單核苷酸多態(tài)性snp實(shí)驗(yàn)_W

1、單核苷酸多態(tài)性（SNP）實(shí)驗(yàn)SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計(jì)，在人類基因組中，大約每千個(gè)堿基中有一個(gè) SNP，無(wú)論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標(biāo)記(STR)，都要廣泛得多。實(shí)驗(yàn)方法原理：SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計(jì)，在人類基因組中，大約每千個(gè)堿基中有一個(gè) SNP，無(wú)論是比較于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析還

2、是微標(biāo)記(STR)，都要廣泛得多。SNP 是我們考察遺傳變異的最小單位,據(jù)估計(jì)，人類的所有群體中大約存在一千萬(wàn)個(gè)SNP 位點(diǎn)。一般認(rèn)為，相鄰的 SNPs 傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的 SNP 等位位點(diǎn)稱作單體型（haplotype）。大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個(gè)常見(jiàn)的單體型（每個(gè)具有至少 5%的頻率），它們代表了一個(gè)群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。一個(gè)染色體區(qū)域可以有很多 SNP 位點(diǎn)，但是我們一旦掌握了這個(gè)區(qū)域的單體型，就可以只使用少數(shù)幾個(gè)標(biāo)簽 SNPs(tagSNP)來(lái)進(jìn)行基因分型，獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。實(shí)驗(yàn)材料：組織樣品試劑、試劑盒：液氮、PB

3、S、GA 緩沖液、GB 緩沖液、蛋白酶K、無(wú)水乙醇、蛋白液、漂洗液等儀器、耗材：離心管、離心機(jī)、廢液收集管、吸附柱、水浴鍋、分光光度計(jì)、低溫冰箱等實(shí)驗(yàn)步驟：一、DNA 抽提1.取新鮮肌肉組織約 100 mg，PBS 漂洗干凈，置于 1.5 ml 離心管中，加入液氮，迅速磨碎。2.加 200 l 緩沖液 GA，震蕩至徹底懸浮。加入 20 l 蛋白酶 K（20 mg/ml）溶液，混勻。3.加 220 l 緩沖液 GB，充分混勻，37消化過(guò)夜，溶液變清亮。加 220 l 無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。4.將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）1

4、2 000 rpm 離心 30 秒，棄掉廢液。5.加入 500 l 去蛋白液 GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。6.加入 700 l 漂洗液 GW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入 500 l 漂洗液 GW，12 000 rpm 離心 30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12 000 rpm 離心 2 分鐘，盡量除去漂洗液。7.將吸附柱 CB 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，加入 100 l 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應(yīng)在60-70水浴預(yù)熱），混勻，室溫放置 15 分鐘，12 000 r

5、pm 離心 30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液 50 l 加入吸附柱中，室溫放置 15 分鐘，12 000 rpm 離心 30 秒。8.采用 Beckman DU 640 spectrophotometer 檢測(cè)提取到的基因組 DNA 濃度，在OD260 處有顯著吸收峰。同時(shí)檢測(cè)純度，OD260/280 的值應(yīng)為為 1.7-1.9。9.從原液中取出相應(yīng)體積 DNA 溶液，稀釋致 50 ng/ul，原液置于-70保存，稀釋液置于-20保存。二、 PCR 擴(kuò)增目的片段1.按相關(guān)的試劑說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)管中準(zhǔn)備反應(yīng)體系，典型的 PCR 反應(yīng)體系如下（20 ul體系）：2.向左扳動(dòng)儀器蓋子上的手柄，揭開(kāi)儀

6、器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應(yīng)樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。三、 在 T1 型 PCR 儀上編輯一個(gè)程序1.按C programs進(jìn)入編輯模式。要在主目錄中創(chuàng)建一個(gè)程序請(qǐng)按D enter。要進(jìn)入一個(gè)子目錄，用鍵將光標(biāo)向右移動(dòng)，然后用鍵選擇一個(gè)子目錄。按D enter進(jìn)入選擇的子目錄。2.輸入程序中要求的溫度：用D enter確認(rèn)溫度。為其輸入時(shí)間，用小數(shù)點(diǎn)來(lái)間隔。順序?yàn)?h.m.s。用D enter確認(rèn)時(shí)間設(shè)置，或者用光標(biāo)鍵移動(dòng)到下一個(gè)區(qū)域。表示循環(huán)的次數(shù)。設(shè)定循環(huán)值=總循環(huán)值-1，即，總循環(huán)數(shù)為 30 時(shí)應(yīng)輸入“29”。用C pgm o

7、k來(lái)儲(chǔ)存一個(gè)完整的程序。程序數(shù)據(jù)永久的儲(chǔ)存在記憶中。四、運(yùn)行程序按B start/stop選擇一個(gè)程序。用鍵選擇一個(gè)子目錄，或者用D enter進(jìn)入主目錄。輸入您想要啟動(dòng)的程序的號(hào)碼。或者，按A list在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個(gè)程序。用鍵在列表中滾動(dòng)選擇。用D enter確認(rèn)用強(qiáng)光突出的程序。按D start啟動(dòng)程序。五、控制測(cè)試過(guò)程運(yùn)行過(guò)程中，按 A 按鈕，可以獲得程序剩余的時(shí)間信息。運(yùn)行完成后，按 STOP 按鈕終止實(shí)驗(yàn)，按 YES 確認(rèn)終止。小心旋開(kāi)熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開(kāi)蓋子，取出實(shí)驗(yàn)樣品，再蓋上蓋子，關(guān)閉電源，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束。六、PCR 產(chǎn)物測(cè)序由專門負(fù)責(zé)測(cè)序的服務(wù)公司完成。七、數(shù)據(jù)分析少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對(duì)發(fā)現(xiàn)的 SNP 在基因組中的位置：重點(diǎn)是啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)域（包括編碼區(qū)的 cSNP 及 5及 3UTR）、剪切邊界等，子的改變是否導(dǎo)致氨基酸的改變：錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、終止突變。注意事項(xiàng)：1.為保證待測(cè)目的區(qū)域測(cè)序真實(shí)可靠，引物設(shè)計(jì)應(yīng)該使待測(cè)目的區(qū)域邊界距離上下游引物至少各 50 bp；2.引物設(shè)計(jì)建議使用在線方式，以保證成功率；3.為保證測(cè)序敏感性，PCR 產(chǎn)物片段大小應(yīng)在 250 bp650 bp 范圍；4.為方便實(shí)驗(yàn)，建議引物合成時(shí)分裝成 1