生物化學(xué)實驗指導(dǎo)

1、生物化學(xué)實驗技術(shù)操作指導(dǎo)天津科技大學(xué)生物化學(xué)課程組2006.12目錄生物化學(xué)實驗須知 2實驗室一些常用知識介紹 3實驗一：離子交換法分離氨基酸 7實驗二：垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì) 9實驗三：馬鈴薯多酚氧化酶制備及性質(zhì)實驗13實驗四：堿性蛋白酶活力的測定 16實驗五: 植物組織中DNA和RNA的提取和鑒定 19實驗六：糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定22實驗七：綜合設(shè)計實驗蛋白質(zhì)的制備及其含量測定24實驗八：還原糖和總糖的測定（3，5-二硝基水楊酸法） 35實驗九：發(fā)酵過程中無機磷的利用37實驗十：氨基酸的分離鑒定紙層析法39實驗十一：細菌血栓溶解酶活性測定41實驗十二：可溶性糖的硅膠G薄層層析4

2、3實驗十三：植物材料中總黃酮的提純與鑒定44實驗十四：IEF/SDS-PAGE雙向電泳分離鑒定蛋白質(zhì)45附 錄 49一、實驗室主要儀器使用操作規(guī)程與注意事項49二、常用緩沖溶液的配制55三、硫酸銨飽和度的常用表60生物化學(xué)實驗須知1實驗室規(guī)則(1) 實驗課必須提前5分鐘到實驗室,不遲到,不早退，應(yīng)自覺遵守課堂紀律。(2) 使用儀器、藥品、試劑和各種物品必須注意節(jié)約, 應(yīng)特別注意保持藥品和試劑的純凈, 嚴防混雜污染。(3) 實驗臺、試劑藥品架必須保持整潔, 儀器藥品擺放井然有序。實驗完畢,需將藥品、試劑排列整齊, 儀器洗凈倒置放好, 實驗臺面抹拭干凈, 經(jīng)教師驗收儀器后, 方可離開實驗室。(4)

3、 使用和洗滌儀器時, 應(yīng)小心謹慎, 防止損壞儀器。使用精密儀器時, 應(yīng)嚴格遵守操作規(guī)程, 發(fā)現(xiàn)故障應(yīng)立即報告教師, 不要自己動手檢修。(5) 在實驗過程中要聽從教師的指導(dǎo), 嚴肅認真地按操作規(guī)程進行實驗, 并簡要、準確地將實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)記錄在實驗記錄本上。課后寫出實驗報告, 由課代表收齊交給教師。(6)儀器損壞時, 應(yīng)如實向教師報告, 真填寫損壞儀器登記表, 然后補償一定金額。(7)每次實驗課安排同學(xué)輪流值日, 值日生要負責當天實驗的衛(wèi)生和安全檢查。2實驗記錄 實驗課前應(yīng)認真預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容，將實驗名稱、實驗原理、實驗內(nèi)容和步驟等簡單扼要寫在記錄本上。實驗記錄本要標明頁碼，不能隨意撕掉任何一頁。

4、實驗中使用的試劑純度和終濃度以及使用的儀器類型等都要記錄清楚。實驗中觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和得出的數(shù)據(jù)，應(yīng)及時直接記在記錄本上，絕對不可以隨意記在單片紙上。原始記錄必須準確、簡練、清楚。3實驗報告的書寫 實驗結(jié)束后,應(yīng)及時整理和總結(jié)實驗結(jié)果, 寫出實驗報告。（1） 標題 標題應(yīng)包括實驗名稱、實驗時間、實驗室名稱、實驗組號、實驗者及同組者姓名、實驗室條件。（2） 實驗?zāi)康模?） 實驗原理 應(yīng)簡述基本原理，不要完全照抄實驗指導(dǎo)書。（4）操作步驟 操作步驟 (或方法)可以采用流程圖的方式或自行設(shè)計的表格來表達。（5） 實驗結(jié)果 將實驗中的現(xiàn)象、數(shù)據(jù)進行整理、分析，得出相應(yīng)的結(jié)論。建議盡量使用圖表法來表示

5、實驗結(jié)果，這樣可以使實驗結(jié)果清楚明了。（6） 討論 包括對實驗結(jié)果及觀察現(xiàn)象的小結(jié)、對實驗中遇到的問題和思考題的探討以及對實驗的改進意見等。4生物化學(xué)實驗課評分標準n 實驗預(yù)習(xí)情況（10%） n 實驗操作情況（20%） n 實驗報告情況（30%） n 實驗考試成績（40%） 實驗室一些常用知識介紹一玻璃儀器的洗滌及一些常用的洗滌劑1. 玻璃儀器的洗滌（1）新購買的玻璃儀器, 首先用自來水洗去表面灰垢, 然后用洗衣粉刷洗, 自來水沖凈后, 浸泡在 1%2% 鹽酸溶液中過夜以除去玻璃表面的堿性物質(zhì)。最后, 用自來水沖洗干凈, 并用蒸餾水沖洗 2 次。（2）對于使用過的玻璃儀器, 應(yīng)先用自來水沖洗,

6、 再用毛刷蘸取洗衣粉刷洗。用自來水充分沖洗后再用蒸餾水沖洗 2 次。凡洗凈的玻璃儀器壁上都不應(yīng)帶有水珠, 否則表示尚未洗凈, 需重新洗滌。（3）比較臟的儀器或不便刷洗的儀器, 使用前應(yīng)用流水沖洗, 以除去粘附物, 如果儀器上有凡士林或其他油污, 應(yīng)先用軟紙擦除, 再用有機溶劑擦凈，最后用自來水沖洗。待儀器晾干后, 放入鉻酸洗液中浸泡過夜。取出后用自來水充分沖洗, 再用蒸餾水沖洗 2 次。（4）普通玻璃儀器可在烘箱內(nèi)烘干, 但定量的玻璃儀器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等不能加熱, 應(yīng)晾干備用。另外, 分光光度計中的比色杯的四壁是用特殊膠水粘合而成, 受熱后會散架, 所以也不能烘干。對疑有傳染性的

7、樣品 ( 如肝炎病人的血清 ), 其容器應(yīng)先消毒再清洗。盛過劇毒藥物或放射性同位素物質(zhì)的容器, 應(yīng)先經(jīng)過專門處理后再清洗。2. 一些常用的洗滌劑a. 肥皂水或洗衣粉溶液這是最常用的洗滌劑, 主要是利用其乳化作用以除去污垢, 一般玻璃儀器均可用其刷洗。b. 鉻酸洗液 ( 重鉻酸鉀一硫酸洗液 )鉻酸洗液廣泛用于玻璃儀器的洗滌, 其清潔效力來自于它的強氧化性 (6 價鉻) 和強酸性。鉻酸洗液具有強腐蝕性, 使用時應(yīng)注意安全。鉻酸洗液可反復(fù)使用多次, 如洗液由紅棕色變?yōu)榫G色或過于稀釋則不宜再用。c. 5%10% 乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA-Na2) 溶液: 加熱煮沸, 利用 ED-TA 和金屬離子的

8、強配位效應(yīng), 可去除玻璃器皿內(nèi)部鈣鎂鹽類的白色沉淀和不易 溶解的重金屬鹽類。 d. 45% 的尿素洗液: 是蛋白質(zhì)的良好溶劑, 適用于洗滌盛蛋白質(zhì)制劑血樣的容器。e.乙醇一硝酸混合液用于清洗一般方法難于洗凈的有機物, 最適合于洗滌滴定管。二生物化學(xué)常用緩沖液1. 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑, 由于它們是二級解離, 有 2 個pka 值, 所以用它們配制的緩沖液, pH 范圍最寬：NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21Na2HP04：pKa1=7.21, pKa2=12.32配酸性緩沖液：用 NaH2P04, pH 值為 14 。配中性緩沖液：用混

9、合的兩種磷酸鹽, pH 值為 68。配堿性緩沖液：用 Na2HP04, pH 值為 1012 。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點為：容易配制成各種濃度的緩沖液; 適用的 pH 范圍寬; pH 受溫度的影響小;緩沖液稀釋后 pH 變化小, 如稀釋 10 倍后 pH 的變化小于 0.1 。其缺點為：易與常見的Ca2+、 Mg2+以及重金屬離子締合生成沉淀;會抑制某些生物化學(xué)過程, 如對某些酶的催化作用會產(chǎn)生某種程度的抑制作用。2.Tris緩沖液( 三羥甲基氨基甲烷) Tris 緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多, 有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢, 如在SDS- 聚丙烯酷膠凝膠電泳中己都使用 Tris 緩沖液, 而很

10、少再用磷酸鹽。Tris 緩沖液的常用有效 pH 范圍是在 中性 范圍 , 例如 Tris-HCl 緩沖液pH 值為 7.58.5Tris- 磷酸鹽緩沖液 pH 值為 5.09.0Tris-HCl 緩沖液的優(yōu)點是： 因為 Tris 堿的堿性較強 , 所以可以只用這一種緩沖體系, 配制 pH 范圍由酸性到堿性的大范圍 pH 值的緩沖液; 對生物化學(xué)過程干擾很小, 不與鈣離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點是：緩沖液的 pH 值受溶液濃度影響較大, 緩沖液稀釋 10 倍 , pH 值的變化大于 0.1; 溫度效應(yīng)大, 溫度變化對緩沖液 pH 值的影響很大, 例如 4時緩沖液的 pH 值為 8.4, 則

11、37 時的 pH 值為 7.4, 所以一定要在使用溫度下進行配制, 室溫下配制的 Tris-HCl 緩沖液不能用于 04; 易吸收空氣中的 C02, 所以配制的緩沖液要蓋嚴密封;此緩沖液對某些 pH 電極發(fā)生一定的干擾作用, 所以要使用與 Tris 溶液具有兼容性的電極。3. 硼酸鹽緩沖液常用的有效 pH 范圍是：pH 值為 8.510.0, 因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液, 其優(yōu)點是配制方便, 只使用一種試劑, 缺點是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物, 尤其是能與糖類的短基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。4. 氨基酸緩沖液此緩沖液使用的范圍寬, 可用于 pH 值為 2.011.0, 例如

12、最常用的有：甘氨酸 -HCl 緩沖液：pH 值為 2.05.0 。甘氨酸 -NaOH 緩沖液：pH 值為 8.011.0 。甘氨酸 -Tris 緩沖液：pH 值為 8.011.0( 此緩沖液用于廣泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液 ) 。組氨酸緩沖液：pH 值為 5.56.5 。甘氨酰胺(glycine amide) 緩沖液：pH 值為 7.88.8 。甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 緩沖液：pH 值為 8.09.0 。此類緩沖體系的優(yōu)點是：為細胞組分和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點是：與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似, 也會干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程, 如代謝過程

13、等; 試劑的價格較高。三pH 值的測定測定溶液 pH 值通常有兩種方法, 最簡便但較粗略的方法是用 pH 試紙, 分為廣泛和精密 pH 試紙兩種。精確測定溶液 pH 值要使用 pH 計, 其精確度可達 0.005 個 pH 單位, 關(guān)鍵是要正確 選用和校對 pH 電極。過去是使用兩個電極, 即玻璃電極和參比電極, 現(xiàn)在它們已淘汰, 被兩種電極合一的復(fù)合電極所代替。玻璃電極對溶液中的氫離子濃度敏感, 其頭部為一薄玻璃泡, 內(nèi)裝有 0.lmol/L HCl, 上部由銀 -氯化銀電極與鉑金絲聯(lián)結(jié)。當玻璃電極浸入樣品溶液時, 薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)的電位差取決于溶液的 pH 值, 即玻璃電極的電極電位隨樣品

14、溶液中氫離子濃度 ( 活 度 ) 的變化而變化。參比電極的功能是提供一個恒定的電位, 作為測量玻璃電極薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)電位差的參照。常用的參比電極是甘汞電極 (Hg/HgCl) 或銀 -氯化銀電極 (Ag/AgCl) 。參比電極電位是氯離子濃度的函數(shù), 因而電極內(nèi)充以 4mol/L KCl 或飽和 KC1, 以保持恒定的氯離子濃度和恒定的電極電位。使用飽和 KCl 是為使電極內(nèi)沉積有部分 KCl 結(jié)晶, 以使 KCl 的飽和濃度不受溫度和濕度的影響?，F(xiàn)在 pH 值測定已都改用玻璃電極與參比電極合一的復(fù)合電極, 即將它們共同組裝在一根玻璃管使用時應(yīng)注意：(1) 經(jīng)常檢查電極內(nèi)的 4mol/L K

15、Cl 溶液的液面, 如液面過低則應(yīng)補充 4mol/L KCl溶液。(2) 玻璃泡極易破碎, 使用時必須極為小心。(3) 復(fù)合電極長期不用, 可浸泡在 2mol/L KCl 溶液中, 平時可浸泡在無離子水或緩沖溶液中, 使用時取出, 用洗并沖洗玻璃泡部分, 然后用吸水紙吸干余水, 將電極浸入待測溶液中 , 稍加攪拌, 讀數(shù)時電極應(yīng)靜止不動, 以免數(shù)字跳動不穩(wěn)定。(4) 使用時復(fù)合電極的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。(5) 使用前要用標準緩沖液校正電極, 其數(shù)據(jù)見書后附錄, 常用的 3 種標準緩沖液pH 值 4.00 、 6.88 和 9.23(20 ), 精度為 0.002pH 單位。校正時

16、先將電極放入 6.88 的標準緩沖液中, 用 pH 計上的 標準 旋鈕校正 pH 讀數(shù), 然后取出電極洗凈, 再放入 pH 值為 4.00 或 9.23 的標準緩沖液中, 用 斜率 旋鈕校正 pH 讀數(shù), 如此反復(fù)多次, 直至二 點校正正確, 再用第三種標準緩沖液檢查。標準緩沖液不用時應(yīng)冷藏。(6) 電極的玻璃泡容易被污染。若測定濃蛋白質(zhì)溶液的 pH 值時, 玻璃泡表面會覆 蓋一層蛋白質(zhì)膜, 不易洗凈而干擾測定, 此時可用 0.1mol/L HCl 的 lInurnl 胃蛋白酶溶液浸泡過夜。若被油脂污染, 可用丙酣浸泡。若電極保存時間過長, 校正數(shù)值不準時, 可將電極放入 2mol/L KCl

17、 溶液中 ,40 加熱 lh 以上, 進行電極活化。pH 測定時會有幾方面的誤差：(1) 鈉離子的干擾： 多數(shù)復(fù)合電極對 Na+ 和 H+ 都非常敏感, 尤其是高 pH 值的堿性溶液 ,Na的干擾更加明顯。例如 , 當 Na+ 濃度為 0.1mol/L 時, 可使 pH 值偏低 0.4 0.5 個單位。為減少 Na+ 對 pH 測定的干擾, 每個復(fù)合電極都應(yīng)附有一條校正Na+ 干擾的標準曲線, 有的新式的復(fù)合電極具有 Na+ 不透過性能, 如不具備以上兩個條件, 則可以將電極內(nèi)的 KCl 換成NaCl。(2 濃度效應(yīng)：溶液的 pH 值與溶液中緩沖離子濃度和其他鹽離子濃度有關(guān), 因為溶 液 pH

18、 值取決于溶液中的離子活度而不是濃度, 只有在很稀的溶液中, 離子的活度才與其濃度相等。生化實驗中經(jīng)常配制比使用濃度高 10 倍的 貯液 , 使用時再稀釋到所需濃度，由于濃度變化很大，溶液pH會有變化，因此稀釋后仍需對其pH進行調(diào)整。(3）溫度效應(yīng)：有的緩沖液的pH受溫度影響很大，如Tris 緩沖液，因此配制和使用都要在同一溫度下進行。實驗一：離子交換法分離氨基酸一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)用陽離子交換樹脂柱分離氨基酸的操作方法和基本原理。二、實驗原理離子交換層析（ion exchange chromatography，簡稱ICE）是分析和制備樣品混合物的液-固相層析方法，是基于待測物質(zhì)的陽離子或陰離子和

19、相對應(yīng)的離子交換劑間的靜電結(jié)合，即根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性等差異，通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質(zhì)溶液各組分分開。它是從復(fù)雜混合物體系中分離性質(zhì)極為相似的生物分子的有效手段之一。由于帶電荷不同的各種物質(zhì)對離子交換劑有不同親和力，通過改變洗脫液的離子強度和pH值，控制這種親和力，即可使這些物質(zhì)依據(jù)親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的pH值，各種氨基酸分子結(jié)構(gòu)不同，在同一pH值時所帶電荷的性質(zhì)（正、負）和多少不同，與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可根據(jù)親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫下來，達到分離的效果。三、儀器與試劑（一）實

20、驗器材（1）玻璃層析柱（2）試管（3）移液管（4）恒壓洗脫瓶（5）部分收集器（6）水浴鍋（7）分光光度計（8）電爐（二）材料與試劑（1）苯乙烯磺酸鈉型樹脂（100200目）（2）2mol/L鹽酸溶液（3）2mol/L氫氧化鈉溶液（4）標準氨基酸溶液：將天門冬氨酸和賴氨酸分別配成2mg/mL的0.1mol/L鹽酸溶液。（5）混合氨基酸溶液：將上述天門冬氨酸和賴氨酸溶液按1：4比例混合。（6）檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸溶液（pH5.8，鈉離子濃度0.45mol/L）：取檸檬酸14.25克、氫氧化鈉9.30克分別溶于水后混合，加入濃鹽酸5.25毫升，定容至500毫升；4冰箱保存。（7）顯色劑：2克水合茚

21、三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升。四、操作步聚（1）層析柱的準備：將強酸性陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型后洗至中性，攪拌1小時后裝入層析柱，使之自然降沉到一定高度，用緩沖液平衡。（2）平衡：用pH5.8的檸檬酸緩沖液沖洗平衡離子交換柱，調(diào)節(jié)流速，收集洗脫液至4倍床體積即可上樣。（3）加樣分離：將液面緩慢放至貼近層析柱表面，由柱上端仔細加入氨基酸混合液0.250.5毫升，同時開始收集流出液。當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時，立即加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時，再加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。如此重復(fù)兩次，然后用滴管小心注入檸檬酸緩沖液（切勿攪動床面）。用試管收集

22、洗脫液，每管收集1毫升，直至無氨基酸流出為止。（4）氨基酸的鑒定：向各管收集液中加入1毫升水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中加熱15分鐘，冷至室溫測定光密度值。以收集的管數(shù)為橫坐標，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標，繪制洗脫曲線。（用以已知兩種氨基酸的純?nèi)芤簽闃悠罚瓷鲜龇椒ê蜅l件分別操作，將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照，即可確定兩個峰為何種氨基酸。）五、思考題1.何謂氨基酸的離子交換？本實驗采用的離子交換劑屬于哪一種？2.離子交換樹脂用緩沖液平衡，為何又用緩沖液沖洗？實驗中為什么要用pH5.8的檸檬酸緩沖液？可不可以用其它pH值的緩沖液？如果可以，應(yīng)選用的pH為多少？并闡述原理。3.茚三酮顯

23、色劑在與氨基酸顯色時，是與氨基酸的什么基團反應(yīng)？反應(yīng)條件是什么？顯色時為什么要沸水浴加熱？顯色原理是什么？4.本實驗分離的兩種氨基酸，是否可以采用陰離子交換樹脂分離，如果使用陰離子樹脂，條件和結(jié)果如何？請說明原理。5.除氨基酸外，用離子交換柱層析法還適合分離哪些物質(zhì)？為什么？實驗二：垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDSPAGE)測定蛋白質(zhì)的分子量的原理和基本操作技術(shù)。二、實驗原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(pI)時，蛋白質(zhì)本身帶負電，在電場中將向正極移動；當溶液的pH小于蛋白質(zhì)的等電點

24、時，蛋白質(zhì)帶正電，在電場中將向負極移動；蛋白質(zhì)在特定電場中移動的速度取決于其本身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分子形狀、電場強度等。 聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)。本實驗采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔徑的兩層凝膠；這樣，當含有不同分子量的蛋白質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較大，不同大小的蛋白質(zhì)分子在通過大孔膠時，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動；當進入小孔膠時，分子量大的蛋白質(zhì)移動速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的區(qū)帶。這就是常說的濃縮效應(yīng)和分

25、子篩效應(yīng)。同時，在制備上層膠(濃縮膠)和下層膠(分離膠)時，采用兩種緩沖體系；上層膠pH=6.76.8，下層膠pH8.9；TrisHCI緩沖液中的Tris用于維持溶液的電中性及pH，是緩沖配對離子；CI-是前導(dǎo)離子。在pH6.8時，緩沖液中的Gly-為尾隨離子，而在pH8.9時，Gly的解離度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進而達到控制其有效遷移率之目的。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在進入分離膠后，各種蛋白質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場中達到有效的分離。 如果在

26、聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)，由于SDS帶有大量的負電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強還原劑如巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合，形成帶負電性的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物；此時，蛋白質(zhì)分子上所帶的負電荷量遠遠超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場中移動得愈快；反之，愈慢。蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率之間的關(guān)系是：Mr=K(10-bm) logMr=LogKbRm，式中 Mr 蛋白質(zhì)的分子量；logK截距；b斜率；Rm 相對遷移率。實驗證明，蛋白質(zhì)分子量在15

27、,000200,000的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)之間呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)的相對遷移率Rm蛋白質(zhì)樣品的遷移距離染料(溴酚藍)遷移距離。這樣，在同一電場中進行電泳，把標準蛋白質(zhì)的相對遷移率與相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量對數(shù)作圖，由未知蛋白的相對遷移率可從標準曲線上求出它的分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定蛋白質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點，是目前一般實驗室常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。三、試劑及主要器材1主要試劑1)標準蛋白混合液內(nèi)含：磷酸化酶(Mw 94,000)，牛血清蛋白(Mw 67,000)，肌動蛋白(Mw 43,000)，磷酸酐酶(Mw 30,000)和

28、溶菌酶(Mw 14,000)2)30凝膠貯備液：Acr 30g，Bis 0.8g,加蒸餾水至100mL3)分離膠緩沖液(1.5molL): Tris 18.15g,加水溶解,6mol/L HCl調(diào)pH8.9,定容100mL4)濃縮膠緩沖液(0.5molL): Tris 6g,加水溶解，6mol/L HCl調(diào)pH6.8，并定容到100mL5)電極緩沖液(pH8.3)：SDS lg，Tris 6g，Gly 28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用時稀釋五倍。6)10SDS7)10過硫酸銨(新鮮配制)8)1TEMED9)上樣緩沖液：0.5molL Tris-HCl pH6.8 1.25mL，50

29、甘油4mL，10SDS 2mL，巰基乙醇0.4mL，0.1溴酚藍0.4mL，加蒸餾水定溶至10mL。10)0.25考馬斯亮藍R-250染色液：考馬斯亮藍R-250 1.25g，50甲醇454mL，冰乙酸46mL。11)脫色液：冰乙酸 35mL，蒸餾水465 mL。12)未知分子量的蛋白質(zhì)樣品(1mgmL )2實驗器材1) DYCZ-24D垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠)2) 電泳儀3) 長滴管及微量加樣器4) 燒杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培養(yǎng)皿(15cml5cm)5) 注射器等四、實驗操作1 裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩

30、塊玻璃立起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適中程度, 即可灌膠。2 凝膠的聚合 分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10的分離膠和4.8的濃縮膠。試劑名稱10%的分離膠/mL4.8%的濃縮膠/mLAcr/Bis 30%分離膠緩沖液（pH8.9）濃縮膠緩沖液（pH6.8）10%SDS10%過硫酸銨水TEMED53.7500.150.1511.601.250.10.14.951按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止,約5mL。然后用細滴管或注射器仔細

31、注入少量水,約0.5-1mL。室溫放置聚合30-40min。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，按上表制備濃縮膠。用長滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子(梳子)；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子。3蛋白質(zhì)樣品的處理 若標準蛋白質(zhì)或欲分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lmL 0.5molL pH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸餾水中；若樣品是液體，要測定蛋白質(zhì)濃度，按1.01.5mgmL溶液比例，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實驗所用樣品為1520mg的標準蛋白樣品溶液，放置在0.5mL的離心管中，加入1520ml的樣品處理液。在100水浴中處理2min，冷卻

32、至室溫后備用。 吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品20ml，按照標準蛋白的處理方法進行處理。4 加樣SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板,上提斜插板使其松開,然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠框,注意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個夾緊力,再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽,插入斜板,將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上,外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可,注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。 加樣時可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準確定位加樣位置，或用微量注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣，各加1015ml(含蛋白質(zhì)1015mg)，稀溶液可加2030ml (還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握)。 5電泳

33、加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，樣品進膠前電流控制在1520mA，大約1520min；樣品中的溴酚藍指示劑到達分離膠之后，電流升到3045mA，電泳過程保持電流穩(wěn)定。當溴酚藍指示劑遷移到距前沿12cm處即停止電泳，約1-2小時。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。6染色、脫色 電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標志，放入大培養(yǎng)皿中染色，使用0.25的考馬斯亮藍染液，染色24h，必要時可過夜。 棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，

34、經(jīng)常換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止。7結(jié)果處理1)測量脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質(zhì)樣品移動距離(即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔的距離)，測量指示染料遷移的距離。2)按以下公式計算蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率(Rm)相對遷移率樣品遷移距離(cm)染料遷移距離(cm)3)標準曲線的制作：以各標準蛋白質(zhì)相對遷移率為橫坐標，蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為 縱坐標在半對數(shù)坐標紙上做圖，得到一條標準曲線。4)測定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標準曲線上查得該蛋白質(zhì)的分子量。五、思考題1 聚丙烯酰胺盤狀凝膠電泳的幾個不連續(xù)性是什么？2 電泳時的三個物理效應(yīng)是什么？是怎樣造成的？3 電泳后上下槽緩沖液可否混

35、合后再使用？為什么？4 上樣緩沖液中加入甘油的作用是什么？5 貯液配制及貯存應(yīng)注意什么？6 過硫酸銨、7%乙酸和考馬斯亮藍在實驗中有什么作用？實驗三：馬鈴薯多酚氧化酶制備及性質(zhì)實驗一、實驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)從組織細胞中制備酶的方法。2 掌握多酚氧化酶的作用及各種因素對其作用的影響。二、實驗原理多酚氧化酶是一種含銅的酶，其最適pH值為67。由多酚氧化酶催化的反應(yīng)，如以鄰苯二酚為底物，可以被氧化形成鄰苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化還原反應(yīng)可通過溶液的顏色的變化鑒定，這個反應(yīng)在自然界中是常見的，如去皮的馬鈴薯和水果變成褐色就是由于該酶作用的結(jié)果。多酚氧化酶的最適底物是鄰苯二酚（兒茶酚）。間苯二酚和對苯二酚

36、與鄰苯二酚的結(jié)構(gòu)相似，它們也可以被氧化為各種有色物質(zhì)。酶是生物催化劑，其催化活性易受各種因素的影響，如溫度、pH、底物種類、底物濃度、酶濃度以及抑制劑和蛋白質(zhì)變性劑等都會改變其生物催化活性。三、實驗器材1勻漿機2小刀，紗布，漏斗，其它玻璃器皿3離心機4冰箱5恒溫水浴四、材料與試劑1馬鈴薯20.1mol/L的NaF溶液: 將4.2g氟化鈉溶于1000mL水中。30.01mol/L的鄰苯二酚溶液:將1.1g鄰苯二酚溶解于1000mL水中,用稀NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.0,防止其自身的氧化作用。當溶液變成褐色時，應(yīng)重新配制。新配制的溶液應(yīng)貯存于棕色瓶中。4pH6.8的磷酸鹽緩沖液5. 5%三氯乙

37、酸溶液6. 硫脲7. 0.01mol/L的間苯二酚溶液:將0.11g間苯二酚溶解于100mL水中。80.01mol/L的對苯二酚溶液:將0.11g對苯二酚溶解于100mL水中。9固體硫酸銨1008HCl：19.2mL濃HCl加水稀釋到1000mL。110.2%和0.3%（V/V）的乳酸溶液。12. 0.5%的碳酸鈉溶液130.01的碳酸鈉溶液五、操作方法1多酚氧化酶的制備每三個小組一起，稱取150g馬鈴薯（新馬鈴薯可以不去皮），切塊后放入勻漿機，加入150mLNaF溶液，勻漿后用四層紗布過濾。各組分別量取50mL濾液置離心管中，于3500轉(zhuǎn)/min離心510min，取上清夜，加入固體硫酸銨16

38、g，溶解，于4放置30min，于3500轉(zhuǎn)/min離心15min，倒掉上清液，沉淀用15mL pH6.8的磷酸鹽緩沖液溶解，即為粗酶液，含有馬鈴薯多酚氧化酶。2多酚氧化酶的催化作用 按表1加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并記錄和分析原因。 表1 多酚氧化酶的催化作用試管號酶液鄰苯二酚水混勻后37保溫510min，觀察顏色變化115滴15滴215滴15滴315滴15滴3 多酚氧化酶的化學(xué)性質(zhì) 按表2加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并記錄和分析原因。表2 多酚氧化酶的化學(xué)性質(zhì)試管號酶液5三氯乙酸硫脲振蕩混勻后分別加入鄰苯二酚15滴，于37保溫10min，觀察顏色變化115滴215滴15滴315滴少許4底物專一性按

39、表3加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并記錄和分析原因。表3 多酚氧化酶的底物專一性試管號酶液鄰苯二酚間苯二酚對苯二酚混勻后37保溫510min，觀察顏色變化115滴15滴215滴15滴315滴15滴5底物濃度的影響按表4加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并記錄和分析原因。 表4 底物濃度的影響試管號酶液鄰苯二酚水混勻后37保溫1min，觀察顏色變化15滴1滴39滴25滴10滴30滴35滴40滴6酶濃度的影響按表5加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并記錄和分析原因。 表5 酶濃度的影響試管號酶液鄰苯二酚水混勻后37保溫2min，觀察顏色變化115滴15滴21滴15滴14滴7 氫離子濃度的影響按表6加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并

40、記錄和分析原因。管號123450.8% HCl40滴-0.3% 乳酸-40滴-0.2% 乳酸-40滴-0.01%碳酸鈉-40滴-0.5%碳酸鈉-40滴鄰苯二酚7滴7滴7滴7滴7滴酶液7滴7滴7滴7滴7滴混合后pH值1357937保溫5min，觀察顏色變化,確定最適pH值六、思考題1在酶制備過程中加入硫酸銨的目的是什么？2在多酚氧化酶性質(zhì)實驗中三氯乙酸和硫脲有什么作用？3該多酚氧化酶的最適pH值是多少？為什么？4通過實驗可知哪些因素會影響酶的催化活力？實驗四：堿性蛋白酶活力的測定（福林酚試劑法）一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)測定蛋白酶活力的方法。掌握分光光度計的原理和使用方法。學(xué)習(xí)繪制標淮曲線的方法。二、實驗

41、原理 福林酚試劑是磷鉑酸鹽與磷鎢酸鹽的混合物。它在堿性條件下不穩(wěn)定，能被酪氨酸中的酚基還原，生成鉑藍、鎢藍的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后產(chǎn)生的酪氨酸可與福林酚試劑反應(yīng)，所生成的藍色化合物可用比色法測定。三、實驗器材分光光度計恒溫水浴鍋冷凝器四、材料與試劑市售的堿性蛋白酶制劑。0.4mo/L碳酸鈉：42.4gNa2CO3用蒸餾水溶解定容到l000mL。 4mo1/L三氯醋酸：65.6g三氯醋酸用蒸餾水溶解，定容到1000 mL。2%酪蛋白：2.0g酪蛋白加40mL蒸餾水，加35滴濃氨水，于沸水浴上溶解。用pH11的硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖溶液定容到1000mL。pH11的硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖溶液：0

42、.1mol/LNaOH與0.05mol/LNa2B4O7等體積混合。福林酚試劑：50g鎢酸鈉(Na2W042H20)，12.5g鉑酸鈉(Na2Mo042H20)，350mL水，25mL 85磷酸，50mL濃鹽酸放入1000mL圓底燒瓶中，文火回流(保持微沸)10 h，撤下冷凝器，加150g硫酸鏗(Li2O4)，25mL水，混勻加溴水約5mL脫色。直至金黃色為止，再微沸15min，驅(qū)除殘溴，冷卻，用45號耐酸細菌漏斗過濾，定容到500mL，盛于洗干凈干燥的棕色瓶中，使用時以1：2稀釋。五、操作方法(1)樣品處理精確稱取粉制酶制劑1.0g用PH 11的硼酸鈉氫氧化鈉緩沖液溶解并定容到200ml,于

43、40浸取30min，濾紙過濾，取2ml濾液用PH11的硼酸鈉-氫氧化納緩沖液定容到50mL。(2)比色測定取10mL離心管4支分別加入稀釋筋液1.0mL。平行試驗3支 空白試驗1支 于40水浴預(yù)熱23min。 于40水浴預(yù)熱23min。加1.0mL 40預(yù)熱的2酪蛋 加2.0mL 0.4mol/L三氯醋酸40保白，于40反應(yīng)10min。 溫10min。加2.OmL 0.4mol/L三氯醋酸反 加l.0mL 2的酪蛋白，反應(yīng)15min應(yīng)15min過濾。 過濾。取過濾液1.0mL放入盛有5mL Na2C03溶液的試管中。加1.0mL l：2稀釋的福林酚試劑(此試劑應(yīng)最后加入)于40水浴發(fā)色20 m

44、in。7220型分光光度計在680nm比色，比色皿厚1cm。(3)比色常數(shù)(K)的求法將DL-酪氨酸于105烘2h，精確稱取0.1000g，加少量0.2mol/L鹽酸加熱溶解，用蒸餾水定容到1000mL(每毫升含DL-酪氨酸100.0 g)，取5支試管，按下表加樣。編號12345酪氨酸/ml00.20.40.60.8H2O/ml1.00.80.60.40.2Na2CO3/ml55555福林-酚/ml11111OD680搖勻于40發(fā)色20min，以0號管為空白，在680nm進行比色。以吸光度OD為縱坐標，以DL-酪氨酸含量(g)為橫坐標作一直線，可求出比色常數(shù)K單位吸光度值相當DL-酪氨酸的g數(shù)

45、，見示意圖1。圖1 DL-酪氨酸標準曲線示意圖(4)計算活力單位規(guī)定：在pH11，40，1min內(nèi)產(chǎn)生1mg酪氨酸的酶量(g)為一個活力單位?？偦盍?U/g)KOD稀釋倍數(shù)式中 K為比色常數(shù)，DL酪氨酸g吸光度；OD吸光度；稀釋倍數(shù)200 50/2； 4酶活測定液的稀釋倍數(shù)；10酶促反應(yīng)時間，min。六、思考題1. 0.4mol/L碳酸鈉、0.4mol/L三氯醋酸溶液的作用是什么?2. 為什么要把反應(yīng)條件控制在pH值為11、溫度為40?3. 稀釋的酶溶液是否可以長期使用?為什么?實驗五：植物組織中DNA和RNA的提取和鑒定一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握從植物組織中分離核酸的原理和操作方法。學(xué)習(xí)和掌握測

46、定核酸含量的定糖法（苔黑酚法和二苯胺法）的原理及操作方法。二、實驗原理核酸是生物體內(nèi)的主要化學(xué)成分，核酸在生物體內(nèi)主要以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA主要存在與在細胞核中，RNA主要存在于細胞質(zhì)中。用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子物質(zhì)。再由有機溶劑如乙醇、乙醚等抽提，去除脂溶性的磷脂等物質(zhì)。最后用濃鹽溶液（10%氯化鈉溶液）和0.5mol/L高氯酸（70）分別提取DNA 和RNA。由于核酸和脫氧核糖核酸有特殊的顏色反應(yīng)，經(jīng)顯色后所呈現(xiàn)的顏色深淺在一定范圍內(nèi)和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比。因此可用定糖法來

47、定性定量測定核酸。 核糖的測定：測定核糖的常用方法是苔黑酚法（3，5二羥基甲苯，即Orcinol反應(yīng)）。當含有核糖的RNA與濃鹽酸及3，5二羥基甲苯在沸水水浴中加熱1020min后，有綠色物產(chǎn)生，這是因為RNA脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3，5二羥基甲苯作用生成綠色物質(zhì)。RNA+濃硫酸+ 綠色化合物注意：DNA、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。 脫氧核糖的測定：測定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱后，產(chǎn)生藍色。這是因為DNA嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成-羥基-6-酮基戊醛，再與二苯胺作用產(chǎn)生藍色物質(zhì)。DNA+少量濃硫酸或冰

48、乙酸+ 藍色物質(zhì)注意：DNA、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。此法易受多種糖類及其衍生物和蛋白質(zhì)的干擾。上述兩種定糖的方法準確性較差，但快速簡便，能鑒別DNA和RNA，是鑒定核酸、核苷酸的常用方法。三、實驗器材 恒溫水浴 電爐 布氏漏斗裝置 移液管 燒杯 量筒 剪刀 研體四、材料和試劑 新鮮菜花 95%乙醇 丙酮 5%高氯酸溶液 0.5mol/L三氯酸溶液 10%氯化鈉溶液 標準RNA溶液（5mg/100mL） 標準DNA（15mg/100ml） 粗氯化鈉 海沙 二苯胺試劑：將1g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，再加入2.75mL濃硫酸（置冰箱中可保存6個月。使用后，在室溫下?lián)u勻）。 三氯

49、化鐵濃鹽酸溶液：將2ml10%三氯化鐵溶液（用FeCl36H20配制加入到）400mL濃鹽酸中。五、操作方法 1. 核酸的分離 取菜花的花冠20g，剪碎后置于研缽中。加入20mL 95乙醇和少量誨砂，研磨成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。 向濾渣中加入20mL丙酮，攪拌均勻,抽濾，棄去濾液。 再向濾渣中加人20mL丙酮，攪拌5min后抽濾(用力壓濾渣，盡量除去丙酮)。 在冰鹽浴中，將濾渣懸浮在預(yù)冷的20mL 5高氯酸溶液中攪拌抽濾棄去濾液。 特濾渣懸浮于20mL 95乙醇中，抽濾，棄去濾液。 濾渣中加入20mL丙酮，攪拌5min。抽濾至干用力壓濾渣盡量除去丙酮。 將干燥的濾渣重新懸浮在40

50、ml10氯化鈉溶液中，在沸水浴中加熱15mln，放置、冷卻，抽濾至干，留濾液，并將此操作重復(fù)進行一次。將兩次濾液合并，為提取物一。 將濾渣重新懸浮在20mL 0.5mol兒高氯酸溶液中。加熱到70。保溫20 min(恒溫水浴)后抽濾。留濾液為提取物二。 2DNA和RNA的定性鑒定二苯胺反應(yīng)：按表1加入各種試劑，反應(yīng)后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)果。表1 二苯胺反應(yīng)加入試劑管號12345蒸餾水/ml1-DNA溶液/ml-1-RNA溶液/ml-1-提取物一/ml-1-提取物二/ml-1二苯胺試劑/ml22222放沸水浴中10min后的現(xiàn)象苔黑酚反應(yīng)：按表2加入各種試劑，反應(yīng)后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)果。表2 苔黑酚反應(yīng)加入試劑管號12345蒸餾水/ml1-DNA溶液/ml-1-RNA溶液/ml-1-提取物一/ml-1-提取物二/ml-1三氯化鐵濃鹽酸溶液/ml22222苔黑酚乙醇溶液/ml0.20.20.20.20.2放沸水浴中10-20min后的現(xiàn)象根據(jù)現(xiàn)象分析提取物一和提取物二中主要含有什么物質(zhì)?六、思考題1核酸分離時為什么要除去小分子物質(zhì)和脂類物質(zhì)？本實驗是怎樣除掉的？2運用本實驗方法是否可以提取到能夠進行其他生物實驗用的核酸材料?3快速鑒別RNA和DNA的方法是什么?實驗六：糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定一、實驗?zāi)康牧私馓墙徒膺^程的某一中間步驟及利用抑制劑來研究中間代謝的方