簡述真核生物斷裂基因在大腸桿菌表達的基本實驗步驟

1、簡述真核生物斷裂基因在大腸桿菌表達的基本實驗步驟真核基因在大腸桿菌中的表達形式一般可分為3 類: ( 1) 細胞內(nèi)不溶性表達, 即以包涵體形式存在;( 2) 細胞內(nèi)可溶性表達; ( 3) 蛋白分泌型表達。下面分別予以討論:1. 細胞內(nèi)不溶性表達細胞內(nèi)表達的最大問題就是形成不溶性的包涵體, 包涵體是細菌表達的蛋白質在胞內(nèi)互相凝集而形成的無活性固體顆粒, 具有很強的折光性。其形成的原因有: 目的基因的過度表達, 使蛋白質無足夠時間進行肽鏈折疊, 產(chǎn)生凝集; 種種原因引起的蛋白質不能正確折疊; 蛋白質的性質及溫度、pH 值等環(huán)境條件的影響等。近年來基于蛋白質折疊理論的研究, 普遍認為, 許多蛋白質的

2、天然構象并不是自發(fā)地一步折疊而成, 而是在一些輔助蛋白的協(xié)助下經(jīng)許多中間態(tài)逐步形成。包涵體的形成, 是由于肽鏈折疊過程中部分折疊的中間態(tài)之間的特異性錯誤聚合, 而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。包涵體的形成對表達產(chǎn)物的活性不利, 但卻有利于蛋白質的純化。1. 1包涵體的分離: 為了獲得包涵體, 常采用機械法破碎菌體, 如高壓均質機和超聲波破碎, 也可加溶菌酶超聲波相結合。菌體破碎后, 經(jīng)洗滌、離心( 5 00020 000 r/ min, 15 min) 分離, 即得包涵體。1. 2包涵體的溶解: 通常采用變性劑。對絕大多數(shù)包涵體而言, 在pH8. 0 條件下, 68 mo l/ L 尿

3、素或58 mol / L 鹽酸胍即可將其溶解。另外, 去垢劑、有機溶劑、堿性環(huán)境( pH 9. 0)也可使包涵體溶解。如包涵體中蛋白含兩個以上二硫鍵, 則還需加入還原劑如2-巰基乙醇和2-巰基蘇糖醇等, 使二硫鍵處于可逆斷裂狀態(tài)。1. 3重組蛋白的復性: 包涵體溶解后, 其結合的蛋白互相分離, 呈變性狀態(tài), 即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞, 但一級結構保持完好, 因此去除溶解劑時, 一部分蛋白可自動折疊成具有活性的正確構型, 這一過程即復性。目前復性方法主要有稀釋法、透析法和層析法( 或超濾) 。對于具有二硫鍵的重組蛋白, 復性時還涉及到二硫鍵的正確重組。一般用空氣中的氧氣即可使還原型半胱氨酸殘

4、基形成二硫鍵, 也可加入微量硫化物如2-巰基乙醇、氧化型和還原型谷胱甘肽, 促進正確二硫鍵的形成。2. 細胞內(nèi)可溶性表達2. 1共表達分子伴侶和折疊酶: 為了克服包涵體的形成, 常用的策略是在表達外源基因的同時, 共表達分子伴侶和折疊酶。分子伴侶( Chapero nes) 是細胞內(nèi)催化及維持其它蛋白正確構象的一類蛋白質分子, 它們識別、結合和穩(wěn)定部分折疊的蛋白中間體, 避免不適當?shù)姆肿娱g及分子內(nèi)作用, 但并不催化二級結構形成。大腸桿菌的分子伴侶有GroES/ GroEL、Dnak/ DnaJ、SecB、PapD 等。與分子伴侶不同, 折疊酶具催化異構作用, 限制蛋白變性速率。氧化還原酶Dsb

5、B 及肽脯氨酰異構酶( PPlase) 催化大腸桿菌中x-pro 肽鍵的異構反應。非受體蛋白酪氨酸激酶在大腸桿菌中表達多形成包涵體。Caspers 等將酪氨酸激酶Csk、Fyn 或Lck 等非受體蛋白與DnaK、DnaJ、GrpE 或GroEL、GroES 等共表達, 得到了可溶蛋白。2. 2表達融合蛋白: 目的蛋白與具強親和力配體的多肽或蛋白構成重組融合蛋白, 然后利用固定化親和層析方法純化該蛋白。C-MyC 表位抗原和同感生物素序列分別與目的蛋白基因融合后, 利用親和層析分離純化目的蛋白。金屬親和層析( IMAC) 基于固定化的金屬離子與蛋白上供電子基團的親和作用。半胱氨酸、組氨酸、色氨酸

6、和精氨酸側鏈多用于IMAC 結合。單個組氨酸融合于LgG1k 重鏈, IMAC 一步純化重組Fab 片段。McCoy 等還發(fā)現(xiàn)11 種不同的淋巴因子分別與thior tdox in 構成融合蛋白, 在低溫下以溶解狀態(tài)高水平表達, 其中幾種融合蛋白具有天然蛋白的生物活性。此外, 還可通過改變發(fā)酵條件, 如降低發(fā)酵溫度, 加入不能代謝的糖, 降低培養(yǎng)基的pH 值等等,來減少重組蛋白的聚集進而改善溶解性。3.蛋白分泌型表達: 蛋白分泌型表達又可根據(jù)表達場所的不同分為周質分泌表達和胞外分泌表達。3. 1周質分泌表達: 是通過將外源基因融合到編碼原核蛋白的信號肽序列的下游而實現(xiàn), 當?shù)鞍踪|分泌到位于大腸

7、桿菌細胞內(nèi)膜與細胞外膜之間的周質時, 信號肽可被信號肽酶切除, 而獲得具有天然一級結構的產(chǎn)物。同時氧化性的周質間隙可以模擬真核細胞的內(nèi)質網(wǎng)環(huán)境, 便于新生肽鏈折疊成天然結構, 從而獲得具有完全生物活性的重組蛋白。此外, 一些可被細胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白質在周質中穩(wěn)定性提高。周質分泌亦存在一些問題, 如表達量低, 僅占細菌總蛋白的0. 3% 4% ; 信號肽不被切割或不在特異位置切割等。3. 2胞外分泌表達: 重組蛋白分泌到胞外可以使二硫鍵正確折疊, 避免蛋白質在胞內(nèi)聚集, 形成包涵體, 而且還可使重組蛋白的下游純化較為簡單, 便于大規(guī)模放大處理。目前, 使異源蛋白分泌到培養(yǎng)基的系統(tǒng)主要有A-溶血素( haemolysin A,HLy A ) 系統(tǒng)和細菌素釋放蛋白( bacteriocin releasepr otein, BRP) 系統(tǒng)。HLyA 系統(tǒng)是將真核基因融合在HLyA 的N 端, 利用HLyA 能直接從胞內(nèi)轉運到胞外的特點, 將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中。陳燕等將胰島素原基因融合到金黃色葡萄球菌蛋白A 的基因上, 構建成大腸桿菌中基因融合的外分泌表達載體, 它能高效表達, 且有效地分泌表達產(chǎn)