PCR檢測(cè)技術(shù)【行業(yè)精制】

1、PCR檢測(cè)技術(shù),1,專業(yè)分享,一、PCR的定義,PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱休外DNA擴(kuò)增技術(shù)。 近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。,2,專業(yè)分享,二、PCR技術(shù)的基本原理,1、 PCR原理 用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。 以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5末端和3末端互補(bǔ)的寡苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可目的DNA片段得到擴(kuò)增,3,專業(yè)分享,半保留復(fù)制,4,專業(yè)分享,2、三個(gè)基本的步驟循環(huán) 變性 加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈

2、。 退火 突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。 延伸 將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚會(huì)酶等作用下，重新結(jié)合形成與模板互補(bǔ)的新DNA鏈。,5,專業(yè)分享,上述3步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2540個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106109倍。,變性,延伸,退火,6,專業(yè)分享,三、PCR的基本操作,反應(yīng)體系的配制,標(biāo)本的制備,反應(yīng)條件的選擇與優(yōu)化,擴(kuò)增產(chǎn)物的分析,PCR技術(shù)路線/流程,7,專業(yè)分享,PCR實(shí)驗(yàn)室,505

3、試劑配制室； 506 標(biāo)本處理室； 507 擴(kuò)增室； 508 擴(kuò)增產(chǎn)物分析室。,8,專業(yè)分享,505 PCR配制室,該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。 試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。,9,專業(yè)分享,506 標(biāo)本處理室,主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。,1、在本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作，必須戴手套并經(jīng)常更換。 2、為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。 3、對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。 4、樣本處

4、理對(duì)核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。,10,專業(yè)分享,核酸提取方法,離心柱法全自動(dòng)核酸提取儀采用離心機(jī)和自動(dòng)移液裝置想結(jié)合的方法,1、離心柱法,11,專業(yè)分享,2、磁珠法,12,專業(yè)分享,607 PCR擴(kuò)增室,該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光PCR儀的結(jié)果判讀。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。,1、不能從本區(qū)再進(jìn)入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。 2、為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少走動(dòng)。,13,專業(yè)分享,PCR儀,14,專業(yè)分

5、享,15,專業(yè)分享,508 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析室,主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。,1、最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。 2、本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。 3、本區(qū)如采用負(fù)壓或減壓情況下可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。,16,專業(yè)分享,四、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。,17,專業(yè)分享,三個(gè)基本概念,1、擴(kuò)增曲線 2、熒光閾值 3、Ct值,擴(kuò)增曲線圖： 橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）； 縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集,18,專業(yè)分享,PCR污染與對(duì)策,污染原因,1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染 最主要最常見的污染問題。 2、標(biāo)本間交叉污染主要由于盛裝標(biāo)本的容器被污染 、加樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染 、有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染 。,19,專業(yè)分