柯薩奇病毒的RT-PCR實(shí)驗(yàn)-推薦課件

1、1,柯薩奇病毒的RT-PCR實(shí)驗(yàn)室診斷,2,屬于小病毒科腸道病毒屬，最易在靈長類動(dòng)物細(xì)胞中生長。 病毒分為、兩組。柯薩奇病毒組有個(gè)血清型，柯薩奇病毒組有個(gè)血清型。,柯薩奇病毒,單股正鏈RNA，全長大約7.4Kb，病毒直徑為2530nm，球形，無包膜，病毒衣殼由VP1-VP4等構(gòu)成，呈20面體立體對稱。,3,柯薩奇病毒(Coxsackie virus，CV ) 的診斷方法： 病毒分離、動(dòng)物接種 操作煩瑣, 成功率低, 影響診斷的敏感性； ELISA 法 檢測患者血清中相應(yīng)的特異性IgM 、 IgG抗體, 但不能獲得有關(guān)病毒更多的信息； RT - PCR 法 既可以通過檢測病人樣本中的病毒RNA

2、來明確診斷, 也可以通過進(jìn)一步的測序來分析病毒流行株特定序列, 為基因分型提供依據(jù)。,4,兩端為保守的非編碼區(qū)，中間為編碼區(qū)。5端共價(jià)結(jié)合一小分子蛋白質(zhì)Vpg（約7kDa），與病毒RNA合成和基因組裝配有關(guān)；3端帶有polyA尾。編碼區(qū)編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1VP4，VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼的表面，有中和抗原位點(diǎn)；VP4位于衣殼內(nèi)部，一旦病毒VP1與受體結(jié)合后，VP4即被釋出，衣殼松動(dòng)，病毒基因組脫殼穿入。,5,逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，

3、由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。,6,Types of RT-PCR Reactions,Standard RT-PCR usually with one-step (recommended) Sensitive and specific Nested PCR More sensitive than standard Contamination is a major problem Only for very experienced labs Re

4、al Time RT-PCR Sensitive and specific Reagent and equipment costs are a factor High throughput,7,RT-PCR實(shí)驗(yàn)程序：標(biāo)本的采集、標(biāo)本RNA的提取、引物、RT-PCR反應(yīng)體系、溫度循環(huán)參數(shù)、瓊脂糖電泳、凝膠成像、結(jié)果判定及序列測定,8,一步法：反轉(zhuǎn)錄PCR在一個(gè)管子里完成，得到的全部cDNA產(chǎn)物都一起經(jīng)PCR擴(kuò)增，靈敏度更高。 兩步法：反轉(zhuǎn)錄和PCR分開，靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，但靈敏度不如前者高。,9,RNA操作注意事項(xiàng),全程戴手套 滅菌、清潔的塑料管或無RNA酶的玻璃制品 高壓帶濾芯槍尖 RNA提取試劑

5、要保證無RNA酶 所有試劑開蓋時(shí)要標(biāo)明日期 在RNA提取、RT-PCR和測序過程中使用無RNA 酶水 操作快捷，提取后的RNA應(yīng)放在-70度 備有冰盒，全程中保持RNA在低溫狀態(tài)下 避免反復(fù)凍融RNA，防止RNA降解。,10,PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成： 耐熱DNA聚合酶（Taq酶）：這是由耐熱水生細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶。 模板DNA：即待分析的目的DNA，其長度不宜大于10kb。 兩種引物：為了保證DNA聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補(bǔ)模板DNA鏈的3-端。 四種脫氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPS。 緩沖溶液：保證DNA聚合酶催化時(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤簆H值

6、,11,PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重

7、復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。,12,PCR 注意事項(xiàng),PCR關(guān)鍵環(huán)節(jié) 模板; 引物; 酶 dNTP; 循環(huán)條件; 尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。,13,模 板,1、雜質(zhì)蛋白質(zhì)；特別是染色體中的組蛋白； 2、Taq酶抑制劑； 3、在提取制備模板時(shí)丟失過多； 4、模板核酸變性不徹底； 5、模板降解。 RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)

8、。,14,引 物,引物質(zhì)量、濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為： 選定一個(gè)好的引物合成單位; 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠

9、，引物之間形成二聚體等。,15,Mg2+ 酶,Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。,16,物理原因,變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性; 退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。,17,出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶,PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，d

10、NTP濃度過高， Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有： 1、減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶； 2、減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)； 3、減少模板量。,18,如何避免污染,嚴(yán)格分區(qū)：標(biāo)本處理區(qū)與PCR擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，要有 一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：體系配制 標(biāo)本制備PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析產(chǎn)物處理。 試劑：引物和探針盡量分裝，不要原瓶多次取用。 加樣：原則是模板最后加，其他試劑按照體積從大往小的加。操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反

11、應(yīng)的精確度。 耗材：使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用； PCR產(chǎn)物：機(jī)器運(yùn)行完后，取出PCR產(chǎn)物時(shí)不能隨便丟棄，應(yīng)該用塑料手套或其他打結(jié)包好后丟入垃圾桶。,19,TRIZOL法提取核酸 RT-PCR法檢測柯薩奇病毒（兩步法） 逆轉(zhuǎn)錄（RT） 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） PCR產(chǎn)物的檢測和鑒定 引物：CVB3的3D基因引物,20,TRIZOL法提取核酸 1）取250ul病毒懸液加到1.5ml離心管中，然后加入750ul TRIZOL溶液，混勻5秒后離心。 2）加入200ul 氯仿溶液，充分混勻5秒鐘 3）室溫放置10分鐘后，10000RPM，室溫離心20分鐘 4）將上清液轉(zhuǎn)移到一支新

12、的1.5ml離心管中 5）再加入500ul異丙醇溶液，搖勻10秒鐘 6）室溫靜置至少15分鐘 7）14000RPM，4離心25分鐘 8）倒掉上清液，加入950ul冰冷的70%乙醇 9）14000RPM，4離心20分鐘 10）用吸尖小心吸出上清液倒掉 11）室溫干燥后加入15ul dH2O，-70保存,21,逆轉(zhuǎn)錄（RT） 配液：RNA 3l（1g） 隨機(jī)引物 1l 加水至10l 混勻，瞬時(shí)離心，70 5min 立即冰水浴，瞬時(shí)離心，依次添加下列試劑 M-MLV Buffer 5 4l dNTP 10mM 1l M-MLV 200U/l 1l 加水至20l，混勻，瞬時(shí)離心， 42 15min；9

13、5 5min；4 維持。 cDNA于-20 冰箱凍存。,22,聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 配液：25ul體系 2mix12.5 PrimerA(100ug/ml) 1ul PrimerS(100ug/ml) 1ul cDNA 1ul ddH2O 9.5ul,23,反應(yīng)程序： 95 5min 95 15sec 60 20sec 35cycles 72 20sec 72 10min 4 保存,24,PCR產(chǎn)物的檢測和鑒定 1）取100ml電泳緩沖液（1TAE）加入到干凈的三角瓶中，再加入1.7g瓊脂糖粉末，輕輕搖動(dòng)三角瓶，是瓊脂糖微粒呈均勻混濁狀態(tài)。 2）微波爐加熱使瓊脂糖熔化。 3）熔化的瓊脂糖自然冷卻到60左右，加入5ul溴化乙錠（EB），混勻后倒入已準(zhǔn)備好的膠床中，凝膠厚度約為0.30.5cm。 4）室溫下靜置，凝膠固化。拿出已經(jīng)做好的膠，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中。 5）向電泳糟中加入電泳緩沖液（1TAE），緩沖液的量以超過凝膠表面1-2mm為宜。 6）核酸樣品5ul中加入大約1ul的6loading buf