課題3　血紅蛋白的提取和分離

1、,專題五DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),課題三血紅蛋白的提取和分離,1說(shuō)出提取生物大分子的基本過(guò)程和方法； 2知道色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。,一、蛋白質(zhì)的分離原理 1依據(jù)：蛋白質(zhì)特性的差異 (1)分子_。 (2)溶解度。 (3)吸附性質(zhì)。 (4)所帶_的性質(zhì)和多少。 (5)對(duì)其他分子的親和力。,形狀和大小,電荷,2凝膠色譜法 (1)概念：凝膠色譜法也稱做_，是根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的_，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)分離蛋白質(zhì)的有效方法。,分配色譜法,相對(duì)分子質(zhì)量的大小,(2)原理：大多數(shù)凝膠是由_構(gòu)成的小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，_的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的

2、通道，路程_，移動(dòng)速度_；而_的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在_移動(dòng)，路程_，移動(dòng)速度_。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。 (3)凝膠材料：_性，_類化合物，如_或_。,多糖類化合物,相對(duì)分子質(zhì)量小,較長(zhǎng),較慢,相對(duì)分子質(zhì)量較大,凝膠外部,較短,較快,多孔,多糖,葡聚糖,瓊脂糖,3緩沖溶液 (1)作用：在_內(nèi)，能夠抵制_對(duì)溶液_的影響，維持_基本不變。 (2)配制：通常由_溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以制得在_使用的緩沖液。,一定范圍,外界的酸和堿,pH,pH,12種緩沖劑,使用比例,不同pH范圍內(nèi),4電泳 (1)概念：帶電粒子在_的作用下發(fā)生_的過(guò)程。 (2)原理：許多

3、重要的生物大分子，如_、_等都具有_的基團(tuán)，在一定pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上_或_。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著_移動(dòng)。電泳利用了分離樣品中各種分子_以及分子本身的_、_不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的_，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,電場(chǎng),遷移,多肽,核酸,可解離,正電,負(fù)電,與所帶電荷相反的電極,帶電性質(zhì)不同,大小,形狀,遷移速度,(3)分類：_凝膠電泳、_凝膠電泳。 在測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量時(shí)通常使用_ _凝膠電泳。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它_以及_等因素。而在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生_，由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)_成單條肽鏈，因此

4、測(cè)定的結(jié)果只是_的相對(duì)分子質(zhì)量。同時(shí)SDS所帶的大量負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于_。,瓊脂糖,聚丙稀酰胺,SDS聚丙烯,酰胺,所帶凈電荷的多少,分子的大小,完全變性,解聚,單條肽鏈,分子的大小,二、實(shí)驗(yàn)操作 1樣品處理 (1)紅細(xì)胞的洗滌 采集血樣_離心用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿下層暗紅色的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌低速短時(shí)間離心_三次。,低速短時(shí)間,重復(fù)洗滌,蒸餾水,10 min,(3)分離血紅蛋白溶液 將血紅蛋白溶液離心將試管中的液體用_過(guò)濾除去脂溶性沉淀層于分液漏斗中靜置片刻分出下層的_。 2粗分離：即透析，取1 mL

5、的血紅蛋白溶液裝入_中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的_中(pH為7.0)。,濾紙,紅色透明液體,透析袋,磷酸緩沖液,3純化：即樣品的加入和洗脫 (1)調(diào)整緩沖液面：與_平齊。 (2)滴加透析后的樣品：用量為1 mL，不要破壞_。 (3)打開(kāi)_，使樣品滲入凝膠床，樣品完全進(jìn)入凝膠層后關(guān)閉下端的出口。 (4)洗脫：打開(kāi)下端出口，用磷酸緩沖液洗脫，不能發(fā)生_現(xiàn)象。 (5)收集：待_接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，連續(xù)收集。,凝膠面,凝膠面,下端的出口,洗脫液流干,紅色蛋白質(zhì),4純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是_電泳。,SDS聚丙烯酰胺凝膠,1怎樣判斷是否

6、完成了血液樣品的處理？ 提示：觀察你處理的血液樣品離心后是否分層。如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少，未能去除血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、操作提示 1紅細(xì)胞的洗滌：_、_與_十分重要。_過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白；_過(guò)高和_過(guò)長(zhǎng)會(huì)使_等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。 2色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在_中膨脹，可以將加入其中的_用_加熱，加速膨脹。,洗滌次數(shù),離心速度,離心時(shí)間,洗滌次數(shù),離心速度,時(shí)間,白細(xì)胞,洗脫液,濕凝膠,沸水浴,3凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。氣泡

7、會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的_，降低_。 4蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶_地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。,洗脫次序,分離效果,均勻一致,2隨著人類跨入基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，人們首先要做到的第一步是什么？ 提示：獲得高純度的蛋白質(zhì)。,一、實(shí)驗(yàn)操作分析 1樣品處理、分離與純化的目的不同,2.分離血紅蛋白溶液的結(jié)果 溶 液 分 為 4 層,3凝膠色譜操作 (1)凝膠色譜柱的制作 取長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端磨平； 柱底部制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目的尼龍紗將橡皮塞上部包好； 柱頂部制作：打孔安裝玻璃管； 將上述三部分按相應(yīng)位置組裝

8、成一個(gè)整體。,(2)凝膠色譜柱裝填(過(guò)程) 計(jì)算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。 凝膠溶脹：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配制成凝膠懸浮液。 固定：將色譜柱垂直固定在支架上。 裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。 洗滌平衡：用20 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密。,4注意事項(xiàng) 凝膠色譜柱的裝填時(shí)，不能有氣泡存在，不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒現(xiàn)象，否則需要重新裝填。 如果凝膠長(zhǎng)期不用，可以加入抑菌劑，低溫保存，使用時(shí)再進(jìn)行充分平衡。,解析：本實(shí)驗(yàn)中使用的交聯(lián)葡聚糖凝膠(G75)，其中G表示凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，

9、即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5 g；氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果，因此，一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡，必須重裝；在洗脫過(guò)程中，應(yīng)在約50 cm高的操作壓下，用300 mL物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12小時(shí)，以使凝膠裝填緊密；凝膠溶脹時(shí)，應(yīng)使用蒸餾水將其充分溶脹，制成凝膠懸浮液。 答案：D,二、課題成果分析與評(píng)價(jià) 1血液樣品的處理 分層明顯樣品處理完成 分層不明顯原因：洗滌次數(shù)少，未能除去血漿蛋白；離心速度過(guò)快和時(shí)間過(guò)長(zhǎng),2凝膠色譜柱的裝填 放一支與凝膠柱垂直的日光燈直接檢查是否裝填得均勻 加入大分子有色物質(zhì)，色帶均勻、狹窄、平整裝填成功,3血紅蛋白的分離 血

10、紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，洗脫液緩慢流出分離成功 血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬分離效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān),2關(guān)于樣品的加入和洗脫的敘述正確的是() A先加入1 mL透析后的樣品 B加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出 C如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功 D洗脫時(shí)可以用緩沖液也可以用清水 答案：C,血紅蛋白的提取與分離,如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實(shí)驗(yàn)裝置，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：,(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，它在紅細(xì)胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質(zhì)具有_功能。 (2)甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是_；乙裝置中，C溶液的作用是_。 (3)甲

11、裝置用于_，目的是_。 用乙裝置分離蛋白質(zhì)的方法叫_，是根據(jù)_分離蛋白質(zhì)的有效方法。 (4)用乙裝置分離血紅蛋白時(shí)，待_時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。,解析：用透析法(如圖甲)對(duì)血紅蛋白進(jìn)行粗分離，將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，可以除去樣品中分子較小的雜質(zhì)。血紅蛋白的純化采用凝膠色譜法(如圖乙)，血紅蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大，無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路徑較短，移動(dòng)速度較快，可以收集到紅色的蛋白質(zhì)。 答案：(1)運(yùn)輸(2)磷酸緩沖溶液洗脫血紅蛋白(3)透析(粗分離)去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)凝膠色譜法相對(duì)分子質(zhì)量的大小(4)紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱的底端,

12、電泳技術(shù)的原理與操作,A電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程 B帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) C蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少 D用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小,解析：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。 答案：C,旁欄思考 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？ 提示：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分