生化課件11 rna生物合成

1、RNA生物合成RNA BIOSYNTHESIS第十一章CHAPTER 11RNA種類及作用rRNAs (Ribosomal RNAs)75-80%：以白體的形式參與蛋白質(zhì)生物合成，是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所tRNAs（Transfer RNAs) 10-25%：在蛋白質(zhì)生物合成過程中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸mRNAs(Messenger RNAs) 2-3%：作為蛋白質(zhì)合成的直接模板hnRNAs（heterogeneous nuclear RNAs）mRNA的未成熟前體snmRNAs（small non-messenger RNA）snRNA, siRNA，miRNA參與RNA前體的加工及基因表達(dá)調(diào)控2RNA生物合

2、成轉(zhuǎn)錄（Transcription）: DNA指導(dǎo)的 RNA合成轉(zhuǎn)錄加工DNARNA前體成熟RNARNA復(fù)制（RNA replication）: RNA指導(dǎo)的 RNA合成3DNA復(fù)制RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNA蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)錄第一節(jié)Section 1轉(zhuǎn)錄作用Transcription轉(zhuǎn)錄作用（ DNA-dependent RNA synthesis ）在RNA聚合酶催化下，以DNA為模板，以4種三磷酸核苷（ATP, GTP, CTP, UTP） 為原料進(jìn)行的RNA聚合反應(yīng)。TranscriptionDNARNA4第一節(jié)轉(zhuǎn)錄體系參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)模板:DNA酶:RNA聚合酶 (RNA polymera

3、se, RNA-pol)原料:NTP (ATP, GTP, CTP, UTP)無機(jī)離子：Mg2，Mn2其他蛋白質(zhì)因子5一、轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA與RNA的堿基配對(duì)規(guī)律：DNA AGCTRNA UCGA堿基配對(duì)的穩(wěn)定性G/C A/T A/U6兩條鏈都是模板嗎？DNA復(fù)制：全程復(fù)制轉(zhuǎn)錄：有選擇性7不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄（asymmetric transcription）DN段轉(zhuǎn)錄時(shí)，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，這種轉(zhuǎn)錄方式稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄8模板鏈（ template strand）編碼鏈（coding strand）coding strandDouble strand of DNA5TCAGCTCGCT

4、GCTAATGGCC33AGTCGAGCGACGATTACCGG5template strandtranscription5UCAGCUCGCUGCUAAUGGCC3RNA transcript95 .GCA GTA CAT GTC. 3編碼鏈DNA3 . c g tc a tg t ac a g. 5 模板鏈轉(zhuǎn)錄5. GCA GUA CAU GUC. 3翻譯mRNA蛋白質(zhì)N . Ala .Val.His.Val.CDNA模板、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA和氨基酸序列之間的關(guān)系10編碼鏈和模板鏈?zhǔn)且粋€(gè)相對(duì)的概念：結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向基因A5335基因B轉(zhuǎn)錄方向RNA轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性11編碼鏈模板鏈模板鏈編碼鏈不

5、對(duì)稱轉(zhuǎn)錄的含義： 在DNA雙鏈上，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。12轉(zhuǎn)錄模板的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（一）轉(zhuǎn)錄單位：轉(zhuǎn)錄分區(qū)段進(jìn)行，能夠連續(xù)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的一個(gè)DN段稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位Gene CGene DGene AGene BDouble stand DNACoding strandTemplate strand13（二）轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(start site)以+1表示，一般為A或G上游(upstream):從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄方向的區(qū)域，用負(fù)號(hào)（-）表示下游(downstream):從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)順轉(zhuǎn)錄方向的區(qū)域，用正號(hào)（+）表示53上游1下游14DNA（三）與轉(zhuǎn)錄起始和終止有關(guān)的DN

6、A結(jié)構(gòu)1、啟動(dòng)子(promoter)：是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的一段DNA序列，是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合部位。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用。調(diào)控序列1 結(jié)構(gòu)基因533515RNA-polRNA聚合酶保護(hù)區(qū)5結(jié)構(gòu)基因3535 3 3 5 -50-40-30-20-10110開始轉(zhuǎn)錄-35 區(qū)-10 區(qū)RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognition site)(Pribnow box)結(jié)合部位 原核生物啟動(dòng)子保守序列16T A T A A T Pu A T A T T A PyT T G A C A A A C T G T被RNA聚合酶保護(hù)的DNA區(qū)段堿基序列分析17-35區(qū)-10區(qū)+1trpT T G

7、 A C AN17T T A A C T N7 A tRNAtrpT T T A C AN16 T A T G A T N7 A LacT T T A C AN17T A T G T T N6 ArecAT T G A T AN16T A T A A T N7 AaraC T G A C GN18T A C T G T N6 A最大一致性 T T G A C AT A T A A Tx/4538 36 2940 25 30373728412944真核生物的啟動(dòng)子真核生物的三種RNA聚合酶，每一種都有自己的啟動(dòng)子類型。RNA聚合酶的啟動(dòng)子即 mRNA基因的啟動(dòng)子，稱類啟動(dòng)子18順式作用元件 (c

8、is-acting element)結(jié)構(gòu)基因-GCGC-CAAT-TATA轉(zhuǎn)錄起始增強(qiáng)子TATA盒CAAT盒GC盒19 真核生物啟動(dòng)子保守序列2、終止信號(hào)（stop signal）：在基因單位中，具有停止轉(zhuǎn)錄作用的部位, 包括GC富集區(qū)和AT富集區(qū), 也稱終止子。(terminator)20二 RNA聚合酶RNA polymerase全稱：依賴DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase）簡(jiǎn)稱： RNA polDNARNA polRNA21The discovery of prokaryotic RNA polymerasesArthur KornbergSe

9、vero OchoaNobel Prize in Physiology or Medicine 195922for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid（一）原核生物RNA聚合酶結(jié)構(gòu):bbbbsaaaa核心酶 （core enzyme）a2bb全酶 （holoenzyme）a2bbs23原核RNA 聚合酶各亞基的作用亞基 分子量亞基數(shù)功能3651215061821決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄催化RNA鏈延伸結(jié)合DNA模板1556

10、131100070263111功能不明辨認(rèn)起始點(diǎn)（轉(zhuǎn)錄起始后脫落）24RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合的存在保證原核生物RNA聚合酶只能與啟動(dòng)子區(qū)而不是其它區(qū)域形成穩(wěn)定的二元復(fù)合物。25原核RNA聚合酶具有多種功能baTTGACA+20+1sab-35ds DNA1. 識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)2. 促使DNA雙鏈打開17bp3. 催化NTP以3,5磷酸二酯鍵相連，方向534. 識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)26原核RNA聚合酶作用特點(diǎn)：1. 聚合速率慢，3085 nt/s（DNA合成250-1000nt/s）2. 缺乏3 5外切酶活性，無校對(duì)功能，錯(cuò)誤率高（10-4 10-5 ，DNA合成錯(cuò)誤率10-9 10-10

11、 ）3.不同的s識(shí)別不同的啟動(dòng)子4. 活性可被利福霉素抑制（與b亞基結(jié)合）利福霉素抗結(jié)核27（二）真核生物的RNA聚合酶種類定位核仁核質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物45s-rRNA耐受hnRNA極敏感5s-rRNA,tRNA,snRNA中度敏感對(duì)鵝膏蕈堿反應(yīng)5.8SrRNA18SrRNA28SrRNAtRNA 5SrRNAsnRNAmRNA最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物28Nobel Prize in Chemistry 2006Father and SonRoger D. Kornberg29For his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription第

12、二節(jié)轉(zhuǎn)錄過程Section 2Transcription Process一二原核生物的轉(zhuǎn)錄過程真核生物的轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄過程可以分為三個(gè)階段：1. 轉(zhuǎn)錄起始（ Initiation）2. 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)（Elongation）3. 轉(zhuǎn)錄終止（Termination）30一原核生物的轉(zhuǎn)錄過程1. 轉(zhuǎn)錄起始（ Initiation）?轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問題RNA聚合酶必須準(zhǔn)確結(jié)合轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板31 轉(zhuǎn)錄起始過程RNA聚合酶-識(shí)別DNA啟動(dòng)子(35區(qū))核心酶與啟動(dòng)子結(jié)合(10區(qū))DNA構(gòu)象改變，啟動(dòng)子10區(qū)處打開雙鏈DNA分子（約17bp)DNA構(gòu)象改變，啟動(dòng)子

13、10區(qū)處打開雙鏈DNA分子（約17bp)轉(zhuǎn)錄開始，形成第一個(gè)3,5磷酸二酯鍵（不需引物）o （循環(huán)使用）核心酶沿模板向下游移動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始特點(diǎn)：1、轉(zhuǎn)錄不需要引物，RNA聚合酶結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始部位可直接合成RNA。2、RNA聚合酶可擠入DNA雙鏈間，不需其它酶來解旋、解鏈。3、因子必須脫落，否則核心酶不滑動(dòng)，RNA鏈不能延長(zhǎng)。342. 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)（Elongation）核心酶沿DNA模板鏈向下游方向滑動(dòng)NTP以3,5-磷酸二酯鍵逐個(gè)相連形成RNA鏈，方向53RNA鏈延長(zhǎng)，暫時(shí)形成DNARNA雜交體（約8bp）RNA逐步脫離模板鏈35核心酶滑過的部位，DNA鏈很快恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄泡 (transcri

14、ption bubble)由DNA雙鏈（打開約17bp）,RNA聚合酶與新合成的RNA鏈局部形成的結(jié)構(gòu).36 原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象3537RNA核糖體RNA聚合酶DNA3. 轉(zhuǎn)錄終止（ Termination ）核心酶遇到DNA模板的終止信號(hào)核心酶不能繼續(xù)滑動(dòng)核心酶從模板DNA上脫落新合成的RNA鏈脫落，轉(zhuǎn)錄終止38終止信號(hào)（stop signal）：在基因單位中，具有停止轉(zhuǎn)錄作用的部位, 包括GC富集區(qū)和AT富集區(qū), 也稱終止子。(terminator)原核轉(zhuǎn)錄終止方式：u 不依賴因子u 依賴因子39u兩類終止子有共同的序列特征：在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段間斷的回文結(jié)構(gòu)。u兩類終止子堿

15、基組成的不同點(diǎn)：不依賴因子依賴因子回文結(jié)構(gòu)富含G-CG-C含量較少下游富含A-T下游無特征40u 不依賴因子的終止子轉(zhuǎn)錄方向模板鏈5DNA3TCGGGCG AGCCCGCCGCCCGA GCGGGCTAAAAAA TTT TTT53編碼鏈模板鏈AAAAAA 53DNAUUUUUU 3TTTTTT53編碼鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物541CGCCCGA GCGGGCUu依賴因子的終止子模板鏈5DNA3TAAGTAG ATTCATCCTACTTA GATGAATAGCTAC TCGATG53編碼鏈模板鏈AGCTAC 53DNAUCGAUG3TCGATG53編碼鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物542CUACUUA GAUGAAU轉(zhuǎn)錄方向r

16、因子（6聚體蛋白質(zhì)）：輔助識(shí)別終止信號(hào)誘使RNA聚合酶構(gòu)象改變具有解螺旋酶活性，釋放RNA產(chǎn)物43原核生物轉(zhuǎn)錄過程多順反子(Polycistronic )：一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA，編碼多條多肽鏈45二真核生物的轉(zhuǎn)錄過程1. 轉(zhuǎn)錄起始（ Initiation）起始過程比原核生物復(fù)雜上游調(diào)控序列復(fù)雜啟動(dòng)子Promoter增強(qiáng)子Enhancer、靜息子Silencer等RNA聚合酶不直接與模板結(jié)合轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物pre-initiation complex, PIC需多種轉(zhuǎn)錄因子參與46轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游區(qū)段順式作用元件(cis-acting element)調(diào)節(jié)表達(dá)基礎(chǔ)表達(dá)（啟動(dòng)子） 轉(zhuǎn)錄起

17、始點(diǎn)編碼鏈其他調(diào)節(jié)元件增強(qiáng)子（+） 靜息子（-）CCAATTATA535基因轉(zhuǎn)錄區(qū)3+1-40 -110-25模板鏈基因調(diào)控區(qū)mRNA47反式作用因子（trans-acting factor）能直接或間接識(shí)別和結(jié)合順式作用元件的蛋白質(zhì)，叫反式作用因子，也叫轉(zhuǎn)錄因子（ transcriptional factor, TF)；其中直接或間接結(jié)合RNA聚合酶，為PIC 裝配所必需的，又叫通用轉(zhuǎn)錄因子（general TF)，或基本轉(zhuǎn)錄因子（basal TF)。48由RNA-Pol 催化轉(zhuǎn)錄的PICEHD-TBP DTAF BTATACTD-PATFD-A-B-DNA復(fù)合物PIC組裝完成，TFH使CT

18、D磷酸化 (CTD: RNA pol II大亞基carboxyl-terminal domain)49TFIIH具有蛋白激酶活性RNA-pol II大亞基CTD磷酸化RNA 聚合酶向下游移動(dòng)轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)502. 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)（Elongation）真核生物RNA-pol前移會(huì)遇上核小體核小體解聚和移位現(xiàn)象核小體RNA-Pol轉(zhuǎn)錄方向RNA-PolRNA-Pol51（三）轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。mRNAAAAAAAA 33加尾核酸酶5335RNA-polAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)52單順反子(monocistronic),一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA，編碼一條多肽鏈。53第三節(jié)

19、轉(zhuǎn)錄后的加工過程Section 3RNA Processing將轉(zhuǎn)錄生成的前體RNA轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓?、有活性的RNA的過程主要加工方式：剪切(cleavage)和剪接(splicing)末端添加(terminal addition)核苷酸化學(xué)修飾(modification)RNA編輯(RNA editing)54 mRNA前體的加工Processing of mRNAs Precursor（一）mRNA生成特點(diǎn)（原核&真核）原核生物：多順反子mRNA (polycistronic mRNA)沒有核膜，轉(zhuǎn)錄和翻譯同時(shí)進(jìn)行不需復(fù)雜加工就表現(xiàn)出生物活性真核生物：?jiǎn)雾樂醋觤RNA (monocistron

20、ic mRNA)轉(zhuǎn)錄生成的是mRNA前體hnRNA 需要在細(xì)胞核加工成成熟的mRNA55（二）真核生物mRNA前體的加工5末端加帽(5 cap)3末端加尾(3 polyA tail)剪接作用甲基化修飾核苷酸編輯565末端帽子的結(jié)構(gòu):m7GpppNmp-7甲基鳥嘌呤7methyl guanylate5 5的連接5 to 5 linkage核糖2位羥基甲基化methylation of 2 carbon575末端帽子的生成:5 pppNp G/A 磷酸酶Pi5 ppNppppG鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶ppi5 GpppNpCH3-甲基轉(zhuǎn)移酶5 m7GpppNmp58CH35末端帽子的功能:m7GpppNmp-

21、保護(hù)新合成的mRNA免被降解參與第一個(gè)內(nèi)含子的剪接協(xié)助mRNA轉(zhuǎn)移至胞漿協(xié)助mRNA在核糖體的準(zhǔn)確定位593末端多聚A“尾”的生成3 polyadenylation G-T rich60轉(zhuǎn)錄終止修飾點(diǎn)3末端加多聚A“尾”：多聚A聚合酶RNA nATPRNA(AMP)n+nPPi功能：增加mRNA的穩(wěn)定性參與最后一個(gè)內(nèi)含子的剪接61（三）mRNA的剪接（mRNA splicing） 除去hnRNA中的內(nèi)含子，連接外顯子。美國(guó)科學(xué)家，因發(fā)現(xiàn)mRNA的剪接于1993年獲諾貝爾獎(jiǎng)62英國(guó)科學(xué)家，因發(fā)現(xiàn)斷裂基因于1993年獲諾貝爾獎(jiǎng)?wù)婧松锏幕蚴且环N斷裂基因，由編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成。外顯子與內(nèi)含子相間

22、排列Exon1Intron1Exon2Intron2Exon3DNAmRNA蛋白質(zhì)63外顯子(exon) ：在斷裂基因及初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子(intron) ：隔斷基因的線性表達(dá)，在剪接過程中被去除的核酸序列。轉(zhuǎn)錄加工DNAhnRNA(內(nèi)含子、外顯子)mRNA(只有外顯子)(結(jié)構(gòu)基因)Exon1Intron1Exon2Intron2Exon3DNAmRNA蛋白質(zhì)64剪接作用（mRNA splicing）剪切hnRNA中內(nèi)含子序列，將各外顯子序列連接為成熟mRNA的過程。剪接部位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：內(nèi)含子5端剪切點(diǎn)序列為： GU內(nèi)含子3端剪切點(diǎn)序列為: AG內(nèi)含子3端

23、剪切點(diǎn)上游附近A序列分支點(diǎn)5 Splice siteBranch site3 Splice siteUpstream exon AGGUAAGUA( Py)nNCAGG Downstream exon6566剪接原理: 套索(lariat)的形成及剪除67套索(lariat)的形成及剪除剪接體參與mRNA前體的剪接（spliceosome）剪接體: UsnRNP與mRNA前體結(jié)合形成的復(fù)合物UsnRNPUridine-rich small nuclear ribonucleoproteinsnRNA白分類：U1，U2，U3,U4，U5，U668 雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工雞卵清蛋白基因

24、hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA69mRNADNA雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖70可變剪接（Alternate splicing of mRNA）同一個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，在不同組織中由于剪接作用的差異，可產(chǎn)生不同的成熟mRNA，導(dǎo)致翻譯生成不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。剪接1轉(zhuǎn)錄DNAhnRNAmRNA1mRNA271 Alternative processing of the calcitonin gene transcriptPoly A site4Poly A site61235Primary transcriptCleavage and polyadenylation Thy

25、roid Brain41234 poly A12356poly ASplicingSplicing1234poly A12356 poly ATranslation and posttranslational processingCalcitonin降鈣素CGRP降鈣素基因相關(guān)肽72RNA編輯（RNA editing）遺傳信息在RNA水平發(fā)生改變，由一個(gè)基因產(chǎn)生不止一種蛋白質(zhì)的加工方式。 核苷酸插入、刪除或替換脫氨UC73甲基化作用（Methylation）真核生物mRNA分子中含甲基化核苷酸hnRNA 5端帽子結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)分子含12個(gè)m6A甲基化位點(diǎn)需供體SAM和甲基轉(zhuǎn)移酶參與74二 tRN

26、A前體的加工Processing of tRNAs Precursor剪接和剪切3末端添加-CCA堿基修飾75剪切（cleavage）RNase P切除5端多余的核苷酸RNase D切除3端多余的核苷酸剪接（splicing）: 去除內(nèi)含子序列RNasePRNaseD763末端添加-CCA核苷酸轉(zhuǎn)移酶ATPADP77堿基修飾（1） 甲基化如：A AmG Gm（2） 還原反應(yīng)如：U DHU（3） 核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：U （4） 脫氨反應(yīng)（1）（2）（1）（3）（4）如：A I78三 rRNA前體的加工Processing of rRNAs PrecursorrRNA基因多拷貝，串聯(lián)在DNA分子中

27、細(xì)菌：5-10 拷貝果蠅：260 拷貝人：1100 拷貝剪接甲基化修飾79原核核糖體RNA的加工(一)Prokaryonic 30S rRNA precursor53P16S Pt P23SP5S Pt RNase 17S t 25S 5S t RNase 16SrRNA ttRNA 23SrRNA 5SrRNA ttRNA80(二) 真核核糖體RNA的加工45S pre-rRNA5S pre-rRNA41S pre-rRNA32S pre-rRNA20S pre-rRNA18S rRNA5.8S28S rRNA5S rRNA81methylation第三節(jié)Section3核酶RIBOZYME

28、S核酶ribozyme具有催化活性的RNA核糖核酸酶RNase水解核糖核酸鏈，化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)82核酶的發(fā)現(xiàn)S. Altman發(fā)現(xiàn)RNaseP 中的RNA可催化tRNA的加工 (1983)T.Cech等首先發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA前體具有自我剪接作用 (1982)1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)83核酶類型剪切型催化自身RNA或異體RNA分子剪去一段多核苷酸片段，功能類似于內(nèi)切核酸酶剪接型切去自身RNA內(nèi)部一段多核苷酸片段，再將剩余的兩個(gè)片段連接，功能類似于內(nèi)切核酸酶與連接酶的聯(lián)合作用其他類型84555G（鳥苷作為E輔助因子）126S rRNAOH414GOHIGOH3E23G399355L-19 IVS具有催化活性的片段39533四膜蟲rRNA 的自我剪接L-19 IVS 核