HIV抗體檢測(cè)試劑盒-工藝流程圖

1、 HIV（1+2型）抗體檢測(cè)試劑盒(免疫印跡法)生產(chǎn)工藝流程1、HIV抗體檢測(cè)試劑盒(免疫印跡法)工藝流程圖 檢驗(yàn)電泳膠配制 轉(zhuǎn)膜 HIV膜條制備 HIV膜條分裝 HIV反應(yīng)膜條 檢驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照配制 強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照分裝 檢驗(yàn)弱陽(yáng)性對(duì)照配制 弱陽(yáng)性對(duì)照分裝 質(zhì)控品 檢驗(yàn)陰性對(duì)照配制 陰性對(duì)照分裝 濃縮樣品稀釋緩沖液10配制 濃縮樣品稀釋緩沖液10分裝濃縮洗膜緩沖液10配制 濃縮洗膜緩沖液10分裝 酶結(jié)合物 檢驗(yàn) 酶結(jié)合物分裝 顯色試劑底物液 底物液分裝封閉粉 封閉粉分裝HIV反應(yīng)膜條質(zhì)控品 試劑盒組裝 成品入庫(kù)顯色試劑 成品檢驗(yàn)孵育板2、各工藝的步驟和要求目錄2.1 HIV反應(yīng)膜條的制備2.1.1

2、電泳膠的制備2.1.1.1 玻璃夾板固定2.1.1.2 2%瓊脂糖封邊2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分離膠2.1.1.3.1 20ml 4%分離膠配制2.1.1.3.2 20ml 20%分離膠配制2.1.1.3.3 梯度分離膠灌膠 2.1.1.4 15ml 5%積層膠制備2.1.2 蛋白電泳分離2.1.2.1 樣品的制備2.1.2.2 上樣2.1.2.3 電泳2.1.3 半干轉(zhuǎn)膜2.1.3.1 準(zhǔn)備濾紙和NC膜2.1.3.2 裝備轉(zhuǎn)移三明治2.1.3.3 轉(zhuǎn)膜2.1.4 封閉2.2 質(zhì)控品2.2.1 強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照的配制2.2.2 弱陽(yáng)性對(duì)照的配制2.2.3 陰性對(duì)照的配制2.3

3、顯色試劑的配制2.3.1 濃縮樣品稀釋緩沖液10的配制2.3.2 濃縮洗膜緩沖液 20的配制2.3.3 酶結(jié)合物的配制 2.3.4 底物液 2.3.5 封閉粉 2.3.6顯色具體操作步驟2.3.6.1 試劑準(zhǔn)備2.3.6.1.1稀釋洗膜緩沖液2.3.6.1.2封閉緩沖液2.3.6.1.3酶結(jié)合物工作溶液2.3.6.1.4 底物液（已配制好）2.3.6.2 具體步驟2.1 HIV反應(yīng)膜條的制備2.1.1 電泳膠的制備2.1.1.1 玻璃夾板固定取潔凈的透明玻璃板兩塊（一大一?。瑢蓚€(gè)相同的透明塑料片放在小玻璃板的長(zhǎng)邊沿的兩邊，再將大玻璃板附上，用4個(gè)黑色夾子固定比例夾板（如圖所示）,放入烘箱8

4、0預(yù)熱7min左右。2.1.1.2 2%瓊脂糖封邊用電子天平取2g瓊脂糖，于錐形瓶中，再加入1x電泳液100ml，用微波加熱至完全溶解，用棉塞封好口，備用。將上述瓊脂糖倒入適量至小燒杯中,待玻璃板加熱還剩1min時(shí),將小燒杯放入微波爐中加熱至沸騰,連續(xù)沸騰2次。（注意：待瓊脂糖液體剛沸騰冒氣泡時(shí)，要及時(shí)按微波爐的暫停鍵，以免使液體溢出燒杯流到微波爐上。）待計(jì)時(shí)器響后，從烘箱中拿出玻璃板，再將小燒杯中的瓊脂糖加熱至沸騰1次，用注射器迅速吸取5ml熔化的瓊脂糖沿玻璃夾板左邊注入2ml，待瓊脂糖液體流至底部中間位置時(shí)，再沿夾板右邊注入2ml，使兩邊的瓊脂糖液流匯合在一起，底部有0.5至1cm左右的平

5、整瓊脂凝膠即可（此時(shí)因玻璃板是熱的，所以會(huì)有凝膠漏出，保證膠有一定的高度即可，），靜置10min，凝固。（注意：注入時(shí)應(yīng)使注射器針頭中的瓊脂糖液流垂直流下，成一條直線(xiàn)，不可堆積且不可產(chǎn)生氣泡。換邊封膠時(shí)要注意不要不凝膠滴到玻璃內(nèi)部。判斷封邊是否合格：底部凝膠是否能流成一條直線(xiàn). 底部凝膠是否具有一定的厚度（0.5cm1cm）。如果上述標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有達(dá)到，請(qǐng)?jiān)僦匦路膺叄悦庥绊懞罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。 ）2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分離膠2.1.1.3.1 20ml 4%分離膠配制 配方試劑體積（ml）水11.930%丙烯酰胺2.71.5M Tris-Hcl(PH8.8) 510% SDS0.21

6、0%過(guò)硫酸銨0.2TEMED0.012用移液槍?zhuān)砍?ml）分別量取11.9ml水、2.7m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl（PH8.8）于同一燒杯中，再用移液槍?zhuān)砍?00ul）依次量取200ul 10%SDS和200ul 10%過(guò)硫酸胺（AP）加入燒杯中，放入攪拌子，用攪拌器混勻。（注：請(qǐng)低速攪拌，避免起泡）最后用移液槍?zhuān)砍?0ul）取12ul TEMED加入燒杯中，放入攪拌子，用攪拌器攪拌數(shù)秒混勻。用鑷子取出攪拌子。（注：最后加入TEMED，以防凝膠快速凝固）2.1.1.3.2 20ml 20%分離膠配制 配方試劑體積（ml）水1.330%丙烯酰胺13.31.5M

7、Tris-Hcl (PH8.8)510% SDS0.210%過(guò)硫酸銨0.2TEMED0.008用移液槍?zhuān)砍?ml）分別量取1.3水、13.3m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl（PH=8.8）于同一燒杯中，再用移液槍?zhuān)砍?00ul）依次量取200ul 10%SDS和200ul 10%過(guò)硫酸胺（AP）加入燒杯中放入攪拌子，用攪拌器混勻。最后用移液槍?zhuān)砍?0ul）取8ul TEMED加入燒杯中，用攪拌器攪拌數(shù)秒混勻。2.1.1.3.3 梯度分離膠灌膠 先將混合器開(kāi)關(guān)關(guān)了，將配制好的 4%分離膠倒入梯度膠混合器A，將配制好的20%分離膠倒入梯度膠混合器B，梯度膠混合器B攪拌子

8、繼續(xù)攪拌，打開(kāi)混合器開(kāi)關(guān)，在蠕動(dòng)泵上按開(kāi)始鍵，將導(dǎo)管從玻璃夾板中間放入底部，并導(dǎo)管口隨液面升高而升高（保持導(dǎo)管口在液面上方并接觸液面），直到泵停止灌膠，用移液槍從玻璃夾板中間緩慢加入2ml乙醇（或水）。靜置10min,待膠凝固。 注意：混合器的清洗：待灌完膠，往混合器里加入灌水，清洗導(dǎo)管，2-3次，按快速鍵將導(dǎo)管里的液體排干，將混合器倒過(guò)來(lái)，晾干，方便下次使用。 2.1.1.4 15ml 5%積層膠制備 配方試劑體積（ml）水10.230%丙烯酰胺2.551M Tris-Hcl (PH6.8)1.87510% SDS0.1510%過(guò)硫酸銨0.15TEMED0.015用移液槍?zhuān)砍?ml）分別量

9、取10.2水、2.55m 30%丙烯酰胺和1.875ml 1M Tris-Hcl（PH=6.8）于同一燒杯中，再用移液槍?zhuān)砍?00ul）依次量取150ul 10%SDS和150ul 10%過(guò)硫酸胺（AP）加入燒杯中。最后，用移液槍?zhuān)砍?0ul）取15ul TEMED加入燒杯中，放入攪拌子，用攪拌器攪拌數(shù)秒混勻。用一次性移液管（量程10ml）量取10ml 5%積層膠混勻夜，從中央灌滿(mǎn)，插入梳子。靜置30min，凝固。注：凝膠不能有氣泡。如不馬上用，請(qǐng)用保鮮膜包裹，加適量緩沖液，4保存。 Ps:為實(shí)驗(yàn)方便，4%、20%分離膠和5%積層膠可以一起配制，但是未正式用前，請(qǐng)不要加入TEMED.2.1

10、.2 蛋白電泳分離2.1.2.1 樣品的制備將樣品和5x Loading buffer按照體積比為4:1的比例混合560ul，煮沸5min，13000rpm/min離心2min。2.1.2.2 上樣將玻璃夾板（短玻璃內(nèi)側(cè)）用黑色夾子固定在電泳儀上，另一邊也固定一塊潔凈的大玻璃板，用1x電泳液灌滿(mǎn)電泳儀上面的水槽至液面高于短玻璃板2.5cm，檢查不漏液，再灌下面水槽至超過(guò)玻璃板底部1cm以上即可，緩慢取出梳子。用移液槍取5ul 的marker點(diǎn)到兩邊的小上樣孔，用移液槍將560ul的蛋白樣品點(diǎn)到中間的大上樣孔。2.1.2.3 電泳將電泳蓋蓋上，正極接正極，負(fù)極接負(fù)極，設(shè)置參數(shù)：電壓120V，電流

11、：99mA，時(shí)間：300min，恒壓電泳開(kāi)始。（注：電泳正常啟動(dòng)時(shí)，電極絲會(huì)有大量小氣泡往上升，若沒(méi)有，請(qǐng)檢查電源是否插好。）2.1.3 半干轉(zhuǎn)膜2.1.3.1 準(zhǔn)備濾紙和NC膜 依據(jù)膠的大小剪好NC膜(高*寬：11.5-12cm*17cm)和16張濾紙（高*寬：11-11.5cm*16.5cm）；2.1.3.2 裝備轉(zhuǎn)移三明治 裝配轉(zhuǎn)移三明治(8層濾紙膠膜8層濾紙)：將電轉(zhuǎn)液加入搪瓷盤(pán)，在最底層加入8層濾紙，趕走氣泡；然后用鑷子將玻璃板撬開(kāi)，除去小玻璃板后，用塑料刀將積層膠和凝膠切下輕輕刮去，避免把分離膠刮破。小心剝下地把分離膠覆蓋于濾紙上，調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用塑料刀搟去氣泡；接著再將

12、NC膜鋪在上面，趕走氣泡；最后再將8層濾紙覆蓋上。（PS：必要時(shí)可倒些電轉(zhuǎn)液將膠濕潤(rùn)，使其更好地移出。NC膜要注意正反面做好標(biāo)記，粗糙的一面對(duì)著膠）2.1.3.3 轉(zhuǎn)膜 將裝配好的三明治結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)膜儀，加入適量的轉(zhuǎn)移緩沖液，設(shè)置參數(shù)，電壓30V，電流495mA，時(shí)間：50min，恒流轉(zhuǎn)膜開(kāi)始；（注：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。）2.1.4 封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。 用5%的封閉液將膜封閉，37 2h 或 4過(guò)夜。 2.2 質(zhì)控品2.2.1 強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照的配制 滅活的高滴度人血清2.2.2 弱陽(yáng)性對(duì)照的配制 滅活的低滴度人血清2.2.3 陰性對(duì)照的配制 滅活的正常

13、人血清2.3 顯色試劑的配制2.3.1 濃縮樣品稀釋緩沖液10的配制 名稱(chēng)KH2PO40.27gNa2HPO41.42gNaCl8gKCl0.2g純水800ml2.3.2 濃縮洗膜緩沖液 10的配制 名稱(chēng)1M Tris-HCl(pH7.4)40mlNaCl17.532gTween201ml純水定容至200ml2.3.3 酶結(jié)合物的配制 可用 堿性磷酸酶山羊抗人IgG 酶結(jié)合物2.3.4 底物液 可用 BCIP/NBT底物液 底物液2.3.5 封閉粉 可用 脫脂奶粉 封閉粉2.3.6顯色具體操作步驟2.3.6.1 試劑準(zhǔn)備2.3.6.1.1稀釋洗膜緩沖液a.每次使用前新鮮配制洗膜緩沖液。b.將1

14、體積的濃縮洗膜緩沖液（20*TBST：20，現(xiàn)用是10）加入到19體積的蒸餾水中，充分混勻。2.3.6.1.2封閉緩沖液a.每次使用前新鮮配制封閉緩沖液。b.將1體積的濃縮樣品稀釋緩沖液加入到9體積的蒸餾水中，充分混勻。c.在上步驟（2.b）中配制的稀釋后的濃縮樣品稀釋緩沖液中，每20ml加入0.1gMP: 1g封閉粉，充分混勻，溶解。 2.3.6.1.3酶結(jié)合物工作溶液a.用上述配好的封閉緩沖液按1:500MP：1:1000比例稀釋酶結(jié)合物。例如：每4L酶結(jié)合物加入2ml封閉緩沖液。酶結(jié)合物工作液必須在使用前配制。（AutoBlot用戶(hù)，則須在不超過(guò)1.5小時(shí)前配置。）2.3.6.1.4 底

15、物液（已配制好）a可以直接使用。請(qǐng)用潔凈吸管直接從容器中吸取需要的液體，用后擰緊蓋子。2.3.6.2 具體步驟步驟內(nèi)容6.2.2.1每槽內(nèi)加入2ml的稀釋洗試劑膜緩沖液。2ml6.2.2.2用鑷子小心取出需要的試劑膜條，有號(hào)碼的一端向上，分別放入孵育板槽內(nèi)。包括一條強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照、一條弱陽(yáng)性對(duì)照和一條陰性對(duì)照。-6.2.2.3在室溫下（22-28）將孵育板置搖床（每分鐘搖擺12至16次）上振蕩孵育10分鐘。用吸引器吸出緩沖液。再重復(fù)步驟6.2.2.1兩次.25310分鐘6.2.2.4在每槽中加入2ml上述配好封閉緩沖液，隨后分別加入20ul病人血清或強(qiáng)陽(yáng)性，弱陽(yáng)性，陰性對(duì)照。2ml封閉緩沖液20ul強(qiáng)陽(yáng)性6.2.2.5蓋好孵育板，于室溫下（22-28）在搖床上震蕩孵育2小時(shí)。2532小時(shí)6.2.2.6小心掀開(kāi)孵育板蓋以避免濺出，用吸引器吸出反應(yīng)液。不同的樣品間需換吸頭以避免交叉污染。6.2.2.7每槽中加入2ml的洗膜緩沖液，置搖床上振蕩5分鐘，棄洗液，再重復(fù)兩次。32ml6.2.2.8每槽中加入2ml的酶結(jié)合物工作溶液。蓋好孵育版，于室溫下（22-28）在搖床上振蕩孵育2小時(shí)。2m