7重組子的篩選與鑒定.ppt

1、基因工程,第七節(jié) 重組子的篩選與鑒定,一、重組子的篩選,轉(zhuǎn)化子：將導入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的細胞稱為轉(zhuǎn)化子。 重組子：含有DNA分子的轉(zhuǎn)化子成為重組子。,1. 根據(jù)載體選擇標記基因初步篩選轉(zhuǎn)化子,一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的受體細胞接種在合適的選擇藥物的培養(yǎng)基上在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長的狀況即可挑選出轉(zhuǎn)化子。,(插入失活法) 抗藥性標記選擇,1. 根據(jù)載體選擇標記基因初步篩選轉(zhuǎn)化子,選擇培養(yǎng)基：是根據(jù)需要檢測細胞的類型配制的培養(yǎng)基，對于細菌受體細胞而言，通常用LB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基上加入適量的某種選擇藥物即為選擇培養(yǎng)基。 選擇藥物：由載體DNA分子上攜帶的選擇標記基

2、因所決定，多與標記基因的遺傳表型相對應，主要有抗菌素和顯色劑等。,（1）根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子,利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標記基因進行的篩選方法，多用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選。 氨芐青霉素：Ap或Amp，含bla基因的菌體能轉(zhuǎn)譯-丙酰氨酶，可降解Ap，抗Ap菌落的選擇劑為終濃度3050ng/ml，貯存液為25mg/ml水溶液。,（1）根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子,氯霉素：Cm，Cmp，含Cat基因的菌體能轉(zhuǎn)譯氯霉素乙酰轉(zhuǎn)?；福笴m乙?；А？笴m菌落的終濃度為30g/ml，貯存液為34mg/ml乙醇溶液。 卡那霉素：Km，kan，含ka

3、n抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯能修飾km的酶，阻礙Km對核糖體的干擾，抗Km菌落的終濃度為5g/ml，貯存液為25mg/ml水溶液。,（1）根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子,鏈霉素：Sm，Str，含Str抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯一種能修飾Sm的酶，抑制Sm與核糖體的結(jié)合，抗Sm菌落的終濃度為25g/ml，貯存液為20mg/ml水溶液。 四環(huán)素：Tc，Tet，含Tc抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯能改變細胞膜的蛋白，防止Tc進入細胞后干擾細菌蛋白質(zhì)的合成，抗Tc菌落的終濃度為12.515.0g/ml，含Tc培養(yǎng)基中不可加Mg鹽，因Mg 鹽拮抗Tc，貯存液為12.5mg/ml乙醇-水溶液，含Tc溶液與培養(yǎng)液均應

4、在暗處存放。,（1）根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子,挑選轉(zhuǎn)化子菌落時，必須根據(jù)轉(zhuǎn)化處理時對照處理組菌落生長情況來定。 一般DNA對照組和感受態(tài)細胞對照組不應生長菌落，而感受態(tài)細胞有效性對照組應長菌落，如其中一項不符，就有出現(xiàn)假轉(zhuǎn)化子菌落的可能，這樣的菌落不宜作為轉(zhuǎn)化子，而用于進一步實驗材料。 如用Tc，Cm，Ap等選擇藥物，觀察和確定轉(zhuǎn)化子時間不宜過長1316h為宜，否則會現(xiàn)假轉(zhuǎn)化菌落。藥物的自然降解也出現(xiàn)假菌落。,（2）插入失活篩選法利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性繼續(xù)篩選,用（1）的篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中同時包括需要的重組子，也含有非必需的非重組子 方法：將Apr的轉(zhuǎn)化子影印至含抗

5、生素Tc的平板上。由于外源DNA片段插入載體DNA的BamHI位點導致載體Tcr基因失活，因此帶選擇的重組子含有Apr Tcs的遺傳表型，而非重組子則為AprTcr。 即重組子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成菌落，而非重組子在這兩種平板上都能形成菌落，比較兩種平板上對應的轉(zhuǎn)化子的生長狀況，即可Ap板上挑出重組子。,（3）插入表達篩選法利用目的基因插入載體后能激活標記基因而篩選,與（2）法相反，該法是利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標記基因的表達，由此進行轉(zhuǎn)化子的篩選。 有些載體在設(shè)計時，在篩選標記基因年前面加上一段負調(diào)控序列，當插入失活該負調(diào)控序列時，其下游的篩選標記基因才

6、能表達。,（4）顯色篩選法,常用的顯色劑是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)。 具有完整的乳糖操縱子的菌體能轉(zhuǎn)譯-半乳糖苷酶、透過酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶，當培養(yǎng)基中存在誘導物IPTG（異丙基-D-半乳糖苷）和x-gal時，可產(chǎn)生藍色沉淀物，使菌體成為藍色，如果在載體DNA上組入lacZ部分缺失的片段lacZ，則重組DNA分子轉(zhuǎn)化lacZ互補型菌株，則在含有x-gal和IPTG的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子是藍色菌落，而lacZ得到的轉(zhuǎn)化子是白色菌落。,藍白篩選示意圖,藍-白篩選 利用藍色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細菌。,載體：編碼-半乳糖 宿主： 編碼-半乳糖 苷酶N端序列

7、苷酶C端序列,-互補,細菌表達： -半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） 形成藍色菌落,當在質(zhì)粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活 不能與宿主-半乳糖苷酶的C端進行-互補產(chǎn)生白色菌落。,（IPTG 存在下）,（5）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞,報告基因：在植物轉(zhuǎn)基因中，載體攜帶的選擇標記基因經(jīng)常稱為報告基因。 在有選擇壓力的情況下，可利用報告基因在受體細胞內(nèi)的表達而篩選轉(zhuǎn)化細胞；同時，報告基因可以和某些目的基因構(gòu)成嵌合基因，通過報告基因的表達了解目的基因的表達情況及推測基因調(diào)控序列，常用的報告基因有抗生素抗性基因及編碼某些酶類或其它特殊產(chǎn)物的基因等。, -葡萄糖酸苷

8、酶（Gus）基因,Gus基因最早是從E.coli 12中克隆出來的，能編碼穩(wěn)定的Gus產(chǎn)物。與抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正選擇標記。 作為報告基因的重要依據(jù)：作為一種水解酶，轉(zhuǎn)化植物細胞所產(chǎn)生的-葡萄糖酸苷酶，能夠催化某些特殊反應的進行，通過熒光、分光光度和組織化學的方法對這些特殊反應產(chǎn)物的檢測，即可確定gus報告基因的表達情況，從而區(qū)分是否是轉(zhuǎn)化子。, -葡萄糖酸苷酶（Gus）基因,例如，Gus能夠催化裂解人工合成的底物4-甲基傘形花酮-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形花酮，通過熒光光度計進行定量測定。 Gus基因被廣泛用于植物轉(zhuǎn)化子篩選，尤其是在進行外源基因瞬間表達系統(tǒng)中

9、。,轉(zhuǎn)基因番茄葉片 陰性對照, -葡萄糖酸苷酶（Gus）基因,gus基因的3端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達，產(chǎn)生的融合蛋白中仍有Gus活性，利用組織化學分析等可以定位外源基因在不同的細胞、組織和器官類型以及發(fā)育時期的表到情況，這是其它報告基因所不及的。, 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT）基因,新霉素與卡那霉素慶大霉素均屬于氨基環(huán)醇類抗生素，結(jié)構(gòu)相似，能抑制原核細胞核糖體70s起始復合物的形成，從而阻礙蛋白質(zhì)的合成，抑制細胞生長。 Npt基因編碼序列來自大腸桿菌易位子Tn5，可催化ATP上-磷酸基因轉(zhuǎn)移到抗生素分子的某些基因上，從而阻礙抗生素分子與靶位點的結(jié)合，并使抗生素失活。, 新霉

10、素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT）基因,故在含有抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物轉(zhuǎn)化材料，僅有攜帶NPT基因的轉(zhuǎn)化植物細胞才能活下來，由此區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。 NPT基因在多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物上應用廣泛。 缺點：受體細胞通常具有較高的非特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶底物，篩選時假陽性序列較多， NPT酶活一般是通過卡那霉素與-32pATP的原位磷酸化來檢測。, 熒光素酶（LUC）基因,Luc是一種源于螢火蟲的動物蛋白基因產(chǎn)物，能夠催化生物發(fā)生熒光反應。Luc在Mg2+的作用下，可與熒光素和ATP底物反應，使熒光素轉(zhuǎn)變?yōu)樘幱诩せ顮顟B(tài)的氧化熒光素，同時發(fā)射光子，利用熒光測定儀可快速檢測，故可作為報告基因 。 Luc基因在植物細胞內(nèi)正常

11、表達，可用于監(jiān)測各種啟動子活性，測定與Luc基因嵌合的目的基因的表達情況，也用于調(diào)控序列和基因的組織特異性表達。, 熒光素酶（LUC）基因,特點：迅速，靈敏，成本低，不存在放射性同位素對人體健康和環(huán)境生態(tài)危害，也無內(nèi)源熒光產(chǎn)生的背景干擾，故Luc是一種理想的報告基因。,叩頭蟲和不同克隆的LUS表達的不同顏色熒光。,插入了螢火蟲熒光素酶基因的煙草, 抗除草劑bar基因,Bar基因編碼PPT-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），能解除非選擇性除草劑的毒性，從而使轉(zhuǎn)基因植物細胞產(chǎn)生對除草劑的抗性，故可作為報告基因進行正向選擇。 用于植物轉(zhuǎn)基因研究工作。, 綠色熒光蛋白基因Gfp,綠色熒光蛋白在395nm波長下被激

12、發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，故可作為報告基因。其中水母gfp被廣泛用于篩選動植轉(zhuǎn)化子。, 冠癭堿（opine）合成酶基因,主要包括胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成酶基因。 在植物細胞中的表達產(chǎn)物可催化一些特殊反應，通過電泳分離及菲醌熒光染料染色后，即可觀察到產(chǎn)物的生成。 用于轉(zhuǎn)植物基因細胞的篩選。, 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Cat）基因,氯霉素可選擇性的與原核生物細胞50s亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶活性，最終抑制細胞生長。 Cat基因可以催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)乙?；孤让顾厥Щ?，故外源DNA與供轉(zhuǎn)化的Cat基因能使轉(zhuǎn)基因植物具有抗氯霉素的能力。, 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因,潮霉素原是一種鏈霉素的產(chǎn)物，能與70s和

13、50s核糖體的結(jié)合來抑制多種原核、真核生物的生長。 HPT酶能催化ATP上的磷酸集團轉(zhuǎn)移至潮霉素分子上，而使之失活，所以使用潮霉素基因作為報告基因，可賦予轉(zhuǎn)化植物細胞抗潮霉素的能力。 但潮霉素能夠致瘤，因而操作時應慎重。,（6）利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞,即核苷酸合成代謝酶基因缺失互補。 前已述及的植物轉(zhuǎn)化子篩選的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因也可用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞的篩選。此外還有以下方法：, 胸腺激酶（TK）基因,胸腺激酶能把胸苷轉(zhuǎn)化為胸苷磷酸，以保證核苷酸的順利合成，其編碼基因（tk）幾乎在所有的真核細胞中都能有效表達，故tk可作為遺傳選擇記號，來確定哺乳動物的

14、基因轉(zhuǎn)移，相應的受體細胞為遺傳表型的缺陷型。 據(jù)轉(zhuǎn)化的方法不同，轉(zhuǎn)基因動物細胞的篩選方式分為HAT選擇法和共轉(zhuǎn)化選擇法兩種。, 胸腺激酶（TK）基因,HAT選擇法的原理： 利用培養(yǎng)基中的葉酸類似物氨基喋呤（APT）阻斷細胞核苷酸的合成途徑，啟動以次黃嘌呤為底物的補救合成途徑。該途徑不受APT的抑制，能繼續(xù)合成出所需核苷酸。 由于在HAT培養(yǎng)基中不加外源胸苷，通過TK酶的作用，tk+細胞能以其為底物合成出TTP，故tk+細胞可以存活，而tk-細胞不能合成而死亡。,二氫葉酸還原酶(DHFR)基因,DHFR催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，dhfr突變體細胞不能夠合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，故不

15、能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長。 但在常規(guī)培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤和胸苷，則突變體細胞可借助核苷酸的補救合成途徑維持生長。,黃嘌吟-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因,XGPRT是由大腸桿菌某些基因編碼的一種核苷酸代謝酶，哺乳動物缺失此酶，但卻存在次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ HGPRT ）。 XGPRT能有效地把黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃苷-磷酸，并最終形成鳥苷磷酸，而HGPRT只能利用次黃嘌呤和鳥嘌呤，并最終形成黃苷-磷酸（IMP），據(jù)此特性，可作為篩選哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的一種顯性選擇記號。,2. 營養(yǎng)缺陷型檢測法,根據(jù)目的基因在受體細胞中表達產(chǎn)物的性質(zhì)，篩選含目的基因的克隆子。 如果目的基因產(chǎn)物能夠降解某些

16、藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯色反應，則可根據(jù)抗性或顏色變化直接篩選含目的基因的克隆子。,3. 形成噬菌斑篩選法,對于DNA載體系統(tǒng)而言，外源DNA插入噬菌體載體后，重組DNA分子大小必須在野生型DNA長度的75105范圍內(nèi)，才可以在體外包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)導受體菌，在培養(yǎng)基上形成噬菌斑，未轉(zhuǎn)導的受體菌繼續(xù)正常生長，而區(qū)分開來。,3. 形成噬菌斑篩選法,如果在重組過程中使用的是取代型-載體，則噬菌斑中的-噬菌體即為重組子。因而空載的-DNA分子不能被包裝，難以進入受體細胞產(chǎn)生噬菌斑。 如果使用插入型-載體，由于空載的-DNA大于包裝下限，所以也能被包裝成

17、噬菌體顆粒并產(chǎn)生噬菌斑，此時篩選重組子可以利用-載體上的選擇標記基因（如lacZ等），當外源DNA片段插入lacZ基因內(nèi)時，重組噬菌斑無色透明，而非重組的噬菌斑則為藍色。,基因工程的最終目的是通過載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細胞中高效表達，產(chǎn)生有重要價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 克隆基因表達有三個條件 基因的編碼區(qū)不能被插入序列中斷; 基因轉(zhuǎn)錄要有啟動子，而啟動子必須能被宿主 細胞的RNA聚合酶有效地識別; mRNA必須相當穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外 源蛋白質(zhì)必須不為宿主細胞的蛋白酶所降解。,二、重組子的鑒定,1. 根據(jù)DNA分子的結(jié)構(gòu)特征鑒定重組子 （1）根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子 （2）限

18、制酶酶切重組DNA分子鑒定重組子 （3）利用PCR擴增篩選確定重組子 2. 核酸分子雜交檢測法 3.根據(jù) DNA核苷酸序列鑒定重組子 4. 免疫化學檢測法 5. 其他方法,（1）根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子,這是在轉(zhuǎn)化子初步篩選的基礎(chǔ)上進一步對重組子進行篩選和鑒定的一種方法，主要是根據(jù)有外源 DNA片段插入載體后的重組DNA與載體DNA之間的大小差異來鑒定重組子。 由于重組DNA是載體DNA中插入了外源DNA片段，其分子量大于載體DNA分子，在瓊脂糖凝膠板上出現(xiàn)的DNA帶中，落后的帶是重組DNA的帶。此方法只用于重組子的初步鑒定。,（1）根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子,此法直觀快捷，只需

19、獲得質(zhì)粒DNA分子的粗制裂解液即可進行瓊脂糖凝膠電泳 ，尤其適用于插入片段較大的重組子的篩選與初步鑒定。,酶切分析法 長度鑒定,（2）限制酶酶切重組DNA分子鑒定重組子,通過（1）法雖然可以初步篩選到重組子菌落，但卻難以將其中的期望重組子與非期望重組子區(qū)分。 因為重組質(zhì)粒DNA分子中，質(zhì)粒載體可能會與一個以上的外源DNA片段連接重組，而通過酶切法不僅可以進一步篩選鑒定重組子，而且能夠判別外源DNA片段的插入方向及分子質(zhì)量的大小。, 基本做法,從轉(zhuǎn)化菌落中隨機挑選出少數(shù)菌落，快速提取質(zhì)粒DNA，用限制酶酶解，并通過凝膠電泳分析來確定是否有外源基因插入及插入方向等。, 酶解方式主要有兩種,全酶解法

20、：用一種或兩種能夠?qū)⑼庠碊NA片段從重組質(zhì)粒上切割下來的限制酶酶解質(zhì)粒DNA，凝膠電泳后重組質(zhì)粒分子較單一載體質(zhì)粒多出一條泳帶。據(jù)此將重組子與非重組子區(qū)分開來。 如果插入片段與質(zhì)粒大小相近，則最好用合適的酶使之線性化，通過比較大小確定是否為重組子。進一步利用在外源DNA片段上具有識別位點的一種或幾種限制酶酶解重組質(zhì)粒分子，根據(jù)酶切圖譜分析即可判別插入片段的方向。, 酶解方式主要有兩種,部分酶解法：是用一種或數(shù)種限制酶對重組質(zhì)粒DNA分子進行部分酶解分析，據(jù)產(chǎn)生的限制性片段大小，來確定限制酶識別位點的準確位置及各片段的正確排列方式而進行篩選鑒定。 部分酶解法較全酶解法易行，兩者通常用于當載體和外

21、源DNA片段連接后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化菌落比任何一組對照連接反應（如只有酶切后的載體或只有外源DNA片段）都明顯多時的重組篩選。,（3）利用PCR擴增篩選確定重組子,在載體DNA分子中，外源DNA插入位點的兩側(cè)序列多數(shù)是已知的。通過與插入位點兩側(cè)已知序列互補的引物，已從初選出來的陽性克隆中提取的少數(shù)質(zhì)粒DNA為模板進行PCR反應，反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，如出現(xiàn)特異性擴增DNA帶，并且其分子量同預期的一致，則可確定此重組DNA分子的重組子即為期待的重組子。 PCR法不但可迅速擴增插入片段，而且可直接用于DNA序列測定。,2. 核酸分子雜交檢測法,（1）基本原理 具有一定同源性的兩條核酸(DNA或RN

22、A)單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下，可按堿基互補配對原則高度持異地復性形成雙鏈。 該技術(shù)也可用于重組子的篩選鑒定，雜交的雙方是待測的核酸序列和用于檢測的已知核酸片段(稱為探針)。這也是目前應用最為廣泛的一種重組子的篩選方法，只要有現(xiàn)成的DNA或RNA探針，就可以檢測克隆子中是否含有目的基因。,2. 核酸分子雜交檢測法,（2）基本做法 將待測核酸變性后，用一定的方法將其固定在硝酸纖維素膜(或尼龍膜)上，這個過程也稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移，然后用經(jīng)標記示蹤的特異核酸探針與之雜交結(jié)合，洗去其他的非特異結(jié)合核酸分子后，示蹤標記將指示待測核酸中能與探針互補的特異DNA片段所在的位置。,2. 核酸分子雜交檢測

23、法,（3）分類 核酸分子雜交檢測法實際上是一種依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征進行的重組子篩選方法。 根據(jù)待測核酸的來源以及將其分子結(jié)合到固相支持物上的方法不同，核酸分子雜交檢測法可分為菌落印跡原位雜交、斑點印跡雜交、Southern印跡雜文和Northern印跡雜交四類。,2. 核酸分子雜交檢測法,（4）核酸雜交的探針 DNA雜交探針：是指具有一定序列的核苷酸片段，它能與互補的核酸序列復性雜交，并且通過適當標記進行檢測。 核酸雜交探針的種類 A. 同源或部分同源探針： 是指與目的基因的部分序列完全互補的核酸探針，長度約為19-24個核苷酸。,B. 總cDNA探針：是利用逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，對生物細胞總的或經(jīng)

24、分離的poly(A) mRNA進行示蹤標記制備的，用于對高豐度的mRNA的cDNA克隆的篩選。 C. 特異性cDNA探針：利用某種方法從目的細胞中篩選獲得某些特異性的cDNA片段，一般用于篩選cDNA文庫中那些對應于低豐度的mRNA的目的克隆。 D. 人工合成的寡核苷酸探針：其序列是根據(jù)目的蛋白的一小段已知氨基酸序列推導合成出來的，用于基因組DNA文庫或cDNA文庫的篩選。,2. 核酸分子雜交檢測法,（5）探針標記法 32P、3H、35S等放射性標記物。 生物素、地高辛、熒光素、汞離子、金顆粒、銀顆粒等非放射性標記物。,多功能數(shù)字核輻射儀,輻射檢測儀,3.根據(jù) DNA核苷酸序列鑒定重組子,通過

25、以上方法確定重組子的重組 DNA 分子中含有外源 DNA 片段后，為了進一步肯定此外源 DNA 片段是(或者含有)預期的 DNA 片段(目的基因)，可以對外源 DNA 片段進行核苷酸序列的測定。 DNA序列測定，即核酸一級結(jié)構(gòu)的測定，簡稱DNA測序。對克隆DNA片段進行序列測定及分析，不僅可以直觀地鑒定出重組DNA分子中是否含有目的基因，也可以獲得目的基因的編碼序列和基因調(diào)控序列。,（1）發(fā)展史,1963年，Sanger等首次完成胰島素51個氨基酸序列測定； 1965年，Hlley等成功測定了酵母tRNAAla的75個核苷酸順序，同年Sanger提出了指紋圖譜法測定小RNA序列； 1975年，

26、Sanger首次設(shè)汁了利用DNA聚合酶進行聚合反應的所謂加減法DNA測序程序，這種方法的測定誤差率較高，但卻開辟了DNA測序的新思路； 1977年，Maxam等建立了一種用化學降解法分析DNA序列的程序，即化學直讀法，快速可靠，試劑簡單，測定了pBR322全部4363bp的DNA序列； 1977年，Sanger提出了雙脫氧鏈終止法DNA測序技術(shù)，是目前最為常用的DNA測序方法。,（2）DNA測序方法,DNA化學降解測序法，亦稱Maxam-Gilbert測序法； 雙脫氧鏈終止法，亦稱Sanger測序法； 大片段DNA的測序。,（3） DNA測序技術(shù)的發(fā)展,非放射性標記檢測物的使用 DNA測序自動

27、化 計算機在測序中的應用 現(xiàn)有技術(shù)的改進：,（3） DNA測序技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)有技術(shù)的改進： 以凝膠電泳為基礎(chǔ)的測序方法：DNA全自動序列分析系統(tǒng)包括單色熒光標記四泳道法和四色熒光標記單泳道法；超薄層板凝膠電泳激光熒光法；PCR測序技術(shù)；毛細管及列陣毛細管電泳激光熒光法（高效、快捷、加樣量少、靈敏度高、在線自動化檢測） 非電泳分離的測序方法：雜交法、原子探針顯微鏡法、流動式單分子熒光檢測法。,（1）酶聯(lián)免疫吸附法,機理： 酶免疫法和其他免疫方法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，其差別在于該法以酶或輔酶作為標記物，標記抗原或抗體，利用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。 其特點是利用聚

28、苯乙烯微量反應板（或球）吸附抗原或者抗體，使之固定化，在其中進行免疫反應和酶促反應。,（1）酶聯(lián)免疫吸附法,分類： 測定抗體的間接法 測定抗原的雙抗體夾心法 測定抗原的競爭法 捕獲法測定IgM抗體 ABS-ELISA法 PCR-ELISA法 斑點免疫酶結(jié)合試驗,（1）酶聯(lián)免疫吸附法,實驗過程： 包被：將已知抗原或抗體物理吸附到固相載體表面，使之固定化； 抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結(jié)合物，通過免疫反應而被結(jié)合固定； 酶促反應：在反應體系中加入酶、作用底物，使之發(fā)生酶促反應而顯色。,（2）Western印跡法,亦稱免疫印跡法，是在凝膠電泳技術(shù)和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫檢測技

29、術(shù)，結(jié)合了電泳分辨率高及免疫反應特異性強的雙重優(yōu)點，是目前蛋白質(zhì)研究中的重要手段之一。 該法原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標記物的抗體分子作為探針來檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子，結(jié)果為陽性的即為重組子。,（2）Western印跡法,程序過程： 蛋白質(zhì)樣品制備SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜標記抗體與膜上蛋白質(zhì)抗原雜交檢測并分析標記物信號,蛋白質(zhì)篩選法 用來檢測同DNA特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子的一種方法。 操作程序： 1. 用硝酸纖維素濾膜進行“噬菌斑轉(zhuǎn)移”，使其中的蛋白質(zhì)吸附在濾膜上； 2. 將濾膜同放射性標記的含有DNA結(jié)合蛋白質(zhì)編碼序列的雙鏈DNA寡核苷酸探針雜交； 3. 根據(jù)放射自

30、顯影結(jié)果篩選出陽性反應克隆。,（3）免疫沉淀測定法,該法是將抗體分子預先結(jié)合到磁珠等固相載體上，然后與含有目的蛋白的細胞裂解液進行液相雜交反應，利用磁場或離心等技術(shù)將結(jié)合在抗體上的蛋白質(zhì)收集起來，電泳分離，來鑒定重組子。 例如在長有轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)基中，加入目的基因產(chǎn)物相對應的標記抗體，如菌落產(chǎn)生與抗體相對應的抗原蛋白，則周圍就會出現(xiàn)抗原-抗體沉淀物，形成有色圓環(huán)。 該法操作簡便，但靈敏度不高，實用性較差。,（4）免疫熒光法（IF）,用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢樣本中抗原反應，在熒光顯微鏡下觀察，若出現(xiàn)復合物發(fā)光現(xiàn)象既可判定。 直接法：用熒光標記抗體/原檢測未知的抗原/體； 間接法：

31、用已知熒光標記的抗體檢測未知抗原。,（5）固相放射性免疫測定法（RIA）,該法是應用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學檢測轉(zhuǎn)化子，兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體的高特異性，可檢測靈敏度pg水平。 常用標記的放射性核素為125I和131I，可分為固相和液相兩種方法。 該法多用于測定微量物質(zhì)如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛、IgE等。,（5）固相放射性免疫測定法（RIA）,例如含有重組質(zhì)粒DNA的菌落，可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)B融合形成的雜種多肽A-B，如何從轉(zhuǎn)化子菌群中檢測出含A-B的克?。?可以把抗（A-B）雜種多肽中A部分固定在支持物上，再把抗B的抗體在體外用12

32、5I標記上，作為檢測抗體使用，因第一種抗體只同A部分的蛋白結(jié)合，標記的第二種抗體只同B部分的蛋白結(jié)合，所以只有含A-B的克隆才能呈現(xiàn)陽性反應，從而檢測出重組DNA分子。,4. 免疫化學檢測法,在某些情況下，如待測的重組克隆子既無任何可供選擇的基因表型特征，又無理想的核酸雜交探針時，可以考慮采用免疫學方法篩選重組子。 該法的基本過程與前述菌落雜交法相似，不同的是該法使用抗體探針，而非DNA探針來鑒定目的基因表達產(chǎn)物。 免疫學檢測法具有專一性強、靈敏度高的特點，只要有一個拷貝的目的基因在克隆子細胞內(nèi)表達合成蛋白質(zhì)就可以檢測出來。,5. 其他方法簡介,（1）轉(zhuǎn)譯篩選法 （2）亞克隆法 （3）電鏡作圖

33、檢測法 （4）質(zhì)譜分析法,（1）轉(zhuǎn)譯篩選法,突出優(yōu)點在于將克隆的DNA同所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間的關(guān)系對應起來。該法不作為篩選重組克隆子的常規(guī)手段。繁雜 雜交抑制轉(zhuǎn)譯檢測法：所依據(jù)的原理是，在體外無細胞的轉(zhuǎn)譯體系中，目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA一旦同DNA分子雜交，就不能指導蛋白質(zhì)多肽的合成。用于目的基因編碼豐富的mRNA。,（1）轉(zhuǎn)譯篩選法,雜交選擇轉(zhuǎn)譯檢測法：有時也稱雜交釋放轉(zhuǎn)譯法，比雜交抑制轉(zhuǎn)譯法靈敏度更高的陽性重組子篩選方法，可適用于低豐度mRNA(只占總mRNA的0.1%左右)產(chǎn)物的cDNA重組分子的檢測。 通過雜交手段選擇目的mRNA進行體外轉(zhuǎn)譯，而不是抑制目的mRNA的轉(zhuǎn)譯。,轉(zhuǎn)譯篩

34、選法 1. 雜交抑制的轉(zhuǎn)譯 該方法用于cDNA文庫中目的基因的篩選。其原理是在體外無細胞的轉(zhuǎn)譯中利用cDNA與mRNA雜交后導致mRNA的不能翻譯，從而篩選陽性克隆子。 分離的基因編碼著豐富的mRNA。 優(yōu)點：不需要克隆基因的表達，不需要探針或抗體。 缺點：較煩瑣。,步驟： 1. 將從大腸桿菌菌落或噬菌體群體中制備的帶有目的基因 的重組質(zhì)粒DNA變性后，與總mRNA雜交； 2. 轉(zhuǎn)入無細胞轉(zhuǎn)譯體系（麥胚提取物或兔網(wǎng)織紅細胞提取物）,由于加有35S標記的蛋氨酸，轉(zhuǎn)譯的多肽蛋白質(zhì)可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影進行分析； 3. 結(jié)果同未雜交的mRNA轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物作比較，從中找出其轉(zhuǎn)譯合成被抑制的

35、mRNA，即同目的基因變性DNA互補彼此雜交的mRNA。,2. 雜交選擇的轉(zhuǎn)譯 是一種直接的選擇法，比雜交抑制的轉(zhuǎn)譯要敏感得多，而且還可適用于低峰度的mRNA之cDNA重組分子的檢測。,（2）亞克隆法,陽性重組子經(jīng)篩選并鑒定出來后，還需作進一步定位工作。 因為克隆片段與整個目的基因很難完全吻合，一般較小的目的基因或cDNA基因可以完整地包含在克隆片段內(nèi)，而較大的目的基因可能會分散在不同的克隆片段中，亞克隆法是一種精確、極有價值的分析方法。,（2）亞克隆法,所謂亞克隆法，亦稱次級克隆(subcloning)是將克隆片段進一步片段化后再次進行的克隆。 一般是將重組DNA分別用幾種限制性核酸內(nèi)切酶切

36、割后，將所得各片段分別重組到載體上，再轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過對轉(zhuǎn)化細胞的表型鑒定或其他方法來確定基因所在的位置。,（3）電鏡作圖檢測法,用于克隆基因的定位研究。 基本原理： 在一定條件下，DNA分子中某些特殊的區(qū)段，如AT豐富區(qū)段、不同DNA分子的同源區(qū)段及與RNA分子同源的DNA區(qū)段等，能呈現(xiàn)出特殊的結(jié)構(gòu)，利用電子顯微鏡進行觀察作圖，可以鑒定這些結(jié)構(gòu)。,R-環(huán)檢測法： 鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源區(qū)域 在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度的甲酰胺溶液中（70%），雙鏈的DNA-RNA分子比雙鏈的DNA-DNA分子更加穩(wěn)定。 在這種條件下，RNA會同它的雙鏈DNA分子中的互補序列退火

37、形成穩(wěn)定的RNA-DNA，而被取代的另一條DNA呈單鏈狀態(tài)。這種由雙鏈RNA-DNA和單鏈DNA形成的泡狀體稱R-環(huán)結(jié)構(gòu)。,（3）電鏡作圖檢測法, 變性作圖：用于DNA分子中AT豐富區(qū)段的鑒定，變性區(qū)段形成的特殊“泡”狀精細結(jié)構(gòu)。 異源雙鏈定位法：異源雙鏈間同源序列及非同源區(qū)序列同源性區(qū)段。 R-環(huán)檢測法：用于鑒定雙鏈DNA分子中含有與特定RNA分子同源區(qū)段。,（4）質(zhì)譜分析法,某些生物（重組子）的基因組中增加的外源基因得以表達后，其蛋白質(zhì)組中必將呈現(xiàn)額外的蛋白質(zhì)，可按凝膠電泳作初步鑒定。 為了進一步準確鑒定，可采用蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，如出現(xiàn)外源基因表達的蛋白質(zhì)，基本上就可以確定

38、待分子的 材料是重組子。,1 篩選植物轉(zhuǎn)化細胞常用的報告基因有哪些。 2篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞的遺傳選擇標記有哪些。,自動測序儀測序法 (ABI),自動測序儀基于2，3-雙脫氧末端終止法的原理，標記系統(tǒng)由放射性核素改為發(fā)特定熒光信號的熒光染料，預先將四種熒光染料與四種雙脫氧核苷三磷酸共價相連，使其帶有不同的熒光標記。當某一種ddNTP摻入到正在合成的DNA單鏈分子中時，該鏈的延伸便終止并帶有相應的熒光染料。 自動測序系統(tǒng)包括電泳分離系統(tǒng)、熒光檢測裝置、計算機成像系統(tǒng)及分析軟件組合。,6,自動化測序法,Prober等1987年將鏈終止法加以改進，并與電子計算機程序的自動化技術(shù)相結(jié)合，加快了序列測

39、定，并且不用放射性同位素標記脫氧核苷酸，避免了放射線對操作者的危害。,實際做法：在每種脫氧核苷酸上分別都以共價鍵接上不同熒光染料，然后與四種三磷酸核苷在同一器皿中，依照上述鏈終止法條件進行，即會復制出一系列不斷增加較長一點的多聚脫氧核苷酸鏈，其3末端都各自帶有特色熒光染料的雙脫氧核苷酸，為了測定序列，將反應混合物在一條道上進行凝膠電泳，結(jié)果這條道上出現(xiàn)一系列有熒光的帶。,這些有熒光的帶中每一條都代表一個堿基在復制鏈中所在的位置。凝膠熒光測定體系由電子計算機控制。這個體系是用激光激發(fā)不同顏色的染料所發(fā)生的熒光，用短波長的藍光及長波長的紅光分別測量熒光強度之比值，測定在復制鏈中各堿基的位置，從而得到DNA