Pcr-商業(yè)計(jì)劃書

1、傲立昂生物技術(shù)有限公司Orionis BioTek Corporation商業(yè)計(jì)劃書聯(lián) 系 人：劉 暢聯(lián)系電話：0871傳 真：0871電子郵件：地 址： 中國云南 昆明市 滇池路陽光花園昊苑51101保密承諾本商業(yè)計(jì)劃書內(nèi)容屬商業(yè)秘密，所有權(quán)屬于傲立昂生物技術(shù)有限公司。其所涉及的內(nèi)容和資料僅對有意向的投資人公開，本公司要求有意向的投資人收到本計(jì)劃書時做如下承諾：妥善保管本商業(yè)計(jì)劃書，未經(jīng)本公司同意，不得向第三方公開商業(yè)計(jì)劃書所涉及的公司商業(yè)秘密，亦不得作為案例等用于教學(xué)，若收件人不希望涉足本計(jì)劃所述項(xiàng)目，請與指定聯(lián)系人聯(lián)系并

2、將本計(jì)劃書完整退回，并不得將本計(jì)劃書全部和/或部分地予以復(fù)制、傳遞給他人、影印、泄露或散布給他人，否則應(yīng)承擔(dān)相應(yīng)法律責(zé)任。授 方：傲立昂生物技術(shù)有限公司收件方：收件人簽字： 日 期：2003-07- 目錄綜述第一部分： 公司介紹第二部分： 董事會及管理團(tuán)隊(duì)第三部分： 產(chǎn)品及技術(shù)優(yōu)勢第四部分： 行業(yè)及市場分析第五部分： 商業(yè)模式及贏利預(yù)測第六部分：合作方式及資金需求第七部分：風(fēng)險控制綜述位於美國硅谷的傲立昂生物技術(shù)公司于2002年發(fā)明了這項(xiàng)迄今為止最先進(jìn)的核酸診斷技術(shù)，高效定量(CAD)PCR技術(shù)。傲立昂公司已在世界主要國家為該技術(shù)申請了專利。與目前市場上最好的同類技術(shù)，熒光(TaqMan)PC

3、R相比，高效定量(CAD)PCR在保真度，準(zhǔn)確度，靈敏度及降低經(jīng)濟(jì)成本諸方面都有顯著提高。高效定量(CAD)PCR技術(shù)已經(jīng)在檢測人類基因這一最復(fù)雜DNA序列實(shí)驗(yàn)中取得了成功，因此，這一成熟的高技術(shù)平臺可以很方便地應(yīng)用到在臨床診斷及其他檢測領(lǐng)域。許多嚴(yán)重的傳染病，如SARS，艾滋病，乙型肝炎，丙型肝炎等，都是高效定量(CAD)PCR技術(shù)應(yīng)用的理想對象。高效定量(CAD)PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，除了能提高診斷精度，縮短診斷時間，減少患者痛苦外，還能極大地降低整體治療成本，從而帶來巨大的商業(yè)利潤。傲立昂公司現(xiàn)正在中國積極尋找合作伙伴，共同將高效定量(CAD)PCR這一成熟的平臺技術(shù)盡快進(jìn)入批量生產(chǎn)階段

4、，早日投入中國臨床診斷市場。傲立昂公司愿意通過成立合資公司的方式，與中方伙伴建立誠信合作。產(chǎn)品開發(fā)過程可以分成多個步驟，每一步驟均可產(chǎn)生獨(dú)立成果，資金逐次投入，以降低風(fēng)險。根據(jù)初步測算，此項(xiàng)目若開發(fā)成功，第一年即可產(chǎn)生上億元的銷售額，利潤率可達(dá)30%，是極有吸引力的項(xiàng)目。第一部分 公司介紹1.1.公司簡介總部位于美國硅谷的傲立昂生物技術(shù)有限公司是一個處於創(chuàng)業(yè)初期的小型生物技術(shù)研發(fā)公司。公司主要經(jīng)營方向?yàn)楹怂釞z測相關(guān)技術(shù)及產(chǎn)品的研究與開發(fā)；特異性大分子合成；兼營各種專利制藥及生物技術(shù)產(chǎn)品的技術(shù)轉(zhuǎn)讓、投資與合作的咨詢服務(wù)等。公司成功地開發(fā)出代表當(dāng)今世界最高水平的高效定量(CAD)PCR技術(shù)，該技術(shù)

5、比目前國內(nèi)外最先進(jìn)最常用的熒光(TaqMan)PCR技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度，且制造工藝簡單，可以方便地應(yīng)用到各種疾病的早期檢測，并且在遺傳病普查，血源檢查，環(huán)保監(jiān)測及轉(zhuǎn)基因動植物檢出等方面，都有極為廣闊的應(yīng)用前景。1.2.宗旨本公司自成立之日起，便充分利用自身雄厚的技術(shù)優(yōu)勢，致力于最領(lǐng)先生物技術(shù)的研究與開發(fā)，并與數(shù)家主要跨國醫(yī)藥公司合作使產(chǎn)品迅速商業(yè)化，以獲得最佳的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。以中國大陸留美學(xué)者為主組建的傲立昂生物技術(shù)公司，始終密切關(guān)注祖國生物技術(shù)及制藥行業(yè)的發(fā)展，隨時愿意以我們的技術(shù)和商業(yè)優(yōu)勢，為提高中國人民的健康水平提供最高質(zhì)量的服務(wù)。為幫助中國抗擊SARS，公司投入了大量人

6、力物力，及早開發(fā)出了目前特異性最高的SARS檢測試劑，同時希望與中國同行合作，使之盡早投入臨床使用。除SARS外，艾滋病、乙肝、丙肝等疾病的診斷產(chǎn)品都已設(shè)計(jì)完成。1.3. 公司組織結(jié)構(gòu)尚處於創(chuàng)業(yè)初期的傲立昂生物技術(shù)公司，組織結(jié)構(gòu)簡單，只有研發(fā)部門和商業(yè)開發(fā)部門。位於硅谷的總部擁有現(xiàn)代化的實(shí)驗(yàn)室、科研設(shè)備及小樣生產(chǎn)能力，主要負(fù)責(zé)新產(chǎn)品的研究和技術(shù)開發(fā)。同時公司在東海岸的新澤西州開設(shè)了商務(wù)開發(fā)辦公室，為公司的成熟產(chǎn)品尋找理想的合作伙伴。新澤西州幾乎集中了全世界所有大型醫(yī)藥、檢測、醫(yī)療儀器及生物技術(shù)公司，是把生物高技術(shù)產(chǎn)品推向市場的最佳地區(qū)。為了與中國公司有效合作，公司正在考慮今年在中國開設(shè)一個分公

7、司。 第二部份公司董事會及管理團(tuán)隊(duì)2.1.董事會公司董事會由三人組成，畢萬里、史長平和朱晟，董事長為畢萬里。2.2. 管理團(tuán)隊(duì)公司目前雖然尚在初創(chuàng)階段，但已初步建成了一個由頂尖生物科學(xué)家、醫(yī)學(xué)專家和具有美國大型跨國醫(yī)藥公司商業(yè)運(yùn)作經(jīng)驗(yàn)的經(jīng)理人組成的精悍的核心團(tuán)隊(duì)。以此核心團(tuán)隊(duì)為主干，公司在美國生物、醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展建立了廣泛、牢固的專業(yè)聯(lián)系，為公司今后進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。2.3. 管理團(tuán)隊(duì)主要成員簡介畢萬里，男，畢業(yè)于北京大學(xué)生物系，于美國辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院獲博士學(xué)位，在國際生物學(xué)權(quán)威雜志發(fā)表論文二十余篇。后就職于美國大型醫(yī)療試劑、儀器公司，應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystem)公司，

8、任資深科學(xué)家多年，擁有多項(xiàng)與核酸檢測技術(shù)相關(guān)的高技術(shù)專利發(fā)明。作為高效定量(CAD)PCR技術(shù)的發(fā)明人，畢萬里博士創(chuàng)立了傲立昂生物技術(shù)公司，并專注于更新一代的核酸檢測技術(shù)的研發(fā)，已取得了突破性進(jìn)展，不久即將公布于世。史長平，畢業(yè)于北京大學(xué)生物系，于美國圖靈大學(xué)獲博士學(xué)位，并于加州大學(xué)舊金山分校修博士后。曾在美國大型醫(yī)療試劑、儀器公司，Chiron公司任資深科學(xué)家多年，精通特異性大分子合成的關(guān)鍵技術(shù)。后獨(dú)自創(chuàng)立了分子克隆藥廠這一生物技術(shù)公司，成為硅谷成功創(chuàng)業(yè)的范例。加盟傲立昂公司后，主要負(fù)責(zé)公司的大分子合成業(yè)務(wù)和日常管理。朱晟，畢業(yè)于北京大學(xué)生物系，并于美國印地安那大學(xué)獲MBA學(xué)位，主修金融與市

9、場營銷。曾任職于通用汽車公司、雅培大藥廠、法瑪西亞制藥公司等跨國公司，任商務(wù)開發(fā)資深經(jīng)理多年，熟諳歐美各國藥品、試劑、醫(yī)療儀器、營養(yǎng)品等的研發(fā)和營銷，有融資、談判、管理咨詢等方面的豐富經(jīng)驗(yàn)。目前主要負(fù)責(zé)公司新產(chǎn)品的商業(yè)開發(fā)。張暉南，畢業(yè)于北京醫(yī)學(xué)院(現(xiàn)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部)醫(yī)療系，在美國印地安那大學(xué)獲碩士學(xué)位及美國醫(yī)學(xué)博士。曾任職于雅培(Abbott)藥廠、法瑪西亞(Pharmacia)制藥公司、輝瑞(Pfizer)制藥廠、西爾金(Celgen)生物技術(shù)公司，任臨床實(shí)驗(yàn)和藥品安全資深科學(xué)家、經(jīng)理多年。目前主要負(fù)責(zé)公司的新產(chǎn)品的臨床實(shí)驗(yàn)和審批。第三部分：產(chǎn)品及技術(shù)優(yōu)勢高效定量(CAD)PCR是迄今為止

10、最先進(jìn)最方便的核酸檢測平臺技術(shù)，為有效闡述高效定量(CAD)PCR，首先從核酸檢測說起。3.1 核酸檢測技術(shù)3.1.1.核酸檢測技術(shù)的定義與功能核酸檢測技術(shù)是一種近十年來發(fā)展起來的全新的臨床檢測手段，通過檢測出病原體或其他生物某一特定基因序列(DNA或者RNA)，以確定該病原體或生物的存在。由於基因序列的物種特異性及高度穩(wěn)定性(尤以DNA為甚)，核酸檢測技術(shù)比傳統(tǒng)的免疫檢測技術(shù)具有不可比擬的準(zhǔn)確度和靈敏度。核酸檢測技術(shù)正在迅速取代免疫檢測技術(shù)。3.1.2. 核酸檢測技術(shù)的主要功能、用途. 精確測定出病源：凡基因序列被部分解碼的病源皆可用此法進(jìn)行檢測。目前已知的絕大多數(shù)疾病都在此范

11、疇。. 常見病、流行病的普查和預(yù)防：如非典、艾滋病等疾病，只有核酸檢測可以提供有效的早期檢測。目前應(yīng)用最廣的免疫檢測技術(shù)，免疫診斷所檢測的是人體內(nèi)的某種特殊抗體，此抗體是由病原體侵入人體，刺激人體免疫系統(tǒng)后所產(chǎn)生的抗體，一般在病原體侵入后的數(shù)天至兩周，因此免疫診斷無法用作早期檢測。. 致病遺傳基因的普查：只有核酸檢測能勝此任。在我國發(fā)病率高，危害性大的遺傳病有地中海貧血病等50余種，基因普查在我國尚屬空白，急待開發(fā)。. 血源檢查：在歐美發(fā)達(dá)國家，核酸檢測已列入對許多體液傳染病如艾滋病、乙肝、丙肝等獻(xiàn)血源的篩查，相信不久國內(nèi)亦會跟上。. 轉(zhuǎn)

12、基因動植物檢出：將保護(hù)中國不受轉(zhuǎn)基因動植物傾銷之害。. 個人基因圖譜檔案的建立：可對個人壽命、性格、行為、智力等因素有效預(yù)測。目前此類服務(wù)因價格昂貴，只能提供給少數(shù)富人，但隨著技術(shù)的不斷完善，必將會成為大多數(shù)健康人大消費(fèi)內(nèi)容?？傊怂釞z測已經(jīng)具有了極為廣闊的應(yīng)用前景，而且還會不斷開發(fā)出新的用途。3.1.3.核酸檢測技術(shù)的特點(diǎn)由於基因序列的物種特異性及高度穩(wěn)定性(尤以DNA為甚)，核酸檢測技術(shù)比傳統(tǒng)的免疫檢測技術(shù)具有不可比擬的準(zhǔn)確度和靈敏度，例如能夠檢測出取樣標(biāo)本中的單個病原體，是疾病傳染早期唯一有效的檢測方法，對於象非典這種尚無有效治療手段且傳染性極強(qiáng)的傳染病，早期診斷就成為防

13、治的關(guān)鍵。此技術(shù)的可定量性也是免疫檢測無法達(dá)到的。3.1.4.核酸檢測技術(shù)的原理核酸檢測技術(shù)包括：標(biāo)本樣品(如血液、生物組織、糞便、痰等)的采集和處理，核酸擴(kuò)增，產(chǎn)物檢測，及結(jié)果分析。其中擴(kuò)增與檢測是關(guān)鍵步驟。擴(kuò)增就是將處理過的樣品中的某種特定核酸(如乙肝病人血液中攜帶的乙肝病毒DNA)，在人工條件下，特異性地曾加某一段DNA分子的數(shù)量。擴(kuò)增技術(shù)有以PCR為代表的多種方法。產(chǎn)物檢測則是通過某種特定方法，確認(rèn)擴(kuò)增出來的大量核酸就是檢測目標(biāo)(即乙肝病毒DNA)。與擴(kuò)增技術(shù)相比，目前檢測方法則相對甚少。高效定量(CAD)PCR的獨(dú)特之處便是在檢測方面有其突出貢獻(xiàn)(詳見后述) 。3.2 PCR及相關(guān)檢

14、測技術(shù)PCR技術(shù)是目前世界上應(yīng)用最廣泛的核酸擴(kuò)增方法，也是高效定量(CAD)PCR中不可替代的關(guān)鍵步驟，故在此介紹一下PCR的技術(shù)背景。3.2.1.PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)是以一條病源(如乙肝病毒)DNA或RNA為模板，在人工控制的條件下，通過DNA合成酶的作用，經(jīng)過數(shù)十次溫度變化周期，于試管中復(fù)制出數(shù)以億計(jì)的完全一樣的DNA片段。如此眾多的DNA復(fù)制片段使得核酸檢測成為可能。3.2.2.與PCR相關(guān)的檢測技術(shù)這些復(fù)制出來的眾多DNA片段還要通過進(jìn)一步檢測，以確定是否真的是靶標(biāo)DNA。目前已有少數(shù)幾種成熟的檢測方法，但是只有Roche公司的熒光(TaqMan)PCR方法達(dá)到了單一步驟均一閉合系

15、統(tǒng)檢測的水平。這里所說的單一步驟均一閉合系統(tǒng)在檢測中至關(guān)重要，下面詳細(xì)介紹。3.2.3.核酸的單一步驟均一閉合系統(tǒng)檢測首先討論非單一步驟均一閉合系統(tǒng)檢測。當(dāng)PCR在一個閉合容器內(nèi)完成后，將此閉合容器打開，取出眾多的DNA復(fù)制片段，移至另一容器中進(jìn)行檢測，如分子雜交，熒光染色，基因芯片等。此方法致命缺陷在于，一旦閉合容器被打開，大量的DNA復(fù)制片段在取出過程中，造成實(shí)驗(yàn)室交叉污染。因?yàn)镈NA十分穩(wěn)定，極難清洗，許多實(shí)驗(yàn)室因此而廢棄，為行業(yè)中大忌，另外也花費(fèi)更長時間。例如目前國內(nèi)已宣布的一種非典檢測試劑以基因芯片為檢測手段，就屬于非均一閉合系統(tǒng)檢測。單一步驟均一閉合系統(tǒng)檢測就是把檢測染色試劑在PC

16、R開始前即加入PCR反應(yīng)容器，使擴(kuò)增和檢測同時進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，檢測反應(yīng)也同時完成，不必打開容器，取出DNA。這樣既消除了交叉污染，又節(jié)省了時間，還能在反應(yīng)過程中實(shí)時監(jiān)測，從而達(dá)到定量檢測的效果。目前只有熒光(TaqMan)PCR技術(shù)既能達(dá)到單一步驟均一閉合系統(tǒng)檢測，又推出了商業(yè)產(chǎn)品。3.3 熒光(TaqMan)PCR技術(shù)Roche公司以其強(qiáng)大的技術(shù)優(yōu)勢和雄厚的財(cái)務(wù)實(shí)力于幾年前并購了TaqMan公司，緊接著推出了熒光(TaqMan)PCR產(chǎn)品，以其明顯的優(yōu)越性很快就成為了行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品，在中國目前臨床檢驗(yàn)所用的核酸檢測產(chǎn)品基本上都是此種產(chǎn)品。但該產(chǎn)品也有其難以克服的缺陷。3.3.1. 熒光

17、(TaqMan)PCR的特點(diǎn). 迅速：整個過程在2小時內(nèi)完成。. 清潔：不會對實(shí)驗(yàn)室造成交叉污染。. 定量：通過實(shí)時監(jiān)測，定量檢測病源體。. 檢測方便：與探針聯(lián)接的熒光標(biāo)記物被新合成的DNA分子激活而發(fā)出熒光，由PCR儀上附設(shè)的熒光光度儀直接讀數(shù)即可，數(shù)據(jù)分析也可以由機(jī)器附帶的電腦軟件同時完成。3.3.2. 熒光(TaqMan)PCR的缺陷熒光(TaqMan)PCR必須使用一種特殊的DNA合成酶(Taq合成酶)，而這種酶的生物活性有些天生難以克服的缺陷。該技術(shù)存在的所有問題基本都是由所用的酶系造成的，主要有以下表現(xiàn)。.熱穩(wěn)定

18、性差。由於該技術(shù)使用的DNA合成酶的最適溫度遠(yuǎn)低于PCR的反應(yīng)溫度，因此該酶在反應(yīng)后期容易降解而失去活性，造成信噪比很低。在標(biāo)本樣品中病源體含量低時(100拷貝)，經(jīng)常產(chǎn)生假陰性結(jié)果。假陰性會在臨床上產(chǎn)生大量疑似病例，如今年SARS流行時大量疑似患者的隔離。這樣就起不到早期檢測的效果。. 準(zhǔn)確性差由於熒光(TaqMan)PCR所用DNA合成酶的保真度和特異性差，導(dǎo)致大量復(fù)制錯誤，降低了擴(kuò)增反應(yīng)的準(zhǔn)確性，從而大大影響了定量檢測的結(jié)果。. 對各種DNA合成抑制劑均敏感由於所用的DNA合成酶對多種抑制劑都過於敏感，因此熒光(TaqMan)PCR對樣品的前處理和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要

19、求極高，稍有不慎就會使酶失活，擴(kuò)增反應(yīng)停止，因而出現(xiàn)大量假陰性結(jié)果。中國大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室條件普遍偏低，急需一種更適合中國國情的高質(zhì)量產(chǎn)品替代熒光(TaqMan)PCR,. 無模板合成多年來熒光(TaqMan)PCR的使用結(jié)果顯示，其所用的酶生物活性不穩(wěn)定，經(jīng)常有無模板聚合反應(yīng)，即合成出的DNA并非模板的復(fù)制物，由此產(chǎn)生多種意想不到的結(jié)果，既有假陰性，也有假陽性，大大降低了其使用效果。. 價格昂貴熒光(TaqMan)PCR的專利為Roche公司擁有。該公司已宣布正在加緊開發(fā)以熒光(TaqMan)PCR為基礎(chǔ)的SARS檢測試劑盒，并將于今年秋季投放中國市場。它選擇的時機(jī)

20、說明了它要在今年冬季可能出現(xiàn)的SARS高峰期搶占中國SARS檢測市場的企圖。而中國公司迄今已開發(fā)出的SARS檢測產(chǎn)品絕大多數(shù)都是基於熒光(TaqMan)PCR技術(shù)的，屆時將在知識產(chǎn)權(quán)方面受到來自Roche的強(qiáng)大挑戰(zhàn)。中國要么向Roche支付天價的專利使用費(fèi)，要么將本國SARS檢測市場拱手讓給Roche。在這種情況下，高效定量(CAD)PCR就成了中國人民可以用來對抗SARS可能回潮的唯一有效的檢測手段。在其他疾病的檢測方面，中國也面臨同樣的問題。3.4 高效定量(CAD)PCR技術(shù)3.4.1.高效定量(CAD)PCR技術(shù)的特點(diǎn)高效定量(CAD)PCR是一種將PCR與單一步驟均一閉合系統(tǒng)檢測巧妙

21、結(jié)合起來的最新核酸檢測平臺技術(shù)，是下一代的實(shí)時定量PCR。高效定量(CAD)PCR汲取了熒光(TaqMan)PCR的優(yōu)點(diǎn)，并對熒光(TaqMan)PCR的熒光染色檢測方法及所用的酶系做了革命性的改進(jìn)。高效定量(CAD)PCR已于2002年申請了專利。鑒于熒光(TaqMan)PCR所用的酶的缺陷，高效定量(CAD)PCR采用了一種全新的DNA合成酶。這種酶具有熱穩(wěn)定性高，擴(kuò)增保真度和準(zhǔn)確性高，不易受核酸合成酶抑制因子的影響，主要生物活性指標(biāo)均穩(wěn)定等明顯優(yōu)點(diǎn)。另外，因?yàn)榇思夹g(shù)的專利為中國人所擁有，所以不必要擔(dān)心高昂的技術(shù)轉(zhuǎn)讓費(fèi)。高效定量(CAD)PCR的基本原理與反應(yīng)條件和熒光(TaqMan)PC

22、R完全一樣，所以可以在目前流行的任何一種PCR儀上進(jìn)行，不必開發(fā)新的配套儀器。3.4.2. PCR所用DNA合成酶的分析DNA合成酶是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接控制反應(yīng)結(jié)果。目前世界上已開發(fā)出許多種，每一種的復(fù)制保真度和準(zhǔn)確度大不相同。下表列出八種DNA合成酶的相對準(zhǔn)確度。從表中可以看出，高效定量(CAD)PCR所用的酶，PfuUltra，比熒光(TaqMan)PCR所用的酶，Taq，高出18倍。這從一個側(cè)面說明為什么高效定量(CAD)PCR有如此之高的準(zhǔn)確度。此外，高效定量(CAD)PCR所用DNA合成酶具有極高的熱穩(wěn)定性，比熒光(TaqMan)PCR所用合成酶高出30多倍，幾乎不存在因高溫

23、而失活的問題，成為臨床檢測精確測定的又一保證。3.4.3.高效定量(CAD)PCR與熒光(TaqMan)PCR的實(shí)驗(yàn)比較經(jīng)過如此改進(jìn)的高效定量(CAD)PCR與熒光(TaqMan)PCR相比，各方面指標(biāo)都有顯著提高。傲立昂公司進(jìn)行了一系列的對照實(shí)驗(yàn)，以期比較二者的優(yōu)劣，這里僅以一最具代表性實(shí)驗(yàn)為例，詳細(xì)證明高效定量(CAD)PCR的明顯優(yōu)勢。. 實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將熒光(TaqMan)PCR與高效定量(CAD)PCR兩組反應(yīng)，在除了各自的酶系之外完全相同的條件下同時進(jìn)行，分析兩者的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)儀器：ABI公司生產(chǎn)的實(shí)時PCR儀，型號為Prizm7000。該型號PCR儀是目前最先進(jìn)的

24、國際標(biāo)準(zhǔn)熒光(TaqMan)PCR儀。PCR擴(kuò)增模板：使用購買ABI公司的PCR儀時附送的標(biāo)準(zhǔn)人類基因組DNA，用量從10至10000拷貝。此模板是ABI公司用來演示其PCR儀功能正常與否的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品，具有最高的純凈度和穩(wěn)定性。使用此模板，可以避免標(biāo)本樣品采集與制備過程中可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)誤差，避免了然后DNA合成酶抑制因子存在的可能，創(chuàng)造了熒光(TaqMan)PCR的最佳反應(yīng)條件。引物和探針：同樣使用ABI公司PCR儀附送的、和標(biāo)準(zhǔn)模板配套的20倍濃度引物、探針混合物，稀釋使用，數(shù)據(jù)分析：使用與PCR儀配套的ABI公司分析軟件，基準(zhǔn)線為6至20周期，閾值為0.20.DNA合成酶和其他試劑：熒光(T

25、aqMan)PCR就使用PCR儀附送的配套標(biāo)準(zhǔn)合成酶和試劑，以使熒光(TaqMan)PCR在最佳條件下進(jìn)行。高效定量(CAD)PCR則使用傲立昂公司自己生產(chǎn)的，專門用于高效定量(CAD)PCR的高保真度DNA合成酶系及配套試劑。綜上所述，如此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)創(chuàng)造了熒光(TaqMan)PCR的最適合反應(yīng)條件，以期獲得熒光(TaqMan)PCR的最佳結(jié)果。而在日常臨床熒光(TaqMan)PCR檢測實(shí)踐中，由於實(shí)驗(yàn)條件千變?nèi)f化，結(jié)果一般遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此處的最佳結(jié)果。我們的目的就是要證明，在普通條件下高效定量(CAD)PCR的檢測結(jié)果，可以輕易超過在最佳條件下熒光(TaqMan)PCR的結(jié)果，那么在臨床實(shí)踐中，高效

26、定量(CAD)PCR無疑比熒光(TaqMan)PCR有著巨大優(yōu)勢。.實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件加樣后，放入PCR儀，開啟實(shí)時監(jiān)測和自動分析，經(jīng)過約兩小時，PCR儀自動打印出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，轉(zhuǎn)貼于此處。熒光(TaqMan)PCRCt = -3.66LgC + 40.31R2: 0.995Efficiency: 87.6%.01.1110K高效定量(CAD)PCRCt = -3.33LgC + 39.19R2: 0.994Efficiency: 99.7%.01.1110KSNP單鹼基突變 如圖所示，上圖為熒光(TaqMan)PCR的結(jié)果，下圖為高效定量(CAD)PCR的結(jié)果。右邊為標(biāo)準(zhǔn)曲線

27、，左邊為熒光強(qiáng)度隨時間變化的曲線，從左到右四條曲線，代表四種DNA模板濃度，分別為10000，1000，100，10個DNA拷貝。.結(jié)果分析由上述結(jié)果可以清楚地看到兩種PCR技術(shù)的優(yōu)劣。熒光強(qiáng)度曲線分析：典型的熒光強(qiáng)度曲線應(yīng)該呈S型，在反應(yīng)初期，因?yàn)闆]有足夠的DNA拷貝被復(fù)制出來，也就沒有足夠的熒光分子被激活，光吸收值保持為零。中間部分光吸收值迅速上升，代表DNA拷貝的快速增加。至反應(yīng)末期，因核苷酸分子逐漸被用盡，無法再合成出更多的DNA拷貝，光吸收值的上升也就逐漸停止，曲線趨向平緩。由左上圖可見，熒光(TaqMan)PCR的四條曲線隨所用的DNA模板濃度降低而越變越矮，最后一條

28、甚至不足第一條峰值的一半，究其原因，主要是由所用DNA合成酶的準(zhǔn)確性和熱穩(wěn)定性過低造成的。用于準(zhǔn)確性低，產(chǎn)生出大量非目標(biāo)DNA，為目標(biāo)DNA設(shè)計(jì)的探針自然無法將其檢測出來，導(dǎo)致曲線變低。而熱穩(wěn)定性低使得DNA合成酶在反應(yīng)后期基本失活，即使時間再長，也無法再合成出DNA拷貝。另外，本實(shí)驗(yàn)全部是在最佳條件下進(jìn)行，反應(yīng)環(huán)境中不存在DNA合成酶抑制因子。而臨床實(shí)踐中制備出來的DNA模板，會含有多種此類因子，破壞酶的活性，在低模板濃度條件下，極有可能造成光吸收值過低至不可檢出的程度，導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。左下圖則顯示，與熒光(TaqMan)PCR不同，高效定量(CAD)PCR的四條熒光強(qiáng)度曲線全部呈完美的S

29、型，說明了該技術(shù)無與倫比的保真度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。而且高效定量(CAD)PCR所用的DNA合成酶對各種抑制因子均不敏感，臨床制備出來的模板也不會影響反應(yīng)結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：對照兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率(Efficiency)，可以從另一個角度說明高效定量(CAD)PCR的優(yōu)越。擴(kuò)增效率是指PCR每一次擴(kuò)增反應(yīng)能夠產(chǎn)生多少個DNA拷貝。熒光(TaqMan)PCR的擴(kuò)增效率只有87.6%，即每一次擴(kuò)增能產(chǎn)生0.876個DNA分子，或者說，每一百次擴(kuò)增反應(yīng)，只有約88次能產(chǎn)生完整的DNA分子，而且這還是在最佳反應(yīng)條件下的結(jié)果。與之對照，高效定量(CAD)PCR的擴(kuò)增效率幾乎達(dá)到百分之百，比前者的最佳結(jié)

30、果高出14%。可以預(yù)測，在未來臨床實(shí)際應(yīng)用中，高效定量(CAD)PCR的擴(kuò)增效率必將遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熒光(TaqMan)PCR的表現(xiàn)。以上分析清楚地表明，高效定量(CAD)PCR有著熒光(TaqMan)PCR無法比擬的巨大優(yōu)勢，一旦應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，必將對中國的醫(yī)療檢測行業(yè)帶來重大突破?；仡欉^去數(shù)月中國抗擊SARS的過程中，一直沒有有效的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測手段，以致大量疑似患者被長時間隔離。雖有多家研究單位和公司宣布成功開發(fā)出檢測試劑盒，但陽性檢出率最高達(dá)到百分之七八十，有的甚至低到百分之十幾。仔細(xì)分析起來，如此高的假陰性比例，雖然有多種可能性，但熒光(TaqMan)PCR本身的固有缺陷很可能是主要原因。3

31、.4.4.高效定量(CAD)PCR技術(shù)的操作及產(chǎn)品高效定量(CAD)PCR可以應(yīng)用在幾乎所有疾病病源檢測上，只要該疾病病源體基因被部分解碼。從被解碼的病源基因序列中選出最具特異性的兩個片段，各長20至50鹼基，分別合成出引物DNA(Primer)和檢測探針(Probe)。然后從病源標(biāo)本中提取出病源DNA(若是RNA，須增加反轉(zhuǎn)錄步驟)，加入引物，探針，酶，及核苷酸，同置于封閉容器內(nèi)，在PCR儀上開始反應(yīng)，若儀器有實(shí)時監(jiān)測功能，則反應(yīng)結(jié)束后，定量的檢測結(jié)果同時打印出來，整個過程約2小時。高效定量(CAD)PCR與特異引物/探針的關(guān)系類似槍與子彈的關(guān)系，高效定量(CAD)PCR便是槍，眾多特異性的

32、引物/探針便是各種子彈，而病源體的DNA或RNA就是射擊的靶子。高效定量(CAD)PCR的應(yīng)用產(chǎn)品包括以下幾類：.特異高效定量(CAD)PCR檢測試劑盒 (裝好子彈的槍 )此種試劑盒裝有用于擴(kuò)增、檢測的所有試劑，包括合成及檢測的酶系，核苷酸，專為某種疾病設(shè)計(jì)的引物及熒光標(biāo)記探針，和緩沖液。此種試劑盒可以方便的用于某種單一疾病的檢測，適用于醫(yī)院，血站和單一疾病大規(guī)模普查。.廣譜高效定量(CAD)PCR檢測試劑盒 (沒裝子彈的槍 )此種試劑盒除沒有引物和探針外，與特異試劑盒完全一樣。引物和探針由操作此產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自己的需要另外制備或單獨(dú)采購，也很方便。此種試劑盒的主

33、要客戶為大學(xué)，研究所，及從事研發(fā)的公司。.引物和探針 (子彈)即專門為廣譜檢測試劑盒設(shè)計(jì)、制備的引物和探針。利用現(xiàn)代生物信息系統(tǒng)的最新成果，根據(jù)已經(jīng)解碼的病原體基因序列，引物和熒光標(biāo)記探針很容易制備。如今越來越多的病原體基因被解碼，為高效定量(CAD)PCR的推廣應(yīng)用提供了便利條件。.PCR模板的制備 (靶子)醫(yī)生或護(hù)士從病人身上采集樣本(血、糞便、痰等)，從中提取出DNA或RNA，用于高效定量(CAD)PCR檢測。不同的病原體有不同的標(biāo)準(zhǔn)制備方法。第四部分 行業(yè)及市場分析談到市場，必須先說明一點(diǎn)，即高效定量(CAD)PCR是一種適用于眾多與檢測相關(guān)的領(lǐng)域的平臺技術(shù)

34、，而非一種只能用來檢測某種特殊疾病的單一技術(shù)。在第三部分中談到了核酸檢測技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，包括病源檢測，流行病、常見病的普查，致病遺傳基因的普查，血源檢查，環(huán)保監(jiān)測，和轉(zhuǎn)基因動植物檢出等。這些也同樣是高效定量(CAD)PCR的應(yīng)用領(lǐng)域。下面僅以病源檢測領(lǐng)域?yàn)橹?，分析高效定?CAD)PCR技術(shù)的市場前景。4.1. 國際市場以各種PCR技術(shù)為代表的核酸檢測方法是近10年來迅速崛起的全新檢測手段。在此之前，免疫檢測一直是臨床檢測的主要手段。免疫檢測雖然具有速度快，價格低等優(yōu)點(diǎn)，但是在靈敏度、準(zhǔn)確度、定量化等方面遠(yuǎn)遜于核酸檢測。因而核酸檢測的市場在過去10年內(nèi)以每年20%以上的速度遞增，并在今后10年

35、將保持25%以上的年銷售增長率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2010年歐美市場年銷售額將達(dá)到170億美元之巨。近年來對一些嚴(yán)重流行病的管理為核酸檢測技術(shù)創(chuàng)造了難得的契機(jī)。例如1999年美國國家食品醫(yī)藥管理局(FDA)正式要求全國血站及相關(guān)結(jié)構(gòu)，必須使用核酸檢測技術(shù)測試所有血液及血液制品中的艾滋病毒和丙肝病毒，為擁有艾滋病毒和丙肝病毒基因序列專利的美國Chiron公司創(chuàng)造了天賜良機(jī)。該公司此二種試劑的年銷售量從1999年的700萬美元，猛增到2001年的1億2千多萬，三年增加了18倍。今年美國FDA又把西尼羅病毒列入了血液制品必須測試的名單，新的機(jī)會還在不斷被創(chuàng)造出來。目前中國藥檢局，乃至世界各國都

36、還沒有批準(zhǔn)任何一個SARS檢測試劑加入臨床實(shí)驗(yàn)，就是因?yàn)闆]有一個產(chǎn)品令人滿意。如果高效定量(CAD)PCR此刻脫穎而出，獲得批準(zhǔn)，其本身的商業(yè)價值和社會影響之大，難以估量。高效定量(CAD)PCR是一種全新的、高技術(shù)含量很高的檢測方法，除了能帶來巨大的銷售量，還能產(chǎn)生很高的利潤率。以美國為例，檢測行業(yè)的跨國公司一般稅前利潤率在10%到15%之間，而以核酸檢測為主的瑞士Roche公司的檢測分公司，稅前利潤率高達(dá)35%，甚至超過了它的制藥分公司的利潤率。除了市場飛速增長和高額利潤之外，高度壟斷是核酸檢測的另一特征。眾所周知，醫(yī)藥行業(yè)是一個壟斷程度相對較低的行業(yè)，而檢測試劑則是其中的一個異數(shù)，因其很

37、大程度上依賴某一特殊的技術(shù)或?qū)＠?。以PCR為例，作為核酸檢測的核心技術(shù)平臺，自1991年被瑞士Roche公司以3億美元一次性買斷專利后，為該公司保持在核酸檢測領(lǐng)域超過50%的市場份額達(dá)12年之久。目前Roche公司的熒光(TaqMan)PCR以其方便、快捷的優(yōu)勢，幾乎完全占有了中國的核酸檢測市場。一旦有一個各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)能全面超越它的新技術(shù)問世，此新技術(shù)必將取代熒光(TaqMan)PCR的地位，成為新的壟斷。4.2. 國內(nèi)市場國內(nèi)的核酸檢測市場自2001年國家藥監(jiān)局決定重新開放以來，經(jīng)歷了難以置信的高速發(fā)展，市場規(guī)模已達(dá)幾億至十幾億元人民幣，十幾個廠家成為此行業(yè)的主要成員，但是與歐美、日本等發(fā)達(dá)

38、國家相比，還有很大差距。以美國為例，其診斷試劑產(chǎn)品占整個醫(yī)藥市場的30%，而我國目前僅有10%不到。實(shí)際上，早期診斷檢測的消費(fèi)可以避免或減少價格更高的疾病治療費(fèi)用，從整體上降低醫(yī)療費(fèi)用。美國國家疾病預(yù)防控制中心(CDC)的一份研究報告顯示：對由Chlamydia造成的性傳染病來說，每一美元用在早期檢測的花銷可以節(jié)省十一美元的治療費(fèi)用。毫無疑問，中國的核酸診斷市場，還有巨大的發(fā)展空間。據(jù)衛(wèi)生部門的統(tǒng)計(jì)，我國四種常見傳染病每年的檢測量為：梅毒 6580萬人次AIDS 4680萬人次丙型肝炎 9080萬人次乙型肝炎 14080萬人次另外還有獻(xiàn)血員血液檢測每年4000萬人次。僅上述五項(xiàng)合計(jì)即達(dá)到每年4

39、億人次。如此龐大的市場目前基本上是免疫檢測產(chǎn)品的天下，而免疫診斷有其天然缺陷。前面已經(jīng)談到，免疫診斷無法用作早期檢測。另外，身體內(nèi)抗體的數(shù)量與病原體數(shù)量之間不存在正比關(guān)系，檢測抗體的數(shù)量無法推測出病原體的數(shù)量，對許多疾病，病原體數(shù)量的檢測至關(guān)重要。例如艾滋病在雞尾酒療法過程中，必須定時監(jiān)控艾滋病毒在血液中的數(shù)量。由此看來，核酸診斷將扮演越來越重要的角色，逐漸取代免疫檢測的壟斷地位。美國FDA已正式要求使用核酸檢測方法，篩查獻(xiàn)血員及血液制品中的艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和西尼羅病毒。中國河南爆發(fā)的由賣血引起的艾滋病村令人不寒而栗，而乙肝病毒攜帶者早已超過1億，為嚴(yán)格控制這些傳染病的流行，相信中

40、國政府不久也會推出獻(xiàn)血檢測的有關(guān)政策法規(guī)，這將創(chuàng)造出難得的商機(jī)。目前中國尚不發(fā)達(dá)的核酸診斷市場的70%已為國外產(chǎn)品壟斷，面對未來的巨大市場，中國急需自己的優(yōu)秀產(chǎn)品。第五部分： 商業(yè)模式及贏利預(yù)測應(yīng)用高效定量(CAD)PCR技術(shù)平臺，生產(chǎn)新一代診斷試劑，可以根據(jù)市場需求的迫切性而采取靈活的商業(yè)模式。目前傲立昂公司已經(jīng)成功開發(fā)出實(shí)驗(yàn)室水平的廣譜診斷試劑盒，下一步則根據(jù)市場需求及中方合作者的意見，選擇一至三個疾病(如SARS、艾滋病和乙肝)為目標(biāo)，在一個月之內(nèi)，小批量生產(chǎn)出特異診斷試劑盒，在臨床樣品(如血液、唾液、糞便等)上試驗(yàn)，結(jié)果滿意后，向國家藥檢局申報，同時準(zhǔn)備大規(guī)模生產(chǎn)和廣告、促銷等工作，一

41、旦申報獲得批準(zhǔn)，立即全方位投入生產(chǎn)。假設(shè)第一期只選擇艾滋病一個目標(biāo)，根據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)資料，年檢測量近四千七百萬人次，以最保守的估計(jì)，第一年只獲得5%的市場份額，應(yīng)當(dāng)毫無問題，即兩百三十萬份試劑。目前國內(nèi)熒光(TaqMan)PCR的診斷價格為每人次二百人民幣左右，試劑部分約60元，則年銷售額可達(dá)一億三千萬元。據(jù)我們初步測算，每份試劑成本在二十至三十元之間，若加大生產(chǎn)規(guī)模，成本還能下降。加上銷售、開發(fā)等其他支出，稅前利潤能達(dá)到30%至40%，與發(fā)展中國家同類產(chǎn)品利潤率相當(dāng)，這樣產(chǎn)品上市第一年即可獲得三千萬至五千萬元的利潤。以此為基礎(chǔ)，以后每年增加若干新的疾病為目標(biāo)，充分利用高效定量(CAD)PCR的

42、專利平臺技術(shù)優(yōu)勢，逐漸取得在中國核酸診斷領(lǐng)域的主導(dǎo)、領(lǐng)先地位，領(lǐng)導(dǎo)中國企業(yè)，共同面對外國產(chǎn)品的競爭。因?yàn)楦咝Ф?CAD)PCR是當(dāng)今世界最領(lǐng)先的技術(shù)，中國企業(yè)完全可以以此技術(shù)為先鋒，進(jìn)軍國際核酸檢測試劑市場。第六部分： 合作方式及資金需求6.1. 合作伙伴傲立昂公司目前正在積極尋找共同開發(fā)中國核酸檢測試劑市場的合作伙伴。對合作伙伴的要求如下：6.1.1.資金傲立昂是一家初創(chuàng)的小公司，要想開發(fā)中國的巨大市場，需要充足資金的支持。根據(jù)不同的合作方式，資金量有所不同。6.1.2. 產(chǎn)品小樣生產(chǎn)能力高效定量(CAD)PCR平臺技術(shù)雖已成熟，但是對每一種所選擇的目標(biāo)疾病，仍需要相當(dāng)條件的實(shí)驗(yàn)室及設(shè)備，

43、以完成特異診斷試劑盒的小樣生產(chǎn)。合作者最好有過開發(fā)PCR產(chǎn)品的經(jīng)驗(yàn)。6.1.3.臨床實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)品申報醫(yī)療產(chǎn)品成功的一個關(guān)鍵因素是臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和能否得到藥檢局批準(zhǔn)。位於美國的傲立昂公司很難擁有這方面的直接經(jīng)驗(yàn)，需要國內(nèi)同行的協(xié)助。6.1.4.大規(guī)模生產(chǎn)的能力至少有國內(nèi)GMP認(rèn)證，最好擁有國際CGMP認(rèn)證。6.1.5. 產(chǎn)品營銷及公司管理熟悉國內(nèi)診斷試劑市場，有大規(guī)模營銷、儲運(yùn)的經(jīng)驗(yàn)。6.2. 合作方式傲立昂公司希望與中方合作伙伴組成合資股份有限公司，提供與高效定量(CAD)PCR有關(guān)的全部必需的專利、技術(shù)、知識，并積極參與合資公司的日常管理。中方合作伙伴可以是一家有行業(yè)經(jīng)驗(yàn)的大型實(shí)業(yè)公司，也可以

44、由多家公司組成，包括金融、科研、開發(fā)、生產(chǎn)、營銷等領(lǐng)域。合資各方所占股份以及在未來合資公司中的作用將在今后進(jìn)一步交流、談判中解決。傲立昂公司同時不排除其他有效的合作、合資方式。6.3.資金需求因商業(yè)模式及合作方式的不同，資金的投入也不同?，F(xiàn)以選擇艾滋病單一目標(biāo)為例，分析資金的投入。第一步，在中國成立合資股份有限公司，由合資公司董事會決策公司的商業(yè)模式和發(fā)展方向。合資公司日常辦公費(fèi)用所需資金不多，此處忽略。第二步，由傲立昂公司在美國設(shè)計(jì)、組裝出小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室用艾滋病毒診斷試劑盒，所需費(fèi)用不超過100萬元人民幣，時間為一個月。然后在中國通過實(shí)驗(yàn)室檢測，需資金50萬元，耗時一個月。若中方無現(xiàn)成的實(shí)驗(yàn)室

45、，建立一個達(dá)到SOP認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室要耗資500萬元人民幣，但我們更傾向通過與其他有實(shí)驗(yàn)條件的研究單位或企業(yè)合作解決。此步資金正常情況下為150萬元，最多不超過650萬元，時間為兩個月。第三步，臨床實(shí)驗(yàn)階段。完成艾滋病毒的臨床檢測實(shí)驗(yàn)約耗資300萬元，而后申報藥檢局正式批準(zhǔn)。此步資金需要300萬元，時間三到六個月(藥檢局對艾滋病有關(guān)產(chǎn)品有快速通道)。第四步，大規(guī)模生產(chǎn)。合作者最好有現(xiàn)成的生產(chǎn)線，這樣就無需任何投資。如果重新建一個符合GMP認(rèn)證，年產(chǎn)1000萬份核酸檢測試劑的車間需資金2500萬元，包括生產(chǎn)工藝的開發(fā)；若建符合CGMP認(rèn)證的同樣生產(chǎn)線，需要4000萬元。第五步，銷售隊(duì)伍。首期銷售隊(duì)伍需要50人，以有效覆蓋中國主要市場，以每人10萬元計(jì)，需資金500萬元。如果合作者現(xiàn)有的銷售隊(duì)伍可以方便地轉(zhuǎn)到核酸診斷領(lǐng)域，此項(xiàng)資金也可以省去。第一年以后，合資公司已進(jìn)入現(xiàn)金流的良性循環(huán)，銷售隊(duì)伍的擴(kuò)大將不在此考慮。第六步，廣告促銷。根據(jù)進(jìn)