除菌過濾驗(yàn)證—細(xì)菌截留試驗(yàn)

1、技術(shù)報(bào)告No. 26 (2008 修訂版),Celebrating over 65 Years of Connecting People, Science and RegulationSM,除菌過濾器的驗(yàn)證 細(xì)菌的截留 第6.0部分,液體的除菌過濾,第 6.0部分 除菌過濾器的驗(yàn)證 / 細(xì)菌的截留,6.1影響微生物截留的因素 6.2細(xì)菌截留驗(yàn)證研究需要考慮的方面 6.3挑戰(zhàn)細(xì)菌的選擇 6.4培養(yǎng)的保持 6.5培養(yǎng)條件和標(biāo)準(zhǔn) 6.6有效挑戰(zhàn)濃度 6.7挑戰(zhàn)水平 6.8聚集 6.9培養(yǎng)物的生存能力 6.10挑戰(zhàn)試驗(yàn)方法,6.11試驗(yàn)用微生物的生存能力 6.12 試驗(yàn)步驟和方案 6.13非殺菌過程和

2、液體 6.14替代液體 6.15殺菌液體 6.16過濾介質(zhì)vs.裝置 6.17壓力/流量 6.18持續(xù)時(shí)間 6.19下游取樣 6.20試驗(yàn)用膜的選擇 6.21結(jié)果的解釋 6.22產(chǎn)品的生物負(fù)荷 6.23過濾器構(gòu)造的改變,目 錄,除菌級(jí)性能的基本解釋,除菌過濾是在對產(chǎn)品沒有不良影響的前提下從流動(dòng)的液體中去除微生物的過程。 ASTMF 838-05 是一種標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)置TM，可以用于比較所有滅菌級(jí)的膜。 證明能去除一種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)細(xì)菌(Brevundimonas diminuta) 最低濃度為107 cfu/cm2 這是一個(gè)很好的開始，但是還要考慮其他因素,重要參考 ASTM F 838-05,ASTM

3、標(biāo)準(zhǔn) F838-05, “決定液體過濾器過濾膜細(xì)菌截留性能的標(biāo)準(zhǔn)測試方法”, 賓州Conshohocken美國測試和材料協(xié)會(huì) ASTM 委員會(huì) D19(2005) ,除菌級(jí)表現(xiàn)的基本定義,2008 版 TR 26 進(jìn)一步描述了過濾器驗(yàn)證需要考慮的方面除菌過濾器驗(yàn)證要考慮的兩個(gè)重要因素: 通過適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)或同等的方法進(jìn)行細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)來決定過濾器膜的級(jí)別。 由過濾器的使用者或指定的測試機(jī)構(gòu)（例如：過濾器生產(chǎn)商或契約實(shí)驗(yàn)室） 使用一種代表性的挑戰(zhàn)微生物證明能完全去除一種產(chǎn)品或一組產(chǎn)品上的細(xì)菌。 在進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)前，具有每組產(chǎn)品是按照適當(dāng)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的規(guī)定生產(chǎn)和檢驗(yàn)的科學(xué)依據(jù)。,挑

4、戰(zhàn)微生物的選擇,以前一直推薦用 Pseudomonas diminuta 作為驗(yàn)證0.22 m 除菌級(jí)過濾器的細(xì)菌之選。 Pseudomonas diminuta 最近基于DNA的相同性被重新劃分為Brevundimonas diminuta FDA并沒有統(tǒng)一推薦某種細(xì)菌用于細(xì)菌截留試驗(yàn) 細(xì)菌大小應(yīng)能通過 0.45 m 過濾器 其他符合要求的細(xì)菌也能被接受,時(shí)間,影響細(xì)菌截留的因素,微生物,大小,形狀,產(chǎn)品,pH,滲透壓,離子強(qiáng)度,表面活性劑,膜,孔徑分布,表面化學(xué)成分,微孔結(jié)構(gòu),P,流量,溫度,Section 6/6.1,產(chǎn)品,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,對過濾過程進(jìn)行詳盡的評(píng)估，包括： 溶

5、劑的性質(zhì) (如：水的，酸性的，堿性的, 有機(jī)的) 過濾時(shí)間 過程壓力 過程流量 過程溫度 過濾器設(shè)計(jì)說明 簽約細(xì)菌截留試驗(yàn)，三大廠家會(huì)給一個(gè)POP文件 Satorious的所有試驗(yàn)都在德國，millipore的析出物試驗(yàn)在美國。,Section 6.2,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,產(chǎn)品細(xì)菌截留驗(yàn)證研究應(yīng)該包括多個(gè)過濾膜 (通常三個(gè)) 。最接近泡點(diǎn)的過濾膜做這個(gè)試驗(yàn)。市場流通的過濾器基本泡點(diǎn)都會(huì)比較高 在產(chǎn)品可能對膜造成傷害的情況下，膜的確切數(shù)量和測試設(shè)計(jì)取決于過程。,Section 6.2,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,用于細(xì)菌截留驗(yàn)證試驗(yàn)的三個(gè)膜中至少有一個(gè)膜應(yīng)該在試驗(yàn)前或使用前物理完整性測試

6、數(shù)值達(dá)到或接近過濾器生產(chǎn)商的測試要求。 可能無法獲得達(dá)到或接近過濾器生產(chǎn)商要求的膜 在這種情況下，應(yīng)該從一批使用前完整性測試數(shù)值盡量低的膜產(chǎn)品中選取測試膜。 然后根據(jù)（驗(yàn)證研究中）使用前物理完整性測試數(shù)值最接近生產(chǎn)商要求的膜來確定一個(gè)特定過濾過程的完整性測試要求,Section 6.2,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,測試報(bào)告中應(yīng)該包括細(xì)菌截留驗(yàn)證研究中得到的膜物理完整性測試值。 應(yīng)在挑戰(zhàn)測試前使用水、產(chǎn)品或其他有說明的液體來確定物理完整性,Section 6.2,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,應(yīng)該在產(chǎn)品細(xì)菌挑戰(zhàn)后調(diào)查測試微生物是否在過濾器的下游重現(xiàn)。 如果調(diào)查確認(rèn)測試微生物穿過了過濾器，并且過濾器

7、達(dá)到了完整性測試要求 那么應(yīng)重新考慮該過濾器是否適合于這樣的過程條件。,Section 6.2,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,成分相同、只有濃度不同的系列產(chǎn)品可以通過挑戰(zhàn)極限濃度和接受中間一組濃度來驗(yàn)證。 如果某個(gè)單個(gè)產(chǎn)品被認(rèn)為是最差情況代表，則應(yīng)伴有依據(jù)和數(shù)據(jù)。,Section 6.2,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,一般來說重復(fù)使用過濾器是不實(shí)際的，或者說不建議用于制藥生產(chǎn) 但是如果重復(fù)使用除菌級(jí)過濾器 應(yīng)該給出理由，并且重復(fù)使用參數(shù)應(yīng)該經(jīng)過驗(yàn)證。,測試設(shè)計(jì)的兩種方法,1. 直接接種法 2. 修改法 有時(shí)被稱為: 間接法 兩步法 再循環(huán)法,1. 直接注入細(xì)菌法,直接接種測試,藥品,可存活 微生物

8、?,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,測試過濾器,泵,化驗(yàn)濾出液 的微生物,2. 間接法,藥品,可存活 微生物?,化驗(yàn)濾出液 的微生物,否,改變 產(chǎn)品/過程,預(yù)處理過濾器,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,泵,測試過濾器,抗生素 防腐劑 溫度 pH,1,2,預(yù)處理,時(shí)間 溫度 化學(xué)性質(zhì),壓力 流量,使過濾器暴露于實(shí)際的產(chǎn)品和過程條件中,抑制配方 預(yù)處理注入物,1,2,沖洗緩沖器: 去除過濾器的毒殺活動(dòng),維持全部 過程條件,驗(yàn)證此步驟 確保細(xì)菌活性,修改產(chǎn)品、過程的兩個(gè)例子,8 小時(shí)過程時(shí)間 殺菌產(chǎn)品,預(yù)處理8 小時(shí),修改過的產(chǎn)品 8小時(shí),預(yù)處理,截留測試,預(yù)處理4小時(shí),實(shí)際的產(chǎn)品

9、4小時(shí),沖洗,細(xì)菌截留研究的一般圖示,細(xì)菌截留研究的一般圖示,接種挑戰(zhàn)溶液的再循環(huán),研究設(shè)計(jì)決策樹,Validation Strategy Study Design,Validation Strategy Study Design,Ideal Method / Approach,Validation Strategy Study Design,Alternative Approach,Validation Strategy Study Design,挑戰(zhàn)微生物的選擇 - 1.,推薦選擇Brevundimonas diminuta 作為用于除菌級(jí)過濾器驗(yàn)證的微生物。 但是: 請明白FDA或其他法

10、規(guī)機(jī)構(gòu)并沒有推薦某一種微生物作為用于驗(yàn)證的唯一微生物。 微生物的尺寸應(yīng)小到能通過 0.45 m 的過濾器 其他符合要求的微生物也可以接受。 必須建立挑戰(zhàn)細(xì)菌符合要求的模型 必須清楚過程中的生物負(fù)荷對所選擇細(xì)菌的影響,挑戰(zhàn)微生物的選擇 - 2.,推薦選擇Brevundimonas diminuta 作為用于除菌級(jí)過濾器驗(yàn)證的微生物。 目前應(yīng)用的培養(yǎng)方法有兩種: 肉湯法 (Leahy and Sullivan, 1978) 凍膏法 (Fennington Jr. and Howard Jr., 1997) 兩者都符合現(xiàn)行工業(yè)標(biāo)準(zhǔn),有效挑戰(zhàn)濃度,過濾后應(yīng)該 過濾器測試膜每平方厘米表面達(dá)到至少107

11、個(gè)微生物 均勻分布于膜的表面是最理想的 挑戰(zhàn)濃度 (cfu/mL) 和挑戰(zhàn)水平 (cfu/cm2).是不同的，不可混淆,有效的挑戰(zhàn)水平,最低挑戰(zhàn)水平應(yīng)為每平方厘米膜表面至少 107 cfu B. diminuta (或生物負(fù)荷) 基于Bowman對0.45 m過濾器的觀察 Bowman et al., J. Pharm. Sci., 56: 222 (1967) 0.45 m 過濾器截留數(shù)量 104-106 cfu/cm2 檢查過大的孔 “除菌級(jí)”的定義,聚集,單分散性的細(xì)胞最適用于挑戰(zhàn) 用光學(xué)顯微鏡甄選菌株 使用超聲波/振動(dòng)使其散開 通過光學(xué)顯微鏡和存活計(jì)數(shù)予以確定 使用 0.45 m過濾器

12、作為過濾器挑戰(zhàn)測試中的陽性對照措施。,測試微生物的活性,確認(rèn)挑戰(zhàn)液體中微生物的活性 藥物產(chǎn)品或替代物 微生物必須在整個(gè)挑戰(zhàn)測試的過程中是存活的 如果損失了10倍的微生物，可能就不適合采用直接接種法來進(jìn)行挑戰(zhàn)測試。 挑戰(zhàn)前后確定活性 使用可接受的微生物學(xué)方法，如 標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)，用于上游分析 方法必須經(jīng)過驗(yàn)證 (暗示) 使用相同的培養(yǎng)基分析濾出液中細(xì)菌存在的情況。 Section 6.9/6.11,抑菌/殺菌/非分散溶液,由于直接接種法是理想的 由于測試微生物活性的一些問題，一個(gè)成功的測試計(jì)劃可能需要改變 挑戰(zhàn)液體 挑戰(zhàn)條件 或兩者兼有 可能需要預(yù)處理過濾器 文件給出了定義毒性水平的指南,2. 直

13、接法,可存活的 微生物?,否,改變 產(chǎn)品/過程,預(yù)處理過濾器,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,泵,測試過濾器,抗生素 防腐劑 溫度 pH,1,2,藥品,化驗(yàn)濾出液 中的微生物,產(chǎn)品或過程的改變:抑菌/殺菌溶液,概述 決策過程一般不能被很好地理解。 圖2 給出了大概的指南 首選始終是直接接種法。 第二個(gè)選擇是改變產(chǎn)品/過程。 預(yù)處理過濾器需要與改變產(chǎn)品/過程結(jié)合起來進(jìn)行。 文件提供了關(guān)于定義毒性水平的指南 (毒性大于 1 log) 文件沒有試圖把改變產(chǎn)品或程序的方法區(qū)分優(yōu)先次序 必須科學(xué)地使決策合理化。,Section 6.15,壓差和流量,應(yīng)包括最大過程條件 達(dá)到或超過已知壓差 達(dá)到或

14、超過已知流量 也許不能在小范圍內(nèi)同時(shí)模擬兩者。 使用者決定哪個(gè)與特定的過程更相關(guān) 建立支持決策的理由,Section 6.17,化驗(yàn)和結(jié)果解釋,可以用0.45 或 0.22 m過濾器從濾出液中回收微生物。 所有的濾出液必須經(jīng)過化驗(yàn) 要認(rèn)為一個(gè)過濾器對于某個(gè)過程來說是滅菌級(jí)別: 測試過濾器不能允許任何微生物通過 所有的陽性和陰性對照措施必須是有效的。 為確定微生物穿過了過濾器而進(jìn)行重復(fù)測試是允許的,產(chǎn)品的生物負(fù)荷,產(chǎn)品的生物負(fù)荷必須經(jīng) 辨認(rèn) 確定特征 確定數(shù)量 過濾器生物負(fù)荷(即挑戰(zhàn)水平)的計(jì)算 過濾器生物負(fù)荷=BV/A，那么 B = 微生物計(jì)數(shù) (cfu/mL) V = 總體積 (ml) A

15、= 過濾器總表面積 (cm2) 過濾器生物負(fù)荷單位是cfu/cm2 允許使用者拿生產(chǎn)過濾器生物負(fù)荷與標(biāo)準(zhǔn)挑戰(zhàn)測試生物負(fù)荷（107 cfu/cm2)相比較。 Section 6.22,設(shè)備測試的原理： 評(píng)估過濾器裝置的完整性,要考慮到生產(chǎn)出來的裝置可能沒有截留作用 膜未封閉好 膜遭到了破壞 構(gòu)件相交之處膜有缺陷 要考慮到不能依賴完整性測試檢查出設(shè)備在生產(chǎn)過程中形成的缺陷。,濾介體 vs. 裝置,選擇膜盤還是裝置取決于驗(yàn)證操作的目的 如果目的是驗(yàn)證膜的截留性能，那么使用膜盤進(jìn)行縮小比例試驗(yàn) 完整性測試的方法必須有意義: 如: 建立泡點(diǎn)和擴(kuò)散流之間的關(guān)系 膜的完整性在安放膜的時(shí)候得以建立，在裝置測試

16、中得以確認(rèn)。,擴(kuò)大試驗(yàn):濾介體 vs. 裝置,膜盤是適用于驗(yàn)證過程過濾裝置某些特征的一種模型。 過濾裝置必須經(jīng)過驗(yàn)證才能應(yīng)用于生產(chǎn)過程中。,Section 6.16,盤測試的原因: 確保過濾裝置完整性,過濾器最初的和過程中的完整性通過以下手段得以充分保證 證明過濾器與過程相匹配的充分研究 過濾器生產(chǎn)商質(zhì)量系統(tǒng)審查 經(jīng)驗(yàn)證的完整性測試 于過濾器使用前后恰當(dāng)?shù)貓?zhí)行,壓差和流量,應(yīng)包括最大過程條件 達(dá)到或超過已知壓差 達(dá)到或超過已知流量 也許不能在小范圍內(nèi)同時(shí)模擬兩者。 使用者決定哪個(gè)與特定的過程更相關(guān) 建立支持決策的理由,化驗(yàn)?zāi)さ倪x擇,通常兩者均可 0.45 m 或 0.22 m 用額定的分析過濾

17、器回收測試微生物 一篇發(fā)表的論文支持使用0.45 m過濾器(J. Carter, PDA-JPST, Volume 50, No.3, 1996) 化驗(yàn)過濾器的選擇應(yīng)該經(jīng)過驗(yàn)證,產(chǎn)品生物負(fù)荷,驗(yàn)證設(shè)計(jì)必須考慮最初的生物負(fù)荷 辨認(rèn) 確定特征 確定數(shù)量 過濾器生物負(fù)荷的計(jì)算 B = BV/A 在這里 B = 微生物計(jì)數(shù) (cfu/mL) V = 總體積 (mL) A = 過濾器總表面積 (cm2) 使用B. diminuta假定用過濾的方法去除自然生物負(fù)荷微生物更難。,area,生物負(fù)荷,Brevundimonas diminuta 對比自然生物負(fù)荷試驗(yàn),標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法 (ASTM) 小細(xì)胞 單分散性的細(xì)胞 歷史上,需要培養(yǎng)方法 培養(yǎng)的效果? 需要大小分析法 沒有工業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 安全事宜 生物負(fù)荷何時(shí)變化?,B. diminuta,將 B. diminuta 與自然生物負(fù)荷微生物相比較?,培養(yǎng)方法的建立 微生物大小的確定 光學(xué)顯微鏡 掃描電子顯微鏡 同時(shí)測量生物負(fù)荷微生物和B. diminuta 過濾性研究 使用0.45 m 膜盤 同時(shí)測量生物負(fù)荷微生物和B. diminuta的截留情況,自然生物負(fù)荷微生物,知道生物負(fù)荷情況 質(zhì)量上 數(shù)量上 考慮對B. diminuta有殺菌/抑菌作用的產(chǎn)品。 所選的微生物必須能在實(shí)際測試產(chǎn)品中生存。 必須能繁殖到足以提供107cf