土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)公開課課件.ppt

1、專題2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌能利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。,4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,.設(shè)置對照,1、實(shí)例： PCR技術(shù),啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，

2、到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,原因：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制(PCR)的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等； 方法： 抑制大多數(shù)微生物的生長 促進(jìn)目的菌株的生長 結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)

3、數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基,5、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離 尿素 細(xì)菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性,只生長尿素細(xì)菌,生長多種

4、微生物,是,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板），在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn)：,2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,？,說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

5、時，一定要涂布至少3個平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。,注意事項(xiàng) 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,土樣不同 培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其

6、他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,假設(shè)一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),假設(shè)二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,如何驗(yàn)證?,15,可編輯,（三）設(shè)置對照,判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：,將未接種的培養(yǎng)基同時進(jìn)行培養(yǎng)。,判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：,完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。,主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信

7、度。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,“微生物的天然培養(yǎng)基”,一土壤取樣,數(shù)量最大、種類最多,大約70%90%是細(xì)菌,取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。,二制備培養(yǎng)基,由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103107。 可準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)

8、基是否起到了選擇作用。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板,（三）樣品的稀釋,問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。 結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同

9、時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了至少2個菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,菌落的形狀、大小

10、、隆起程度和顏色,操作提示,一無菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品 的稀釋度等。 三規(guī)劃時間,三、,四、課題成果與評價(jià),培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落,對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分