含子位置 EST還被用來確定編碼區(qū)的邊界，分析基因組的轉(zhuǎn) 錄圖譜 結(jié)合酵母雙雜交系統(tǒng)，進(jìn)行蛋白質(zhì)互作研究 估計(jì)基因的功能（以小麥基因組為例） 確定基因的功能毫無疑問仍然是小 麥基因組學(xué)最大的挑戰(zhàn) ，許多假設(shè)的方 法正在被用來推測基因功能。 估計(jì)基因的功能（以小麥基因組為例） 第一步，確立小麥EST 或基因組克隆與其 它植物假定的定向進(jìn)化同源基因的同源性。如 果在其它植物中一個(gè)基因的功能已知，那就表 示小麥EST 具有相似的功能。 第二步，在作圖群體中EST 與相關(guān)表型的 連鎖，高密度圖譜可以用來提高連鎖假設(shè)的力 度，然而小麥基因組中重組頻率高的區(qū)域和重 組頻率低的區(qū)域呈非隨機(jī)分布，且小麥單一位 點(diǎn)上存在多基因家族，限制了通過連鎖進(jìn)行候 選基因的分析。 估計(jì)基因的功能（以小麥基因組為例） l高分辨率雙向蛋白質(zhì)電泳和外源表達(dá)體 系：提供一種補(bǔ)充小麥功能基因組學(xué)研 究的蛋白質(zhì)組學(xué)方法 l改進(jìn)的微陣列方法和蛋白質(zhì)組學(xué)研究方 法：確定可能影響到小麥淀粉A 顆粒和B 顆粒的特異起始和合成的新基因。 基因功能的確定（以小麥基因組為例） 功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 引起植物表型變異的特異性突變體的研究 大多數(shù)用于基因發(fā)現(xiàn)的精密體系，像 模式植物中的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和基因陷阱 ，都要依靠高度有效的轉(zhuǎn)化體系。 基因功能的確定（以小麥基因組為例） 高效轉(zhuǎn)化體系的獲得是存在于小麥基因功能證實(shí)階 段的一個(gè)主要障礙。 目前小麥轉(zhuǎn)化效率的平均值范圍在0.1%5% 之間 ，太低的轉(zhuǎn)化率不能用于發(fā)展一種建立在轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)上的 基因標(biāo)簽體系。 在把玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座單元轉(zhuǎn)入小麥愈傷組織方面 作了一些嘗試。玉米的Ac/Ds因子在轉(zhuǎn)基因小麥愈傷組 織中的激活和解離已經(jīng)得到證實(shí)，與在其它植物中的觀 察結(jié)果相同。 Ac/Ds轉(zhuǎn)座酶的高水平轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致了切除頻 率的下降，因此隨著小麥轉(zhuǎn)化和再生效率的提高，根據(jù) 異源轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽來發(fā)現(xiàn)基因是可行的。 基因功能的確定（以小麥基因組為例） 隨著植物功能基因組學(xué)研究的不斷 深入，新的研究技術(shù)和方法，如蛋白質(zhì) 組學(xué)、DNA 微陣列和生物信息學(xué)等也將 會(huì)應(yīng)用到小麥功能基因組研究中。 基因功能分析 l 比較不同組織和不同發(fā)育階段基因表達(dá)模式的 差異 l 比較正常狀態(tài)和疾病狀況下基因表達(dá)模式的差 異 l系統(tǒng)了解不同組織在發(fā)育過程中、在不同環(huán)境條件 下，mRNA的表達(dá)水平 l根據(jù)基因的時(shí)空表達(dá)類型對(duì)基因進(jìn)行分類 l通過比較同類基因的調(diào)控序列發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控因子 l根據(jù)基因表達(dá)的變化，結(jié)合已知調(diào)控基因突變體的 表達(dá)情況研究表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。 基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)功能的研究 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) 在后基因組時(shí)代研究重心將從揭示生命的所有遺 傳信息轉(zhuǎn)移到整體水平上對(duì)功能的研究。 核心內(nèi)容包括2個(gè)部分: 1. 蛋白質(zhì)組研究體系的建立、完善 蛋白質(zhì)組技術(shù)體系和蛋白質(zhì)組信息學(xué)技術(shù)體 系包括:蛋白質(zhì)樣品制備和鑒定蛋白質(zhì)相互作用 網(wǎng)絡(luò)的研究技術(shù)等 2. 與重要的生物學(xué)問題有關(guān)的功能蛋白質(zhì)組研究 目前功能基因組研究的主要技術(shù)及應(yīng)用 功能基因表達(dá)克隆(functional cloning) 基因芯片(gene chip)或基因微陣列技術(shù)(micro array) 基因表達(dá)系統(tǒng)分析(serial analysis of gene expression,SAGE)或表 達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag,EST) 蛋白質(zhì)組技術(shù)(proteomics) 質(zhì)譜測序技術(shù) 生物信息學(xué)(bioinformatics) 轉(zhuǎn)基因(transgenics) 基因敲除(gene knock out) 這些前沿技術(shù)為功能基因組學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障. 在植物功能基因組研究方面,目前應(yīng)用較多的是EST,基因芯片, 蛋白質(zhì)組技術(shù),反向、正向遺傳學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)等等. SAGE （serials analysis of gene expression） 基因表達(dá)系列分析 Velculescu 及其同事于1995年創(chuàng)立 SAGE特點(diǎn)： 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物組研究，也就是轉(zhuǎn)錄水平的研究； 通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個(gè)EST，尋找出表達(dá)豐度不 同的SAGE標(biāo)簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達(dá) 信息； SAGE區(qū)別于差異顯示、消減雜交等其它技術(shù)的主要特點(diǎn) 是可用于尋找那些較低豐度的轉(zhuǎn)錄物，最大限度地收集基 因組的基因表達(dá)信息，這使之成為從總體上全面研究基因 表達(dá)、構(gòu)建基因表達(dá)圖譜的首選策略； SAGE可用于在不同環(huán)境、不同生理狀態(tài)及不同生長階段 的細(xì)胞和組織表達(dá)圖譜構(gòu)建，對(duì)不同狀態(tài)下基因表達(dá)水平 的定量或定性比較，特別是對(duì)疾病組織與正常組織的比較 發(fā)展迅速； SAGE 技術(shù)的主要理論依據(jù)： 來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（ 911bp）含有鑒定一個(gè)轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息 ，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽（tag）； 通過簡單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大 量多聯(lián)體（concatemer），對(duì)每個(gè)克隆到載體的多 聯(lián)體進(jìn)行測序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表 達(dá)的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基 因的表達(dá)豐度（abundance）。 1. 將5g含有oligo dT（引物）的磁珠與 RNA混合。 2. 合成雙鏈cDNA。 3. 用Nla酶消化形成一條鏈末端有標(biāo) 簽的產(chǎn)物。 4. 將樣品分成兩份，連接成含有識(shí)別序 列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。 5. 用Mme I切割每一個(gè)樣品形成約60bp 的標(biāo)簽。 SAGE 步驟 6. 延伸5秒，連接成約130bp的雙 鏈標(biāo)簽 。 7. PCR擴(kuò)增。 8. 用Nla 酶切130bp產(chǎn)物釋放 34bp雙鏈標(biāo)簽 。 9. 連接片斷形成串聯(lián)體。 10. 克隆到pZErO-1+里，并測序 。 SAGE實(shí)例 蛋白質(zhì)組(Proteome) 蛋白質(zhì)組定義 廣義上是指某種細(xì)胞或組織中基因組表達(dá)的 所有蛋白質(zhì); 狹義上, 可以指不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化 . 蛋白質(zhì)組學(xué)定義 研究蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)和功能的領(lǐng)域稱為蛋白質(zhì) 組學(xué). 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容: 分析全部蛋白質(zhì)組所有成分以及它們的數(shù)量; 確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、 互作機(jī)制、生物活性和特定功能等 蛋白質(zhì)組分析復(fù)雜性 蛋白質(zhì)有許多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化等； mRNA 的可變剪接、程序性移碼和可控突變，1個(gè) 基因可編碼許多不同的蛋白質(zhì)，常常表現(xiàn)為組織特 異性； 蛋白質(zhì)之間存在大量的相互作用，如形成同源或異 源二聚體、三聚體或多聚體，不同的結(jié)合狀態(tài)有不 同的活性； 1種蛋白質(zhì)可參與多種反應(yīng)，或多種蛋白質(zhì)參與1種 反應(yīng)。 蛋白質(zhì)組研究技術(shù) 蛋白質(zhì)組主要研究技術(shù)： 雙向電泳 生物質(zhì)譜技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片 酵母雙雜交 雙向凝膠電泳 樣品制備（包括蛋白質(zhì)的溶解、變性 及還原，從而去除非蛋白質(zhì)雜質(zhì)等） 第一向等電聚焦（根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異 進(jìn)行分離） 第二向SDS-PAGE（以蛋白 質(zhì)分子量差異為基礎(chǔ)）蛋白質(zhì)的檢測 （用考馬斯亮藍(lán)、銀染、銅染等方法） 圖譜數(shù)字化分析（圖象掃描、確定每 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和分子量，尋找差 異蛋白） 雙向電泳圖雙向電泳圖 質(zhì)譜技術(shù)的基本原理： 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)核 比（m/z）的差異來分離并確定分子量。 質(zhì)譜儀組成： 進(jìn)樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子 檢測器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。 質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組研究中的應(yīng)用： A 肽質(zhì)譜和肽序列分析 蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳后，分離到的蛋白 質(zhì)被切割下來，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，或轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，進(jìn)行膜上膜解，然后上樣進(jìn) 行測序。 但目前質(zhì)譜法還不能夠取代Edman降 解法測序，可是其測定速度較快。 B 鑒定翻譯后修飾的蛋白質(zhì) 質(zhì)譜可通過特征離子監(jiān)測的方法很快確定磷 酸化肽，通過串聯(lián)質(zhì)譜確定磷酸化位點(diǎn)； 質(zhì)譜可與蛋白酶解和糖苷酶酶解結(jié)合，尋找糖 肽，鑒定糖基化位點(diǎn)； 質(zhì)譜還參與糖鏈組成、結(jié)構(gòu)甚至分支情況等的 分析。 C 質(zhì)譜技術(shù)的其他作用 質(zhì)譜可對(duì)蛋白質(zhì)二硫鍵進(jìn)行定量和定位 ，分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，蛋白 質(zhì)與其他分子的相互作用，以及蛋白質(zhì)的 二級(jí)結(jié)構(gòu)等。 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的建立和生物信息學(xué) 數(shù)據(jù)庫的建立是蛋白質(zhì)組研究的最重要的一 個(gè)方面。 蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫包括： 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫 有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用 蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是蛋白質(zhì)的遺傳學(xué). 除 了發(fā)生突變, 基因組結(jié)構(gòu)保持不變, 但是蛋白卻 由于細(xì)胞種類及環(huán)境的不同，動(dòng)態(tài)表達(dá)為不同 結(jié)構(gòu). 雖然只有部分DNA遺傳信息通過mRNA 被轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)合成過程中, 但事實(shí)上細(xì)胞活 動(dòng)是在蛋白水平上進(jìn)行的. 所以蛋白質(zhì)組學(xué)與 基因組學(xué)同等重要, 甚至更為重要. 盡管重要, 與DNA能夠識(shí)別互補(bǔ)序列而形成雙螺旋鏈并通 過PCR技術(shù)擴(kuò)增相比, 蛋白質(zhì)不能由序列選擇性 合成和被周圍環(huán)境修正, 蛋白質(zhì)組學(xué)剛剛起步. 最終目標(biāo)將是代謝物組(matabolome)或生理組 (physiolome)的靶物, 用以研究蛋白質(zhì)的真正意 義, 但是現(xiàn)在研究還僅停留在觀測蛋白質(zhì)是否 被表達(dá)的階段. 蛋白質(zhì)組 HIV蛋白質(zhì)組示圖 蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線 證實(shí)并克隆差異表達(dá)基因 大致可分為以下4類: 以DDPCR(differential display)為代表,包括以隨機(jī) 引物PCR為基礎(chǔ)的mRNA指紋法(arbitrarilyrimed PCR finger- printing of RNA) 差減克隆(subtractive cloning )和正性選擇 (positive sele- ction) 將差異顯示及差減結(jié)合起來的方法 充分利用人類及模式生物基因組已有信息的方法 基因表達(dá)的系列分析(serial analysis of gene expressing,SAGE) cDNA微點(diǎn)陣法(cDNA microarrays) 綜合性基因鑒定程序(integrated procedure for gene identification,IPGI) 差異顯示 差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR法（DDRT-PCR) RNA指紋法RNA Fingerprinting 基因組表達(dá)及調(diào)控的研究 在全細(xì)胞的水平，識(shí)別所有基因組表達(dá)產(chǎn)物： mRNA： c DNA 陣列 蛋白質(zhì)：二維電泳 質(zhì)譜 研究生物大分子相互作用： 闡明基因組表達(dá)在發(fā)育過程中的時(shí)空整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 蛋白質(zhì)組學(xué)： 高通量解析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是連接基因組功能研究和新 藥開發(fā)的橋梁。 基因芯片技術(shù)及應(yīng)用 又稱基因微陣列技術(shù),是指將大量(通常每cm2點(diǎn)陣密度 高于400)基因探針分子固定于載體(玻片或薄膜后)與標(biāo) 記的樣品分子(mRNA、cDNA、基因組DNA等)進(jìn)行雜 交,通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣 品分子數(shù)量和序列信息.該技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可以一次 性對(duì)大量樣品序列進(jìn)行檢測和分析,從而解決了傳統(tǒng)核 酸印跡雜交(southern blotting和nort