中藥質(zhì)量控制新方法(TLC-彭維).ppt

1、薄層色譜法在中藥質(zhì)量分析中的應(yīng)用,彭維,一、中藥質(zhì)量控制常用的分析方法,容量分析 定性：顏色反應(yīng) 沉淀反應(yīng) 氣體生成 氣味變化 定量：四大滴定法 光譜法 定性：UV、IR 定量：UV、Flu（計算分析） 色譜法 定性： 定量：,常用的色譜分析方法,薄層色譜法（TLC） 柱色譜 高效液相色譜法（HPLC） 氣相色譜法（GC） 離子色譜 高效毛細(xì)管電泳色譜（HPCE） 高速逆流色譜（HSCCC）,常用的薄層色譜法,紙色譜 正相色譜 反相色譜 薄板色譜 分配薄層色譜 吸附薄層色譜 離子交換薄層色譜 凝膠薄層色譜 薄膜色譜 聚酰胺 薄膜電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳,二、薄層色譜的基本參數(shù),比移值：Rf=

2、原點中心至斑點中心的距離 原點中心至溶劑前沿的距離 Rf=0 斑點仍在原點 Rf=1 斑點已到前沿 相對比移值R(I.S)=Rf(I)/Rf(S),Rf在10之間,前沿,原點,二、薄層色譜的基本參數(shù),分配系數(shù)（K） K=CL/CM 容量因子（k=(1-Rf) Rf） k=0的組分Rf1，表示該組分不被固定相保留 k=的組分Rf0，表示該組分不被流動相帶走,完全被固定相保留 在吸附或分配色譜中，在選定固定相后，就是要通過改變流動相的極性，改變?nèi)萘恳蜃?，達(dá)到改變被分離物的Rf目的,二、薄層色譜的基本參數(shù),理論塔板數(shù)（n） 在選定了固定相、展開劑后，理論塔板數(shù)取決于吸附劑的粒度、均勻度、活度、及展開

3、劑的流速、展開溫度、濕度、展開方式 n16（D / W）2 D為原點到前沿的距離；W為組分斑點寬度,二、薄層色譜的基本參數(shù),分離度（R） R d (W1+W2)/2 d為相鄰兩斑點間的距離 W1和W2分別為相鄰兩斑點的寬度 R1.5時，兩斑點達(dá)到基線分離,三、TLC常用儀器,自動鋪板器,三、TLC常用儀器,三、TLC常用儀器,自動點樣器,三、TLC常用儀器,全自動多級展開儀,三、TLC常用儀器,自動噴霧器 自動加熱器,三、TLC常用儀器,TLC儀器,四、薄層色譜的基本流程,制備固定相,樣品溶液的制備,色譜前衍生化,薄層板活化,展開,展開,定位,顯色,濾紙或薄層板預(yù)平衡,定性,定量,點樣,濾紙或

4、薄層板預(yù)處理,（一）TLC薄層板制備：,將1份固定相和3份0.31.0%Na-CMC溶液（水、NaOH溶液）在研缽中向一方向研磨混合，去除表面及內(nèi)部的氣泡后， 倒入涂布器中，在玻璃板上平穩(wěn)地移動涂布器進(jìn)行涂布（厚度為0.20.3mm）， 取下涂好薄層的玻璃板，置水平臺上于室溫下晾干，后在110烘30分鐘。 即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。,（二）供試品溶液的制備,超聲振蕩法：采用溶劑超聲提取出樣品中待測成分，舍棄其他成分。 加熱回流法：采用溶劑回流提取出樣品中待測成分，舍棄其他成分。 溶劑萃取法：采用溶劑萃取出樣品中待測成分，舍棄其他成分。 注意：定

5、性和定量的差別。,（三）點樣：,除另有規(guī)定外，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊1.02.0cm，點樣直徑為24mm，點間距離約為1.52.0cm，點間距離可視斑點擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。 點樣時必須注意勿損傷薄層表面。,（三）點樣：,使用的材料點樣器材 定量點樣毛細(xì)管（美國） 微量注射器（針尖平頭） 自動點樣器,（四）展開：,展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂?shù)纳w，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。 將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.51.0cm（切勿將樣

6、點浸入展開劑中），密封室蓋，等展開至規(guī)定距離（一般為1015cm），取出薄層板，晾干，按各品種項下的規(guī)定檢測。,（五）顯色,自然光 UV（254、366nm） 熒光 碘熏、氨熏 噴顯色劑（晾干或加熱后） 多次顯色,（五）專屬性顯色劑,黃酮類：AlCl3試液 香豆素類：氨熏、NaOH試液 內(nèi)酯類：硫酸乙醇液 酚類：FeCl3試液,五、TLC的固定相,常用固定相或載體：硅膠G、硅膠CMC 硅膠GF254 、硅膠GF366 硅膠H、硅膠R、硅膠P 硅膠HF254、硅膠（60、40） 硅藻土、 硅藻土G、 氧化鋁、 氧化鋁G、 微晶纖維素、 微晶纖維素F254等。,TLC常用固定相,手工自制板： 玻璃

7、：12mm優(yōu)質(zhì)平板玻璃 光潔、平整 洗凈至不掛水珠，晾干 預(yù)制板：普通薄層板和高效薄層板 商品硅膠G（石膏作粘合劑） 硅膠GF254（熒光劑） 粘合劑：羧甲基纖維素鈉水溶液（0.20.5）,（一）TLC 常用固定相的選擇與應(yīng)用,固定相 分離機(jī)制 主要應(yīng)用范圍 氧化鋁 吸附色譜 生物堿、甾體、萜類、脂肪、芳香化合物 硅膠 未改性硅膠 吸附色譜 硅膠60 三萜皂苷、香豆素、揮發(fā)油 高純硅膠60 改性硅膠 生物堿 C2、C8、 C18、RP板 正相及反相 CHIR（手性） 配體交換色譜 對映體的分離 NH2板 正相 核酸、農(nóng)藥、酚類、嘌呤及衍生物、 甾類、維生素類、磺酸類、羧酸類、 磺嘌呤類等 CN

8、板 正相及反相 農(nóng)藥、酚類、防腐劑、甾類 DIOL板 弱陰離子 交換色譜 色譜 甾類、激素類,（一）TLC 常用固定相的選擇與應(yīng)用,固定相 分離機(jī)制 主要應(yīng)用范圍 纖維素 未改性纖維素 分配色譜 氨基酸、羧酸及碳水化合物 乙?；w維素 正相、反相 蒽醌類、抗氧劑、多環(huán)芳香、硝基化物 離子交換纖維素 陰離子交換 氨基酸、肽、酶、核酸、核苷類 DEAE纖維素 離子交換 核酸水解產(chǎn)物、單及多核苷酸 硅藻土 處理后作反相 黃曲霉素、除草劑、四環(huán)素 聚酰胺 分配色譜 黃酮類、酚類 葡聚糖凝膠 分子篩 蛋白質(zhì)、核苷酸、多糖等 其他 磷酸氫鈣 吸附色譜 類胡蘿卜素、維生素E 三聚硅酸鎂 吸附色譜 類胡蘿卜素

9、、維生素E 氫氧化鈣 吸附色譜 類胡蘿卜素、維生素E 硫酸鈣 吸附色譜 脂肪酸、甘油酯 氫氧化鐵 吸附色譜 極性化合物 活性炭 吸附色譜 非極性化合物,TLC用硅膠的技術(shù)數(shù)據(jù),薄層用硅膠的技術(shù)數(shù)據(jù) 參數(shù) 范圍 典型值 密度/（g/cm2） 0.3-0.5 0.4 比表面積/(m2/g) 400-600 500 孔經(jīng)/nm 2-15 6 pH 5-7 7.0 粒度/m 10-50 40,TLC用硅膠的技術(shù)數(shù)據(jù),硅膠、氧化鋁活度與吸附性的關(guān)系 活度級別 含水量 吸附力 硅膠 氧化鋁 10 3 12 6 15 10 20 15,增強(qiáng),TLC中的流動相,一、溶劑的分類 第類為電子受體溶劑：甲苯、苯、氯

10、苯、四氫呋喃、乙酸乙酯、丙酮、乙腈。 第類為質(zhì)子給予體溶劑：異丙醇、正丁醇、無水乙醇、甲醇。 第類為強(qiáng)質(zhì)子給予體溶劑：氯仿、冰醋酸、甲醇及水。 第類為質(zhì)子受體溶劑：三乙胺、乙醚 第類為偶極作用的溶劑：1,2二氯乙烷、二氯甲烷 第類為惰性溶劑：環(huán)己烷、正乙烷、四氯化碳,TLC中的流動相,二、溶劑強(qiáng)度 溶劑強(qiáng)度是指單一或混合溶劑洗脫某種溶質(zhì)的能力 正相色譜中：流動相溶劑強(qiáng)度增大，洗脫力增強(qiáng) 反相色譜中：流動相溶劑強(qiáng)度增大，洗脫力減弱,定性方法舉例,【鑒別】取本品10ml，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取橙皮對照藥材1g，加60乙醇適量，置水浴上面回流半小時，濾過，濾液置水

11、浴上濃縮至干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為對照藥材溶液。再取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄 B）試驗，吸取上述三種溶液各2l，分別點于同一用0.5氫氧化鈉溶液制備的硅膠G板上，以醋酸乙酯甲醇水（100：17：13）為展開劑，展距約3cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，分別在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。,靈敏度試驗及點樣順序,1 2 3 4 5 6 7 8 9,1 2 3 4 5 6,定量方法舉例,點樣順序及要求,光譜掃描選擇測定波長及參比波長,純度檢測的方法之一,有關(guān)物質(zhì),取本品，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1ml含1mg的溶液，作為供試品溶液；另取本品，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液