第五章-分子生物學(xué)研究方法上

1、第五章 分子生物學(xué)研究方法 DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù),5.1 重組DNA技術(shù)回顧 三大成就： 1、20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題； （1928 Frederick Griffith 2：Negative control.,圖2-2：體內(nèi)外培養(yǎng)禽巴氏桿菌莢膜蛋白的SDS-PAGE結(jié)構(gòu) M：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-4：體外培養(yǎng)的X-73，C48-3， P-1059和C51-3株莢膜蛋白；5-8：體內(nèi)培養(yǎng)的巴氏桿菌X-73，C48-3，P-1059和C51-3株莢膜蛋白。,脈沖電場凝膠電泳 （pulsed-field gel

2、 electrophoresis，PFGE) 這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場周期性交替進(jìn)行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時(shí)間取決于它的大小。 該方法可分離長至5Mb的DNA分子。嚴(yán)格說來，應(yīng)叫交替電場凝膠電泳。,5.2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖 細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation） 一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征改變的過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌。,感受態(tài)： 細(xì)菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)(competence). 感受態(tài)的出現(xiàn)是由于細(xì)菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點(diǎn)，這些

3、位點(diǎn)只能與雙鏈DNA結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合。 這說明完整的雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的；DNA的進(jìn)入和整合均為單鏈狀態(tài)。,1. CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌.其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)(Competence)。,(a) 在0的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時(shí)Ca2+ 使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離，形成感受態(tài)。 (b) Ca2+ 與DNA分子結(jié)合，形成抗DNase的羥基磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在

4、細(xì)菌表面。 (c) 當(dāng)42熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨之出現(xiàn)許多縫隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。,CaCl2誘導(dǎo)法的可能機(jī)制,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 （1）取100l 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng 載體的重 組DNA連接液，混勻； （2）冰浴放置半小時(shí)； （3）在42保溫2 分鐘（熱脈沖）； （4）快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘； （5）加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37培養(yǎng)1 小時(shí)； （6）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。,轉(zhuǎn)化率：51062107個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒,將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩

5、極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。,2. 電擊法轉(zhuǎn)化,大腸桿菌: 優(yōu)化參數(shù)電場強(qiáng)度、電脈沖長度、 DNA的濃度。 轉(zhuǎn)化率： 109-1010轉(zhuǎn)化子/g DNA.,電穿孔轉(zhuǎn)化儀,5.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase Chain Reaction (PCR),1. PCR的定義 在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定克隆或基因組DNA序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。,2.PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) （1）特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等； （2

6、）能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍。,3.PCR技術(shù)原理,類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 模板DNA變性：加熱至94左右，雙鏈DNA解離成單鏈； 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； 引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈； 重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。,PCR過程 （1）denaturatation （2）Primer annealing （3）P

7、rimer extension,PCR product,PCR反應(yīng)曲線,4. PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系,10PCR緩沖液 10l 4種dNTP混合物 各200mol/L 引物 10100 pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5U Mg2+ 1.5 mM 無菌D.W 100ul,5. PCR反應(yīng)五要素,primer Taq DNA polymerase dNTP : dATP、dGTP、dCTP、dTTP Template DNA Mg2+,（1）引物 A. 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵; B. PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補(bǔ)的程度.,引物設(shè)計(jì)的原則 引 物

8、 長 度：15-30個(gè)堿基，常為20個(gè)堿基左右; 引物擴(kuò)增跨度：以500 bp為宜，特定條件下可擴(kuò) 增長至10kb的片段; 引 物 堿 基：G+C含量以40-60%為宜, ATGC 最好隨機(jī)分布.,避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) 避免兩引物間互補(bǔ)，特別是 3端 引物 3端的堿基要求嚴(yán)格配對 特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基 引物中可以加上合適的酶切位點(diǎn) 要作酶切時(shí)加 引物的特異性 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明 顯同源性,（2）酶濃度 A. Taq DNA聚合酶 注：無3 5方向的校正活性 B. 一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U。濃度過高 可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物 量減少。,（3）

9、dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。 A.dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度， 小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會使 dNTP降解； B.在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為20200M， 注意4種dNTP的濃度要相等。,（4）模板DNA 模板DNA的含量與純度，是PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。,（5）Mg2+濃度 A.Mg2+對擴(kuò)增特異性和產(chǎn)量有顯著影響: Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低； 濃度過低會降低TaqDNA聚合酶活性，使 反應(yīng)產(chǎn)物減少。 B.在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為 200M時(shí)，Mg2+濃度為1.5-2 mM為宜。,6. PCR熱循環(huán)條件

10、的選擇 PCR反應(yīng)條件: 溫度 時(shí)間 循環(huán)次數(shù),(1) 溫度與時(shí)間的設(shè)置 設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)： 1）93-95變性 2）40-60退火 3）70-75延伸 對于較短靶基因（長度為100300bp時(shí)）可采 用二溫度點(diǎn)法， 一般采用94變性，65左右 退火與延伸,（2）循環(huán)次數(shù) 決定PCR擴(kuò)增程度 主要取決于模板DNA的濃度 選在2540次之間,（3）延伸溫度與時(shí)間 A.延伸溫度：一般在7075之間，常用溫度為 72； B.延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定,1Kb以 內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min 。 注意： A.延伸時(shí)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增； B.對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間

11、要稍長些。,（4）引物的復(fù)性溫度 當(dāng)引物長度為15-20個(gè)堿基時(shí)，在高離子強(qiáng)度中反應(yīng)（如1M NaCl）。 Tm = 4（G + C） + 2（A+T） 復(fù)性溫度=Tm值 -（510） 復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引 物與模板之間完全結(jié)合,7. PCR技術(shù)的應(yīng)用 （1）基因組中特異片段克隆 （2）RT-PCR （3）基因的體外誘變 （4）基因組的比較研究,5.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR （Real time quantitative PCR）,建立實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的必要性 常規(guī)PCR： 可擴(kuò)增特定核苷酸片斷；用凝膠電泳可檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（定性）；同位素標(biāo)記及光密度掃描技術(shù)可檢測PCR產(chǎn)

12、物量（定量）。 研究證明：PCR產(chǎn)物總量變異系數(shù)常常達(dá)到10%-30%。 但是我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。,熒光定量PCR的原理 PCR擴(kuò)增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對數(shù)成正比， 由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光， 其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比， 因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。,實(shí)時(shí)定量PCR和常規(guī)PCR的區(qū)別 （1）常規(guī)PCR是通過瓊脂糖電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性分

13、析（定量不準(zhǔn)確）； （2）熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA或cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法（準(zhǔn)確定量）。,Non-specific DNA binding dyes: -SYBR Green I -SYBR Gold -Ethidium Bromide,非特異性嵌入熒光染料評價(jià) 優(yōu)點(diǎn)： 與特異性的熒光探針相比價(jià)格便宜只需要設(shè)計(jì)PCR引物 缺點(diǎn)： 由于它和模板的結(jié)合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實(shí)反映目的基因的擴(kuò)增情況。,特異性熒光

14、探針 將特異性寡核苷酸被熒光素標(biāo)記，制備熒光標(biāo)記的DNA探針。通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合，可均相、實(shí)時(shí)定量檢測在整個(gè)PCR過程中產(chǎn)量。 TaqMan探針：一段5端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)(R)，3端標(biāo)記猝滅熒光基團(tuán)(Q)的寡核苷酸，其序列與模板DNA中的一段完全互補(bǔ)。,當(dāng)探針單獨(dú)存在時(shí)，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生, R熒光受到Q的猝滅。,在PCR過程中， 由于TaqDNA酶的53外切酶活性的作用，使探針的5端的R被切除，加大了與Q的距離而使熒光恢復(fù)。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此，Taqman探針檢測的是積累熒光。,TaqMan探針評價(jià) 優(yōu)點(diǎn)： 熒光信號強(qiáng) 與其它探針相比

15、設(shè)計(jì)簡單 可用于多通道檢測 缺點(diǎn)： 比DNA結(jié)合染料價(jià)格高,（Threshold Cycle，Ct）閾值 在PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號超過基線值或進(jìn)入指數(shù)增長期時(shí)的循環(huán)數(shù)。,熒光擴(kuò)增曲線可分3個(gè)階段 熒光背景信號階段：擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。 熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段：PCR產(chǎn)量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 平臺期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量間無線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。,5.2.5 基因組DNA文庫的構(gòu)建,基因組文庫： 含有某種生物全部遺傳信息的重

16、組DNA分子(克隆)的總和,基因組文庫特點(diǎn)： 由于基因組文庫來自于某一物種的基因組，而該物種所有組織中的基因組均相同，所以基因組文庫具有種屬特異性，無組織特異性。 cDNA文庫cDNA文庫來自于某一物種某種組織的mRNA，所以cDNA文庫既有種屬特異性，也有組織特異性。,基因組文庫的大小 理論值: 基因組文庫的克隆數(shù)目基因組DNA總長/DNA插入片段的平均長度。 例如： 細(xì)菌基因組DNA總長度 = 3 106 kb 酶切后的DNA片段平均長度 = 15 kb 基因組文庫的克隆數(shù) = 3 106 kb/15 kb= 2 105個(gè)克隆,經(jīng)驗(yàn)值： N基因組文庫克隆總數(shù) P在基因組文庫中目的基因DNA

17、片段的出現(xiàn)概率 f插入片段大小與基因組DNA大小比值,N =,Ln(1 P),Ln(1 f),例如：基因組文庫中含目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率達(dá)到99%， 即 P = 0.99。,經(jīng)驗(yàn)值比理論 值越大4.5倍,5.3 RNA基本操作技術(shù) 真核生物基因組DNA非常龐大，而且含有大量重復(fù)序列，無論用電泳分離還是用雜交方法都難以直接分離到靶基因片段。 cDNA則來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，不含冗余的序列，通過特異性探針篩選cDNA文庫，可以較快地分離到相關(guān)基因。,5.3.1 總RNA的提取 總RNA包括：mRNA，rRNA，tRNA以及sRNA。 動(dòng)物細(xì)胞：約含10-5ug/細(xì)胞 total RNA：rR

18、NA 80%85% tRNA以及sRNA 15%20% mRNA 1%5%,總RNA的抽提方法 常用的方法：異硫氰酸胍-苯酚抽提法 迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的RNA釋放出來并使核糖體蛋白與RNA分子分離，還能保證RNA的完整。 RNA濃度和純度測定： OD260 = 1，RNA濃度為40 ug/ml； OD260/OD280 = 1.8 2.0，RNA純度較好； OD260/OD280 1.8，蛋白質(zhì)或酚污染。 RNA的瓊脂糖電泳檢測： 變性條件下進(jìn)行瓊脂糖電泳，因?yàn)镽NA易形成二級結(jié)構(gòu)而且易降解。常用變性劑是有甲醛、尿素等。,5.3.2 mRNA的純化 根據(jù)真核細(xì)胞mRNA

19、的結(jié)構(gòu)特征來純化mRNA。,5.3.3 cDNA的合成 cDNA合成包括第一鏈和第二鏈的合成。 以mRNA為模板，用oligo dT和反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA。 用RNase H 切割mRNA-cDNA雜合鏈中的mRNA成小片段后，以第一條cDNA為模板，用DNA聚合酶合成出第二條cDNA。,5.3.4 cDNA文庫的構(gòu)建 由于cDNA的長度一般在0.58kb，常用的質(zhì)粒載體和噬菌體載體都能滿足要求。 cDNA文庫載體選擇要根據(jù)該文庫的用途來確定。例如： Uni-zapXR載體是一種噬菌體載體，具有噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)可利用藍(lán)白色篩選的便利，可容納10kb DNA插入片段，重組載體通

20、過體內(nèi)剪切反應(yīng)（in vivo excision）將cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中，克隆和序列分析。,5.3.5 基因文庫的篩選 通過某種特殊方法從基因文 庫中鑒定出含有目的基因片段 的特定克隆的過程。 核酸雜交法 用放射性同位素標(biāo)記的特 異DNA探針適用于高密度的 菌落雜交篩選。,2. PCR篩選法 PCR篩選法與核酸雜交法具有同樣的通用性，而且操作簡便，但前提是已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物。,3.免疫篩選法 免疫篩選法是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，所以該法適用于表達(dá)型文庫的篩選。,5.4 SNP的理論與應(yīng)用 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor

21、phism，SNP）是指基因組DNA序列中單核苷酸（A、T、C和G）的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 基因組DNA同一位點(diǎn)上的堿基類叫做一個(gè)等位位點(diǎn)。SNP是基因組中最簡單、最常見的多態(tài)性形式，具有很高的遺傳穩(wěn)定性。,5.4.1 SNP的概述 一個(gè)SNP表示在基因組DNA某個(gè)位點(diǎn)上一個(gè)核苷酸的變化，這種變化可能是轉(zhuǎn)換（CT，在其互補(bǔ)鏈上則為G A），也可能是顛換（C A，G T，C G，A T），具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占SNP總量的2/3左右。 SNP廣泛存在于人類基因組中，其發(fā)生頻率約為1%或更高。據(jù)估計(jì)，人類DNA中每3001000bp就有一個(gè)SNP，因此，一個(gè)人類個(gè)體大約攜帶300萬1

22、000萬個(gè)SNPs。,位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單倍型（haplotype），相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺傳個(gè)后代。,例如：玉米儲藏蛋白的8個(gè)基因型共包含了3個(gè)單倍型(H1，H2和H3)，它們分別由多個(gè)相鄰的SNP所構(gòu)成。,5.4.2 SNP的檢測技術(shù) 限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP)、毛細(xì)管電泳和變性高效液相色譜（DHPLC）等。由于這些技術(shù)都必須通過凝膠電泳進(jìn)行分析，通量受到限制。 且這些方法僅能判斷SNP的有無而不能知道確切的堿基類型，只要進(jìn)行DNA測序分析才能確認(rèn)所發(fā)現(xiàn)的SNP。 基因分型（geno

23、typing）：利用數(shù)據(jù)庫中已有的SNP進(jìn)行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究，包括基因芯片技術(shù)、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)（molecular beacon）和焦磷酸測序法等。,1.基因芯片技術(shù)（Gene chip） 固相支持介質(zhì)上進(jìn)行雜交和原位熒光檢測的一種高通量 SNP分析方法。 通過優(yōu)化芯片雜交程度，使探針只與完全互補(bǔ)的序列能雜 交，而不能與含有錯(cuò)配的堿基的序列雜交。 待測基因樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增及熒光化學(xué)標(biāo)記后與固定的探針 進(jìn)行雜交。 由于目標(biāo)基因和探針雜交的程度與熒光強(qiáng)度及種類相關(guān)， 因此通過熒光掃描，可根據(jù)熒光強(qiáng)弱或熒光的種類檢測出被 檢序列的堿基類別。,基因芯片技術(shù),固體平面 (玻

24、片、 尼龍薄膜) DNA樣品微點(diǎn)的排列 DNA/DNA or DNA/RNA 堿基配對原則 熒光標(biāo)記的探針,（2）DNA芯片應(yīng)用 可在基因組水平進(jìn)行基因表達(dá)、突變、序列測定等，已廣泛應(yīng)用于基因組研究和人類疾病的診斷等多領(lǐng)域。,2. Taqman技術(shù) 在PCR反應(yīng)體系中加入2種不同熒光標(biāo)記的探針，它們分別與兩個(gè)等位基因配對。探針的5端和3端分別用特殊染料標(biāo)記, 稱為供體-受體染料對或引爆-猝滅染料對。正常情況下，由于探針5端熒光基團(tuán)和3端猝滅基團(tuán)近鄰在一起，供體所發(fā)熒光由于其光譜在空間上接近受體染料被猝滅，只要當(dāng)兩者分離時(shí)才能檢測到供體所發(fā)出的熒光。,隨著PCR的有效進(jìn)行，與模板完全配對的探針逐步被TaqDNA聚合酶的53外切酶活性所切割，致使探針5端上的熒光集團(tuán)與3端的猝滅基團(tuán)分離，猝滅效應(yīng)解除，供體的熒光基團(tuán)被激活，而與模板不能完全配對的探針不能被有效切割，供體熒光基團(tuán)依然被猝滅。通過相應(yīng)儀器檢測熒光值變化，便可進(jìn)行基因分型。,3.分子信標(biāo)技術(shù)（molecular beacon