現(xiàn)代分生技術(shù)-鄭麗舒.ppt

1、大腸桿菌、質(zhì)粒和噬菌體鄭麗舒 中國疾控中心 病毒病預防控制所2013.04.15,一、大腸桿菌 二、質(zhì)粒：常見質(zhì)粒 質(zhì)粒的分離純化 感受態(tài)細胞 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 三、噬菌體：噬菌體及其載體 M13噬菌體及其載體 四、分子克隆,主 要 內(nèi) 容,大腸桿菌,大腸桿菌,大腸桿菌一般特征, 屬于原核生物，是革蘭氏陰性棒狀桿菌(紅色) 有鞭毛，無芽孢，能運動，有的有莢膜 其染色體是長約30kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子 生長需求非常簡單，在僅含碳水化合物和少量氮源及 無機鹽的培養(yǎng)基上即可生長 兼性厭氧 長度大約2um，寬0.8um DNA長度約為體長的1000倍,Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌，廣泛存在于人

2、和溫血動物腸道中，44.5發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。在相當長時間內(nèi)認為是非致病菌。20世紀中葉，認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，常引起嚴重腹瀉和敗血癥。 根據(jù)不同生物學特性將致病性大腸桿菌（EPEC）分為4類： 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC） 腸侵襲性大腸桿菌（EIEC） 腸出血性大腸桿菌（EHEC） 腸黏附性大腸桿菌（EAEC）,大腸桿菌,大腸桿菌在分子生物學實驗中的應用,生物工程用菌株優(yōu)點： 背景清楚：全基因組測序，共有4405個開放閱讀框架。由于該菌株遺傳背景清楚，并經(jīng)過一系列突變篩選，使外源DNA在胞內(nèi)不易發(fā)生重組或修飾，更適于作為基因操作的宿主菌。 生物安全：生物工程用菌株是

3、在不斷篩選后被挑選出的，這些菌株由于失去細胞壁的重要組分，在自然條件下無法生長，甚至普通的清潔劑都可以輕易殺滅。即便由于操作不慎導致活菌從實驗室流出，也可避免對自然界造成危害。 菌株基因優(yōu)化：生物工程用的菌株基因組都被優(yōu)化過，使之帶有不同基因型（例如半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆實驗。 操作簡便，表達量高：大腸桿菌操作和培養(yǎng)條件簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵。表達的外源基因蛋白量甚至可以達到細菌總蛋白的80%。 目前大腸桿菌是應用最廣泛，最成功的表達體系，常做高效表達的首選體系。美國FDA批準為安全的基因工程受體生物。,大腸桿菌在分子生物學實驗中的應用,缺點： 基因結(jié)構(gòu)差異：大多數(shù)真核基因含有內(nèi)含子

4、，細菌中沒有除去內(nèi)含子機制，外源基因編碼區(qū)必須是連續(xù)的，刪除真核基因的內(nèi)含子和5非編碼區(qū)。 原核：CDNA； 真核：DNA 轉(zhuǎn)錄信號不同：真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子不具有結(jié)合細菌核糖體所必須的SD序列 細菌RNA聚合酶不能識別真核生物啟動子 SD序列（Shine-Dalgarnosequence）： mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。 SD序列在細菌mRNA起始密碼子AUG上游 10個堿基處，有一段富含嘌呤的堿基序 列，能與細菌16SrRNA3端識別，幫助 從起始AUG處開始翻譯。,大腸桿菌在分子生物學實驗中的應用,缺點： mRNA的分子結(jié)構(gòu)差異：絕大多數(shù)真核mRNA分子的3末端有pol

5、y(A)尾巴，在5末端有一個帽結(jié)構(gòu)。影響mRNA在細菌中的穩(wěn)定性及與細菌核糖體相結(jié)合的能力，阻止正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)：表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不能進行糖基化、磷酸化修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)想折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沒有足夠的生物學活性（缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復性功能）。 表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，在細菌內(nèi)形成包涵體，當表達的蛋白量超過菌體總蛋白10%時，容易形成包涵體。 細菌的蛋白酶：可以識別降解真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。,加拿大人Frederick Banting和Charles Best于1921年首先發(fā)現(xiàn)胰島素，1922年開始用于臨床，1923年或諾貝爾獎

6、。1965年9月17日，中國科學家第一個在實驗室中人工合成了具有全部生物活力的結(jié)晶牛胰島素。 人的胰島素基因在大腸桿菌里指揮著大腸桿菌生產(chǎn)出了人的胰島素。隨著細菌的繁殖，胰島素基因也一代代傳了下去，后代的大腸桿菌也能生產(chǎn)胰島素。這種帶上了人工給予的新的遺傳性狀的細菌，被稱為基因工程菌。,應用實例,胰島素由A、B兩個肽鏈組成。 A鏈有11種21個氨基酸， B鏈有15種30個氨基酸， 共51個氨基酸組成。 其中A7-B7、A20-B19四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B鏈連接起來。 A鏈中A6與A11之間也存在二硫鍵。,大腸桿菌的培養(yǎng)與保存,LB培養(yǎng)基是培養(yǎng)大腸桿菌最常用的培養(yǎng)基。其它培

7、養(yǎng)基都是在此基礎(chǔ)上有所加減，可參閱有關(guān)手冊。LB一般被解釋為Luria-Bertani培養(yǎng)基，其發(fā)明人貝爾塔尼(Giuseppe Bertani)認為這個名字來源于英語的lysogeny broth，即溶菌肉湯。 酵母提取物：碳源，能源，磷酸鹽 蛋白胨：氮源 氯化鈉：無機鹽 液體LB培養(yǎng)基：每升含胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，高壓滅菌15磅30分鐘。 固體LB培養(yǎng)基：基本同上，加瓊脂15克/升。高壓滅菌后，冷卻至50左右，可根據(jù)需要加入適當?shù)目咕鼗蚱渌噭?，混勻后倒入平皿中?半固體LB培養(yǎng)基：基本同上，只是瓊脂濃度為6克/升。高壓后室溫保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们霸谒』蛭⒉t溶化。,

8、常用培養(yǎng)基, 取2-5毫升液體LB培養(yǎng)基，到無菌培養(yǎng)管中； 用接種環(huán)從瓊脂培養(yǎng)板上挑取單個菌落，接種到培養(yǎng)基中。注意要先蘸取少許液體在管壁將菌落研磨開，再輕搖試管使細菌均勻分散到培養(yǎng)基中； 蓋上蓋子，保證通氣。37搖床 60rpm，培養(yǎng)過夜; 1:100轉(zhuǎn)種到培養(yǎng)瓶中。通常250ml培養(yǎng)瓶中加培養(yǎng)液不超過100ml。37搖床（250rpm）培養(yǎng)，直至細菌生長到所需密度。,大腸桿菌的培養(yǎng)與保存,大腸桿菌的液體培養(yǎng), 用接種環(huán)蘸取少許細菌培養(yǎng)液，或從固體培養(yǎng)平板的菌落上蘸取少許細菌，從平板的一側(cè)開始劃線； 消毒接種環(huán)，從剛劃過的部位帶過并在旁邊繼續(xù)劃線； 如上重復34次，直至劃滿平板。這樣可以確保

9、分離出單個菌落。,在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),大腸桿菌的培養(yǎng)與保存, 在小玻璃瓶或試管中加入三分之二體積的LB半固體培養(yǎng)基； 用接種針從固體培養(yǎng)板上挑取單個菌落，反復刺入瓊脂中； 置37培養(yǎng)8-12小時，直至可看到細菌生長呈霧狀； 擰緊蓋子，置15-22暗處保存。一般可保存數(shù)年； 復蘇時用接種環(huán)蘸取少許帶菌瓊脂，劃線到LB平板上。,菌株的保存與復蘇,穿刺保存, 取新鮮飽和的或生長到對數(shù)生長中期的細菌培養(yǎng)液，加入滅菌的甘油至終濃度15%（或7% DMSO），混合均勻。 分裝到凍存管中，保存在-70。如條件所限，亦可保存在-20，但保存時間較短。 復蘇時，用接種環(huán)從上面刮取少許菌液，注意要避免反復凍融。然

10、后劃線到LB平板上。,菌株的保存與復蘇,冷凍保存,質(zhì)粒（plasmid）是染色體以外能 自主復制的遺傳因子 不具有胞外期 對寄主細胞來說是非必需的,質(zhì)粒概述,符合這三條標準的染色體外DNA或RNA分子都可以稱為質(zhì)粒。 狹義的質(zhì)粒：一般是指細菌染色體外的環(huán)狀DNA分子。 質(zhì)粒的命名：一個小寫字母p加2-3個大寫字母和數(shù)字，如pBV220，pET30。,質(zhì)粒DNA的構(gòu)型： SC型 共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA） OC型 開環(huán)DNA（ocDNA） L 型 線性DNA（L DNA）,質(zhì)粒概述,L,SC,OC,常見質(zhì)粒種類： 細菌質(zhì)粒 真核生物DNA質(zhì)粒 真核生物RNA質(zhì)粒,質(zhì)粒概述,質(zhì)粒概述,細菌

11、質(zhì)粒,定義：細菌細胞中染色體以外的共價閉合環(huán)狀DNA分子 (cccDNA)，能 獨立于細胞核進行自主復制。 大小：其大小在1-1700 kb之間。攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。 功能：進入宿主菌后，帶有一些基因，產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。 分類：根據(jù)質(zhì)?？刂频男誀?，可以把細菌質(zhì)粒分成抗性質(zhì)粒、降解質(zhì)粒、毒力質(zhì)粒、共生質(zhì)粒等類型。 重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間均可發(fā)生 存在范圍：很多細菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤桿菌等,細菌質(zhì)粒功能分類 克隆質(zhì)粒: 克隆一個基因或DNA片斷 表達質(zhì)粒: 用于

12、一個基因的蛋白表達,細菌質(zhì)粒性質(zhì)： 1、可以在細胞質(zhì)中獨立于染色體之外獨立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；,細菌質(zhì)粒性質(zhì)： 2、質(zhì)粒是一種復制子（replicon），根據(jù)自我復制能力的不同，可把 質(zhì)粒復制的控制形式分為嚴緊型和松弛型兩種； 嚴緊型質(zhì)粒的復制受細胞核控制，與染色體DNA復制相伴隨，一般一個寄主細胞內(nèi)只有少數(shù)幾個（1-5）個拷貝； 松弛型質(zhì)粒的復制不受細胞核控制，在染色體DNA復制停止的情況下仍可以進行復制，在細胞內(nèi)的數(shù)量可以達到10-200個或更多。如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成，會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。 pBR322

13、即屬于松弛型質(zhì)粒，經(jīng)過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。,嚴緊型,松弛型,細菌質(zhì)粒性質(zhì)： 3、可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或接合作用(通過細胞間緊密接觸而實現(xiàn)遺傳物質(zhì)交換的過程 )由一個細菌細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞中，使兩個細胞都成為帶有質(zhì)粒的細胞； 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時，它可以單獨轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起轉(zhuǎn)移，所以可成為基因工程的載體。,細菌質(zhì)粒性質(zhì)： 4、質(zhì)粒的不親合性 定義：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。 分子基礎(chǔ):主要是由于復制功能之間相互干擾造成。 有相似的復制子結(jié)構(gòu)，受到同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，使兩種質(zhì)粒最終拷貝數(shù)不同，拷貝數(shù)多的質(zhì)

14、粒在以后的分裂中更占優(yōu)勢。 ColE1、pMB1; pSC101、F、RP4； p15A,衍生質(zhì)粒,細菌質(zhì)粒性質(zhì)： 5、質(zhì)粒對于細菌的生長不是必須的,代表性細菌質(zhì)粒（1）,F因子，又稱致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，環(huán)狀雙鏈DNA，編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。 存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，決定性別。 F質(zhì)粒的整個基因組結(jié)構(gòu)由三個主要區(qū)段組成：（1）轉(zhuǎn)移區(qū)（2）復制區(qū)（3）重組區(qū) 重組區(qū)中有4個插入順序（IS），通過和宿主染色體上的IS同源重組或通過轉(zhuǎn)座，F(xiàn)因子可以整合到宿主不同位點上。由于宿主染

15、色體上IS方向不同，所以整合的方向也隨之不同。,F因子（fertility factor）,根據(jù)大腸桿菌細胞內(nèi)有無F質(zhì)粒及其在細胞內(nèi)存在狀態(tài)可將細胞分為四種類型： F+ 菌株： F因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。 F- 菌株： 無F因子，無性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）。 Hfr菌株(高頻重組菌株)： F因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛 F菌株： Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F。,代表性細菌質(zhì)粒（1）,代表性細菌質(zhì)粒（2）：,R因子（resistance），抗藥因子，帶R因子的細菌有大腸桿

16、菌、沙門氏菌、志賀氏菌、綠膿桿菌等G-菌，60-90%的G-菌耐藥性由R因子轉(zhuǎn)移。 R因子是細胞質(zhì)性質(zhì)粒，具有使寄主菌對鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素等抗菌素或磺胺劑產(chǎn)生抗藥性的基因群。和F因子一樣，通過接合進行轉(zhuǎn)移，獲得該因子的細菌獲得對多種藥劑的抗性，給治療帶來很大麻煩。 R因子為環(huán)狀雙鏈DNA分子，由相連兩個DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子和抗性決定因子，R因子在細胞內(nèi)的copy數(shù)可從1-2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_2000-3000個/細胞。,R因子（resistence factor）,代表性細菌質(zhì)粒（3）：,Col因子，產(chǎn)大腸桿菌素因子，編碼合成大腸桿菌素

17、, 通過抑制復制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝而專一性地殺死不含Col因子的其他腸道細菌。 Col因子可分為兩類： ColE1：無接合作用，松弛型多copy；廣泛地用于重組DNA研究和體外復制系統(tǒng)。 ColIb：與F因子相似，通過接合作用轉(zhuǎn)移，屬于嚴緊型控制，只有1-2個copy。,Col因子（colicinogenic factor）,真核生物DNA質(zhì)粒,環(huán)狀DNA質(zhì)粒：酵母質(zhì)粒，植物線粒體中的環(huán)狀DNA質(zhì)粒，人和動物的核DNA質(zhì)粒等，都是不知其功能的隱蔽質(zhì)粒。 線狀DNA質(zhì)粒：乳酸克魯維酵母的嗜殺線狀DNA質(zhì)粒，植物線粒體中與雄性不育有關(guān)的線狀DNA質(zhì)粒。,真核生物RNA質(zhì)粒,有殼體的dsRNA質(zhì)

18、粒：由蛋白質(zhì)殼體包裹，存在于某些真菌和植物細胞中，由于它們酷似病毒，所以也常被稱作真菌病毒和植物隱蔽病毒，或稱類病毒顆粒，典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質(zhì)粒。與RNA病毒的主要區(qū)別是它們不具有感染性 無殼體的dsRNA質(zhì)粒：存在于脂質(zhì)小囊中的栗疫菌減毒dsRNA質(zhì)粒，玉米線粒體中與雄性不育有關(guān)的dsRNA質(zhì)粒。,把目的基因通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。 基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當改造而成的，目前已

19、有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。,分子生物學實驗中常用質(zhì)粒載體,復制子是含有DNA復制起始位點的一段DNA序列（ori）,也包括復制必需的RNA和蛋白質(zhì)的編碼基因。復制子決定該質(zhì)粒的復制是嚴緊型還是松弛型。原核生物DNA分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。 選擇標記通常為抗生素耐藥基因，如Amp+，Kan+的抗性基因；或產(chǎn)生易于辨認的顏色，如半乳糖苷酶、熒光素酶等的基因。 多克隆位點是含有多個內(nèi)切酶識別位點的一段DNA序列，便于外源DNA片段的插入，而且不會影響質(zhì)粒本身的穩(wěn)定。,按功能分成： （1）克隆載體：都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增

20、。它是用來克隆和擴增DNA片段（基因）的載體。 （2）表達載體：具有克隆載體的基本元件（如ori，Ampr，Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。 在大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白的表達載體要含有適當?shù)脑藛幼?，轉(zhuǎn)錄終止信號。 在真核細胞生產(chǎn)外源蛋白的表達載體除含有適當?shù)恼婧藛幼?，轉(zhuǎn)錄終止信號外，還應含有內(nèi)含子剪切序列和polyA加尾信號。,載體分類,載體分類,按進入受體細胞類型分： （1）原核載體 （2）真核載體 （3）穿梭載體（shuttle vector） 指在兩種宿主生物體內(nèi)復制的載體分子，要含有不同系統(tǒng)可識別的復制起點，因而可以運載目的基因。,質(zhì)粒載體的選擇,構(gòu)建重組DNA的

21、目的： 克隆擴增：選擇合適的克隆載體pGEM-T, pBluescript 蛋白表達：原核細胞表達載體如pBV220, pET等； 真核細胞表達載體pcDNA3, pSV2等。 研究基因功能：overexpression, knock down, knock out 基因治療：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體 載體的類型：（1）克隆載體的克隆能力：理想的克隆質(zhì)粒本身要盡可能小，這樣轉(zhuǎn)化效率較 高，同時質(zhì)粒的容量較大，可以插入較大的DNA片段。 （2）表達載體據(jù)受體細胞類型：原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。 注意事項： 載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，目的基因與載

22、體應易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。,質(zhì)粒載體的選擇,選用質(zhì)粒做載體的4點要求： 選分子量小的質(zhì)粒，小載體不易損壞，在細菌里拷貝數(shù)多； 一般使用松弛型質(zhì)粒在細菌里擴增不受約束； 必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地； 必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因。,常見質(zhì)粒1：pBR322,優(yōu)點： 1、具有較小的分子量； 分子量為4363bp，克隆載體的分子量大小不要超過10kb。 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 共有24種核酸內(nèi)切酶單一酶切識別位點。 其中7種內(nèi)切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導致t

23、etr基因的失活； 另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點。 3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后每個細胞中可積累1000-3000個拷貝（氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成,阻止細胞染色體復制,而質(zhì)粒本身復制不受影響,增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)）。,“P”表示是一種質(zhì)粒； “BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示實驗編號。,Example: 在pBR322質(zhì)粒的BamH或Sal位點插入外源DNA片斷，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTet

24、s的大腸桿菌。 涂布在含青霉素的選擇培養(yǎng)基上，可生長 涂布于含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上，不能生長。,常見質(zhì)粒2：pGEM-T,藍白斑篩選原理： 載體帶有LacZ基因的調(diào)控序列和N端146個氨基酸的編碼信息，編碼-互補肽 宿主編碼的-半乳糖苷酶C端 當這種載體轉(zhuǎn)入可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然各自都沒有酶活性，但它們可融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)，稱這種現(xiàn)象為-互補。 由-互補產(chǎn)生-半乳糖苷酶可使底物X-Gal產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。 然而，當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，導致無-互補能力的N端片段

25、，使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。 如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。,-互補, 互補的檢測,PUC18/19由pBR322和M13噬菌體改造,常用表達質(zhì)粒：,質(zhì)粒DNA的分離與純化 1、氯化銫密度梯度離心法 2、堿變性法 3、微量堿變性法,1.氯化銫密度梯度離心法原理 質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%； 在細胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)； 染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復合物中，EB含

26、量越高，密度會越低（完整的質(zhì)粒DNA結(jié)合EB少，密度大）。,離心流程 離心收集菌體，加入溶菌酶或SDS，促進大腸桿菌細胞裂解，離心收集含質(zhì)粒DNA的上清。 將EB的CsCl溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會嵌入到DNA鏈的堿基中。 在EB達到飽和時，進行氯化銫密度梯度離心。,2.堿變性法原理： 原理：cccDNA與線性染色體DNA片斷之間，拓撲學上存在差異 在pH12.012.5范圍內(nèi)： 線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性；共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。 恢復pH值中性時： 共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而

27、準確，恢復原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。 線性染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 通過離心，去除線性染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復合物等，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。,挑取單個菌落接種到5ml含適當抗菌素的LB培養(yǎng)基中， 37搖床培養(yǎng)過夜。 取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm離心1min，棄上清， 沉淀懸浮于150l溶液（500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0）冰浴5分鐘；此步驟菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊，否

28、則會降低抽提得率。 加入新配置的200l溶液（0.2mol/L NaOH，1%SDS），混勻，冰浴10分鐘。這一步操作要注意兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。 加入 150l 溶液（ 3mol/L乙酸鉀，pH4.8），冰浴5分鐘；堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，否則最后得到的質(zhì)粒上會有大量的基因組DNA污染。 12000rpm離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管； 加入等體積酚/氯仿抽提一次；轉(zhuǎn)移上層水相至新的離心管； 等體積氯仿抽提一次。 取上清，加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20沉淀30分鐘； 1200

29、0rpm離心5分鐘。 70%乙醇洗滌沉淀一次； 干燥后加入50l含RNA酶（20ug/ml）的TE（10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA，pH 8.0），37水浴30分鐘。-20保存?zhèn)溆谩?質(zhì)粒的小量提取,堿裂解法,自Qiagen公司推出快速小量提取質(zhì)粒DNA試劑盒以來，很多公司都開發(fā)出類似產(chǎn)品，其原理及實驗步驟大同小異。具體步驟如下(天為時代)： 挑取單菌落接種于5ml含適當抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜； 取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，13000rpm離心1min，棄上清，加入250ul S1 Buffer,最大速度旋渦震蕩； 加入250ul

30、S2 Buffer，輕輕顛倒混勻4-6次； 加入350ul S3 Buffer，立即迅速顛倒混勻，可見白色絮狀沉淀； 將上清加入純化柱中，5000rpm離心10min； 棄去收集管中液體，加入500ul除蛋白液PD Buffer，13000rpm離心1min； 棄去收集管中液體；加入700ul PE Buffer，13000rpm離心1min； 棄去收集管中液體；加入500ul PE Buffer，13000rpm離心1min； 棄去收集管中液體；13000rpm離心3min，以徹底去除乙醇； 將柱子放到一只干凈的1.5ml Eppendorf管中，加入50l ddH2O； 靜止放置2min,

31、 13000rpm 離心1min,收集離心液，-20保存。,質(zhì)粒的小量提取,堿裂解法（試劑盒）,挑取單菌落接種5毫升含適當抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)過夜。 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接200ml含同樣抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37劇烈振蕩培養(yǎng)12-16小時，細菌密度(OD600nm)達到1.0； 5000rpm離心15分鐘，棄上清； 重懸細菌于100ml冰預冷STE （0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0）。 5000rpm離心15分鐘，棄上清； 加10ml溶液1（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L

32、 EDTA，pH8.0）重懸，混勻，冰浴10分鐘； 加入20ml新配置的溶液2（0.2mol/L NaOH,1%SDS），混勻，冰浴10分鐘； 加入15ml預冷的溶液3（3.0mol/L KCl，pH 4.8），混勻，冰浴10分鐘； 10000rpm離心15分鐘，棄沉淀； 加入等體積的預冷異丙醇，混勻，-20沉淀1小時； 10000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥； 用3 ml TE（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0）溶解沉淀； 加入3 ml冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，10000rpm離心15分鐘，棄沉淀； 上清中加入等體

33、積冰預冷的異丙醇，充分混勻，10000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥； 500l含RNA酶（20ug/ml）TE（10mmol/L EDTA，pH8.0）溶解沉淀，轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，室溫放置30分鐘； 加入500l含13%聚乙二醇8000的1.6mol/L NaCl，充分混勻，-20沉淀2小時； 于臺式離心機上12000rpm離心10分鐘，棄上清； 加入400l TE（pH8.0）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次； 轉(zhuǎn)移水相至新的Eppendorf管，加100l 10M 乙酸銨，充分混勻； 加2倍體積無水乙醇，-20沉淀1小時； 12000rpm離心10分。用冰

34、預冷的70%乙醇洗滌沉淀一次，晾干； 50l TE（pH 8.0）溶解沉淀，儲存于-20冰箱。,質(zhì)粒的大量提取,聚乙二醇沉淀法,分子克隆步驟,轉(zhuǎn)化及感受態(tài)細胞, 目前常用的原核細胞轉(zhuǎn)化方法有兩類： 電穿孔轉(zhuǎn)化法、化學轉(zhuǎn)化法 電穿孔轉(zhuǎn)化法屬于物理方法，但由于受到儀器的限制，實驗室更常用的是化學轉(zhuǎn)化法。 化學轉(zhuǎn)化法原理：利用低溫（0）和CaCl2低滲溶液的處理，使宿主細胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)（competence cell）。此時菌體膨脹成球形，細胞壁和膜的通透性增強。DNA與Ca2+形成的羥基-磷酸鈣復合物黏附于菌體表面，42短暫熱沖擊處理（熱休克）后，黏附表面的重組DNA被吸

35、收進入宿主細胞，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長1小時左右，細胞形態(tài)復原，進入增殖分裂期。,挑取單菌落，接種無抗菌素的LB培養(yǎng)基，37搖床培養(yǎng)過夜。 次日按1：100轉(zhuǎn)種新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)搖床培養(yǎng)2小時左右，至菌液OD 600nm值為0.4-0.6時停止培養(yǎng)。 置冰上預冷10分鐘，然后4、5000rpm離心10分鐘，棄上清； 以10ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸細胞，放置于冰浴中20分鐘； 4、5000rpm離心10min，棄上清； 按每50ml培養(yǎng)物加入2ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2的比例重懸細胞沉淀，再加入15%體積滅菌甘油，混勻，然后分裝于Eppendorf管中，-7

36、0低溫冰箱中保存。,感受態(tài)宿主菌的制備,氯化鈣法,1前夜接種受體菌（DH5、DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜； 2取2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中，在37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6； 3將菌液迅速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作； 4吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘； 54下3000g冷凍離心5分鐘； 6棄去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??； 74下3000g冷凍離心5分鐘 8棄去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸

37、??； 94下3000g冷凍離心5分鐘 10加入20l冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??； 11立即使用或迅速置于-70C超低溫保存。,感受態(tài)宿主菌的制備,電轉(zhuǎn)化法,感受態(tài)宿主菌的制備,注意事項,1細菌的生長狀態(tài)：實驗中應密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5107/ml）； 2 所有操作均應在無菌條件和冰上進行； 3 經(jīng)CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24小時達到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的）； 4 化合

38、物及無機離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）； 5 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率； 6 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應主要是超螺旋的DNA； 7 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；,轉(zhuǎn)化（transformation）, 重組分子導入適宜的宿主細胞的過程就是轉(zhuǎn)化。 宿主細胞也稱為受體細胞，分為原核細胞和真核細胞兩類。 原核細胞以大腸桿菌為主，真核細胞包括酵母及動物細胞等。 在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指質(zhì)粒DNA或以

39、它為載體構(gòu)建的重組子導入宿主細胞的過程。通過宿主細胞的復制而使目的基因得到大量的擴增。,轉(zhuǎn)化的方法,化學的方法(熱擊法)：使用化學試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞； 電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。, 取100l感受態(tài)細胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操作)，加入適量質(zhì)粒DNA。 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min（1）抑制細胞的旺盛生理代謝；（2）有助于DNA-Ca2+吸附于細胞表面；（3）防止DNAase降解DNA，于42水浴中保溫1-2min使細胞攝入吸附于

40、其表面的DNA，然后迅速冰上冷卻2min。立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應原液，搖勻后于37振蕩培養(yǎng)約60min，使受體菌恢復正常生長狀態(tài)。 各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻。 菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng)，對于可以藍白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來說，此時應該能清楚地看到藍色和白色菌落。,轉(zhuǎn)化步驟,轉(zhuǎn)化結(jié)果分析,噬菌體,噬菌體概述,噬菌體概述,結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型 線狀體型

41、 核酸類型：雙鏈線性DNA 雙鏈環(huán)形DNA 單鏈環(huán)形DNA 單鏈線形DNA 雙鏈RNA 單鏈RNA,分子量： 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的 大分子量的噬菌體生命周期比較復雜，對寄主的依賴性較低 堿基組成： 有些噬菌體的DNA堿基不是由標準的A/T/C/G組成的 T4噬菌體DNA沒有C，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC） SP01噬菌體DNA中沒有T，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）,噬菌體概述,噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。除了對寄主的依賴性，還可保護自己的核苷酸分子（DNA/RNA）免遭環(huán)境化學物質(zhì)的破壞,噬菌體:基因組,一般結(jié)構(gòu)：48,502

42、bp，線狀ds-DNA，兩端具有12nt 5-突起，稱為cos位點，被編碼的末端酶所識別，通過粘性末端的互補作用形成雙鏈環(huán)形DNA。 46個基因，分為四類： 調(diào)控基因：C、N、CI、Cro、C，決定進入溶源化或裂解狀態(tài) DNA復制：O、P、Q 重組：int、xis、red和gam 噬菌體顆粒形成與細胞裂解：頭(A-F)、尾(E-J)、S & R （細胞裂解）、中部約1/3的DNA(b2)與存活無關(guān)。,DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,Long (left) arm,short (right) arm,Exogenous DNA (20-2

43、3 kb), phage,12bp,溶菌階段 (復制和釋放),噬菌體溶源階段,溶源性（lysogeny）：噬菌體在大腸桿菌體內(nèi)可以呈環(huán)行分子存在于細胞質(zhì)中，也可通過整合酶的作用而整合到寄主染色體上成為原噬菌體狀態(tài)，并與寄主染色體一起復制并隨細菌的分裂而傳代，這種現(xiàn)象稱為噬菌體的溶源性。 只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。,在某種刺激下會從宿主DNA中剪接出來，利用宿主細胞內(nèi)的酶系和蛋白進行自我復制，產(chǎn)生許多子代噬菌體，裂解并從宿主細胞中釋放的過程稱裂解性循環(huán)。,噬菌體基因組中部約占全長三分之一的區(qū)域是噬菌體復制的非必需區(qū)，外源DNA替代這一區(qū)域不會影響噬菌體的復制。用作克隆載體的噬菌體的衍

44、生物包含有非必需區(qū)兩側(cè)的限制性內(nèi)切酶識別位點。,噬菌體載體,Lytic phase (Replicate and release),Lysogenic phase (integrate into host genome),外源DNA插入載體DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，后者可感染宿主菌并大量復制。 噬菌體載體的優(yōu)點：克隆容量大，可插入較大片段。包裝后的噬菌體就是具有感染性的完整病毒顆粒，感染效率非常高。 噬菌體包裝時對基因組的大小有一定限制，頭部只能容納自身DNA的78-105%，即39-52.5 Kb。天然僅可插入3Kb外源DNA片段，除去所有與裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22K

45、b。因而要根據(jù)目的DNA片段的大小選擇不同的噬菌體載體。,噬菌體載體,噬菌體載體的主要類型 1.插入式載體 一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的載體。 2.替換型載體（取代型載體） 具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。,插入式載體 cI基因插入失活：如gt10、NM1149等載體，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。 若不插入外源基因 溶源 混濁斑 若CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑,cI,EcoR I,LA 32.7,RA10.6,gt 10,lac Z,LA 19.9,RA21.9

46、,EcoR I,Charon 16A,插入式載體 Lac Z基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。,外源DNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體感染和復制非必要的片段(小于20kb) 高感染效率(109轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA, 比質(zhì)粒高100倍),替換型載體（取代型載體）,替換型載體克隆外源DNA的步驟 1.應用適當?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化載體， 除去可取代的DNA片段； 2.將上述所得的DNA載體臂同外源 DNA片段的連接； 3.對重組體的DNA分子進行包裝和增殖， 以得到有感染性的重組噬菌

47、體,體外包裝 噬菌體DNA體外重組后，先要在體外包裝成噬菌體顆粒，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導入細胞內(nèi)。 體外包裝需要用包裝提取物，即噬菌體感染大腸桿菌的溶菌液。這種溶菌液含有噬菌體的空殼（頭部），未吸附的尾部，和包裝所需的噬菌體編碼的蛋白質(zhì)。通過cos位點相連成多聚體的DNA逐漸進入噬菌體頭部，并在cos位點處切開。然后噬菌體的尾部吸附到已填滿的頭部，從而完成了一個病毒顆粒的裝配。 以感染方式導入細胞的頻率可達106-108/gDNA，而以轉(zhuǎn)染方式導入的頻率僅為103-105/gDNA。 噬菌體的包裝限制為野生噬菌體DNA（約48.5kb）的75%-105%。,噬菌體的空斑試驗 培養(yǎng)

48、基 肉湯培養(yǎng)基：每升含胰蛋白胨10克，氯化鈉2.5克，高壓滅菌15磅30分鐘； 肉湯平板：基本同上，每升加瓊脂10克； 頂層培養(yǎng)基：基本同上，每升加瓊脂7克。高壓后室溫保存?zhèn)溆?。使用前在水浴或微波爐溶化，然后冷卻至45-50，并維持在該溫度，可保持溶化狀態(tài)。,噬菌體的空斑試驗 步驟 1、在含2%麥芽糖和10mmol/L硫酸鎂的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌至飽和。在微波爐或沸水浴中溶化頂層瓊脂培養(yǎng)基，然后冷卻并維持在45-50水浴。 2、取5個小試管，每管加入0.3毫升大腸桿菌培養(yǎng)液。將噬菌體溶菌液在肉湯培養(yǎng)基中1：1000連續(xù)稀釋，然后每個稀釋度取0.1毫升分別加到含0.3毫升大腸桿菌的試管中，與

49、大腸桿菌培養(yǎng)液混勻，在室溫孵育20分鐘。 3、將上述試管移到37水浴中保溫10分鐘。 4、每管中加入2.5毫升頂層培養(yǎng)基，輕搖混合，然后小心地倒在肉湯平板上。輕輕地傾斜平板使頂層瓊脂均勻地鋪到整個平板。整個過程要避免產(chǎn)生氣泡。 5、置37孵箱培養(yǎng)。一般6-8小時即可看到噬斑，12小時后即可清楚地計數(shù)和挑選噬斑。,噬菌體的空斑試驗 制備噬菌體裂解液 1、可用毛細吸管或牙簽從上述噬菌體平板上挑取單個噬斑，置0.4毫升肉湯培養(yǎng)基中，放振蕩器上劇烈振蕩以釋放出噬菌體； 2、取0.1毫升噬菌體，與0.1毫升過夜培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)液和0.1毫升鈣鎂溶液（10mmol/L MgCl2, 10mmol/L C

50、aCl2）混合，置37水浴孵育15分鐘。然后轉(zhuǎn)移到50毫升NZC肉湯培養(yǎng)基（每升含NZ胺A 10克，氯化鈉 5克，MgCl2.6H2O 2克），置37搖床培養(yǎng)。一般6-8小時會出現(xiàn)裂解，一旦培養(yǎng)液變清亮，就立即收獲。 3、加幾滴氯仿裂解仍存在的菌體。將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，于4離心10,000 r/min (12000g)10分鐘以去除細胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到干凈管中，加幾滴氯仿，混勻后放4保存。,噬菌體的空斑試驗 提取噬菌體DNA 酚/氯仿抽提 1、加等體積的飽和酚至噬菌體液中，溫和地攪拌或振搖20分鐘。離心5000r/min 10分鐘。將上清移到新的管中，再加等體積飽和酚混合。共抽提三次。

51、2、加入1/10 體積的5mol/L NaCl，2倍體積的無水乙醇（或0.6體積的異丙醇），室溫放置20分鐘。 3、離心1,500 g 15分鐘，棄上清。將沉淀用70%乙醇洗1-2次。低溫干燥。 4、重溶于TE緩沖液中。 甲酰胺抽提（更快捷溫和） 1、加1/10體積的2mol/L Tris.Cl (pH 8.5)/0.2 mol/L EDTA, 混勻后加入等體積的甲酰胺，混勻，室溫放置30分鐘。 2、加兩倍體積的無水乙醇。室溫放置20分鐘。 3、離心1,500g 15分鐘，棄上清。將沉淀用70%乙醇洗1-2次。低溫干燥。 4、重溶于TE緩沖液中。,M13噬菌體載體 M13是一種含ssDNA的絲

52、狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb，90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有11個編碼基因，基因之間間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因和以及基因和之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達和 DNA 合成的元件。DNA為正鏈，按基因至方向合成。 M13噬菌體基因組可編碼3類蛋白質(zhì)，包括復制蛋白（，和），形態(tài)發(fā)生蛋白（，和），結(jié)構(gòu)蛋白（、 和 ）。,M13單鏈DNA噬菌體的生命周期,成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細胞，因為這種噬菌體的感染位點在性散毛上。但是無論是RF DNA或ssDNA都能轉(zhuǎn)染E.coli的F+或F-細胞。,RF DNA,感染Ecoli后，在宿主細胞內(nèi)會形成雙鏈復制型，可以象

53、質(zhì)粒那樣在體外進行純化和操作。,M13載體 這類載體主要用來獲得大量的單鏈片段，主要用來測序（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變、異源雙鏈DNA的分析等。 具有MCS，方便克隆。許多M13載體的MCS與質(zhì)粒載體pUC序列的MCS相同，在克隆位點選擇上更為方便。 M13子代噬菌體中總是只含有（）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源克隆時的取向。這樣一來，為分別分離外源分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的的方法就是定向克隆技術(shù)。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了

54、單鏈的形式。所以如果要同時分離分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。,M13載體系列的優(yōu)點這類載體基因組中有一條飾變的LacZ片段，插入了一段密集MCS；M13載體系列應用基因工程技術(shù)成對地構(gòu)建，可有效克隆雙鏈DNA分子中每一條鏈。,單鏈DNA噬菌體載體 M13、f1、fd 優(yōu)越性： 1.單鏈DNA噬菌體的復制，以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介，這種復制形式的DNA簡稱RFDNA； 2.不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌； 3.單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的制約的，不存在包裝限制問題，這一點正好與噬菌體相反。 4.容易測定外源DNA片斷的插入取向； 5.可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。 缺點： 1.插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降； 2.實際克隆能力小于1500bp（雖無包裝限制，并非無限包裝）。,載體