用層析法分離、復(fù)性包涵體

1、用層析法分離、復(fù)性包涵體谷振宇 Jan-Christer Janson 蘇志國中國科學(xué)院過程工程研究所摘要 這里提出了一種用柱層析直接從Ecoli破碎原漿中分離純化及復(fù)性包涵體的新方法。將傳統(tǒng)的離心分離一步凝膠過濾所取代。分離的原則是選擇合適的介質(zhì)，使之僅排阻包涵體顆粒，而其它的組份都可以進(jìn)入并穿過凝膠介質(zhì)。在新的復(fù)性方法中，逐步遞減的變性劑(urea或Gu-HCl) 梯度與逐步遞增的pH梯度相結(jié)合，通過凝膠過濾(排阻上限小于蛋白質(zhì)分子量) 層析來進(jìn)行復(fù)性。溶解在高濃度變性劑及低pH中的變性樣品， 然后加入到梯度形成好的層析柱中。在層析過程中，變性蛋白質(zhì)的下行速度大約是變性劑下行速度的3 倍。

2、因此，變性蛋白會(huì)經(jīng)過已經(jīng)形成好的變性劑和pH梯度，并逐步脫除變性劑，逐步地升高pH，這樣可以促進(jìn)正確的折疊。梯度的形狀和程度，及流速都會(huì)影響復(fù)性率，而且可以針對不同蛋白質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以得到優(yōu)化的條件。我們在此實(shí)驗(yàn)中選擇的目標(biāo)蛋白質(zhì)為大腸桿菌表達(dá)的scFv 融合蛋白包涵體。Rudolph和Lile的綜述已經(jīng)對蛋白質(zhì)的體外復(fù)性做詳細(xì)的介紹1。傳統(tǒng)的分離、復(fù)性方法如：分步離心，稀釋和透析通常很耗時(shí)且復(fù)性率低。本文中介紹了以凝膠過濾為基礎(chǔ)發(fā)展起來的分離及復(fù)性方法。此方法的一個(gè)優(yōu)勢是變性劑的脫除，流速及pH的變化可以很容易的調(diào)節(jié)。大腸桿菌表達(dá)的scFv 融合蛋白質(zhì)包涵體。ScFv 片段在Eocli 中表達(dá)

3、量很高，但經(jīng)常會(huì)形成包涵體。因此需要進(jìn)行復(fù)性。材料與方法 脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸 (arginine)、Triton X-100和DNAse購于Sigma。GSSG，GSH購于Roche。Berol 185 購于Akzo Nobel 表面化學(xué)公司，Sweden。所有層析介質(zhì)均為Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品。其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 純水系統(tǒng)生產(chǎn)。所有層析實(shí)驗(yàn)在AKTA Explorer 層析工作站上進(jìn)行。用于scFv57P 活性檢測的Biacore 2000 為Biacore(Sweden)

4、 公司生產(chǎn)。電泳設(shè)備采用Amersham PharmaciaBiotech 公司的PhastSystem 電泳設(shè)備?？寺∨c表達(dá)scFv57P Fab57P 的scFv 抗體片段是通過VH-linker-VL 的走向構(gòu)建成pscFvHL57P 2。載體選擇用pscFew，它有一段可以使蛋白質(zhì)表達(dá)到周質(zhì)的pelB 引導(dǎo)序列；一個(gè)15-aa linker,VH-SRGKSSGSGSESKST-VL，來連接抗體可變區(qū)的兩個(gè)domain；C-terminal 的B10tag 用于免疫識(shí)別3 。在pscFvHL57P 中VH domain 被設(shè)計(jì)成XhoI-XbaI 位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，VL dom

5、ain 被設(shè)計(jì)成SacI-SpeI 位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段。 ScFv57P 抗體片段通過前人的方法表達(dá)在E.coli 中4。通過Western blot鑒定（用抗B10的抗體），發(fā)現(xiàn)表達(dá)的scFv57P形成對還原劑敏感的聚集體。經(jīng)BIAcore 鑒定細(xì)胞周質(zhì)提取物原液，發(fā)現(xiàn)活性抗體片段的產(chǎn)量為5-10 g/l5。在pBAD/Thio-TOPO 中克隆及過量表達(dá)scFv57P 以質(zhì)粒pscFvHL57P為模版，將編碼scFv57P的目的片段基因用PCR擴(kuò)增。正相引物為(5- acactgggatccatggcccaggcccaggtgaaactgctcgag-3），其中包含了T7 RNA p

6、olymerase的增強(qiáng)子和scFv57P 中Vh的起始基因片段(下劃線部分)。反相引物為5- cacgatgcggccgctcgagtcgactaaacgttcgcgaccgccctgacg- 3 用來保持原始pscFvHL57P 構(gòu)建的C端的B10 tag (下劃線部分）。擴(kuò)增產(chǎn)物在N端多出4 個(gè)氨基酸，在C 端多出8個(gè)氨基酸(在B10 tag之后)，這是為了增加了幾個(gè)不同的單一的酶切位點(diǎn)，簡化后繼的克隆表達(dá)。PCR 過程如下：95 (1 min) - 43 (1 min) - 72 (2 min), 30個(gè)循環(huán)。然后根據(jù)產(chǎn)品手冊中的說明將擴(kuò)增的目標(biāo)基因直接嵌入pBAD/ThioTOPO

7、（Invitrogen company) 質(zhì)粒載體中，然后轉(zhuǎn)化入TOP10 E.coli 宿主菌細(xì)胞內(nèi)。在最終scFvHL57P 在N 端與thioredoxin (Trx) 融合在一起(Fig. 1B) 并包括一個(gè)源于pscFvHL57P 的B10 tag，V5tag，GKPIPNPLLGLDST 和在C 端的一個(gè)源于pBAD/Thio-TOPO 的6*His 的tag。陽性克隆通過檢測過量表達(dá)產(chǎn)物的分子量來確定，對應(yīng)的分子量應(yīng)與構(gòu)建的thioredoxin-VH-linker-VL-B10-V5-6His相一致。圖1. A:不同的scFv57P的構(gòu)建；B:trx-scFvL57P連接到pB

8、AD/Thio-TOPO vector上的方式。 表達(dá)單鏈抗體融合蛋白的TOP10 E.coli 在含有Ampicillin（100 g/ml) 的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 = 0.5，然后用0.01% 的L-arabinose 誘導(dǎo)。在37下用搖床培養(yǎng)4-5 小時(shí)后融合蛋白質(zhì)包涵體含量達(dá)到最大，約為總蛋白質(zhì)的50%左右。盡管thioredoxin 的可溶性很好，但thioredoxinscFv57P融合蛋白質(zhì)仍以包涵體形式存在。傳統(tǒng)離心的方法分離包涵體蛋白質(zhì) 破碎緩沖液組成：20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAs

9、e (10 g/g cell) 細(xì)胞破碎緩沖液中不含脲等變性劑，故不溶解包涵體。稱取5 g大腸桿菌菌體溶于40 ml 破碎緩沖液中，攪均。用French press 進(jìn)行破碎操作，至少進(jìn)行三次循環(huán)。破碎后的勻漿在10,000 rpm下離心30 min 后，棄去上清液。離心后的沉淀物質(zhì)分別用含0.05% Chaps, 0.05% Triton X-100及2 mol/l NaCl 的細(xì)胞破碎緩沖液進(jìn)行懸浮、洗滌并離心。洗完后將沉淀用40 ml的破碎液懸浮，并加入urea 至終濃度為8M，再加入DTE至0.2 mM，室溫放置5-6小時(shí)后用10,000 rpm下離心30 min棄去沉淀。溶解了的包涵

10、體蛋白質(zhì)溶液用HCl 調(diào)pH 到2-3之間，將樣品加入Sephadex G-25 desalting column。在此之前此脫鹽柱先用20 mmol/l Tris-HCl，pH2.0，1mmol/lEDTA，8mol./l 脲充分平衡。用凝膠過濾分離包涵體蛋白質(zhì) 在前面的細(xì)胞破碎液內(nèi)再加入60 g/ml的溶菌酶及0.1%的Trition X-100。3.24 g 的E.coli 用25 ml 的破碎液懸浮。經(jīng)過French Press破碎后(循環(huán)三次)，將破碎液直接加入到1.6*60 cm (120 ml) 的Sepharose HP，這是一種平均粒徑為34m的高度交聯(lián)的agarose 基質(zhì)

11、膠(通常 是Sepharose 類介質(zhì)的基質(zhì))，它的排阻極限與Sepharose 4B 相似(對球形蛋白質(zhì)為20 MDa)。柱子用含0.1% Berol 185 的破碎液來平衡。因?yàn)樗呐抛铇O限很大，可以讓其它蛋白，核酸及其它細(xì)胞器等滲入凝膠內(nèi)部，而只將包涵體蛋白質(zhì)排阻在外。這樣只收集在空體積V0 流出的峰，然后在用8 M urea 和0.2M DTE 完全溶解，還原后在室溫下放置5-6 小時(shí)。然后再按照前面離心分離的方法，進(jìn)行酸化后備用。最終溶解的蛋白質(zhì)濃度為5.7 mg/ml，以此作為后繼復(fù)性的起始樣品液。用稀釋法復(fù)性包涵體蛋白質(zhì) 在稀釋復(fù)性中，對pH, GSH與GSSG的比例與濃度，精氨

12、酸濃度，樣品量及復(fù)性溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的復(fù)性緩沖液組成即做為其它復(fù)性方法的基礎(chǔ)。最優(yōu)化的復(fù)性液組成為：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含0.5 M 精氨酸，1mM EDTA, 1 mM GSH 及1 mM GSSG，這也就是后面常提到的復(fù)性緩沖液。25 ml 溶解了的包涵體(5.7 mg/ml 溶在8M urea) 樣品稀釋200 倍到此復(fù)性緩沖液中。金屬鰲合層析復(fù)性 用5 ml 的Hitrap chelating 柱子，先用Ni 離子飽和，再用含8 M urea 的復(fù)性液平衡。然后將100 ml 溶解了包涵體(5.7mg/ml 溶在8 M urea) 的樣品加入柱中

13、。用平衡液將基線洗平，然后用200 ml 的線性梯度逐步由含8 M urea 的緩沖液過渡到復(fù)性緩沖液中。然后用含0.2 M 的imidazole 將復(fù)性后的scFv 洗出柱子。并考察了流速對復(fù)性率的影響。透析復(fù)性 100 ml 溶解了的包涵體(5.7 mg/ml 溶在8 M urea) 4下在300 ml 復(fù)性緩沖液中透析過夜。用脲素及pH 梯度凝膠過濾復(fù)性 先將HiLoad 16/60 Superdex 30用一個(gè)由上至下線性減少的urea 梯度(8 M 到0.4 M)，同時(shí)還存在一個(gè)從2-7.5 的pH 梯度平衡上部的60%的柱體積。我們通過先在柱中加入0.4柱體積的pH 7.5 含0.

14、4 M urea的復(fù)性緩沖液，隨后用0.6 柱體積的線性梯度從pH 7.5 含0.4 M urea 的復(fù)性緩沖液變成8M urea pH 2 的溶液中來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。這樣當(dāng)樣品(溶于8M urea, pH 2.0 含5.7 mg/ml 的scFv 融合蛋白質(zhì)) 加入柱頂后也同樣處于與溶解液同樣的環(huán)境中。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子很大，并被所選凝膠介質(zhì)完全排阻在外，因此它向下的速度要比urea等小分子快得多。這樣可以通過預(yù)先形成的梯度，最后轉(zhuǎn)移到柱子底部的含0.4 M urea 的復(fù)性緩沖液中，從而達(dá)到逐步脫除變性劑的目的。這個(gè)轉(zhuǎn)移的速度由流速來控制，因此我們對流速在一定范圍內(nèi)(0.02到1.0 ml/min

15、) 對復(fù)性率的影響進(jìn)行了研究。同時(shí)也考察了樣品的量(100 l-1.0 ml) 對復(fù)性率的影響。每管收集1.0 ml。 在對照實(shí)驗(yàn)中，用無梯度或僅有urea 梯度凝膠過濾復(fù)性做為對照。其它條件與脲素及pH 梯度凝膠過濾復(fù)性一樣。復(fù)性率的測量 復(fù)性scFv的結(jié)合抗原活性是在BIAcore 2000 (Bioacore AB,Uppsala, Sweden) 上用BIA 的測量軟件來進(jìn)行測量。將具有抗原活性的小肽C19V NH2-CRGTGSNRSSFESSSGL VCONH2)通過-SH基團(tuán)偶聯(lián)到CM5 蕊片上。標(biāo)準(zhǔn)曲線由純化的Fab57P 得到。結(jié)果與討論包涵體蛋白質(zhì)的分離圖2. A:E.co

16、li細(xì)胞內(nèi)含有表達(dá)的scFv57P融合蛋白質(zhì)；B:Frenchpress破碎后的勻漿，均用相差顯微鏡觀察得到。圖3. 一步凝膠過濾分離純化scFv57P包涵體蛋白質(zhì)色譜圖，*代表包涵體蛋白質(zhì)的峰。 一種新的分離方法取代了原來的離心與洗滌過程。通過溶菌酶，DNase，EDTA，非離子形表活劑Trition X-100或Berol185 在French press (APV-Gaulin) 下循環(huán)3 到4 次后，可以使細(xì)胞的碎片及核酸等其它雜質(zhì)的尺寸比包涵體蛋白質(zhì)都 要小(Fig.2)。通過選擇合適的大孔凝膠過濾介質(zhì)，如4%的agarose Sepharose 4 FF or Sepharose

17、HP 的基質(zhì)。它可以使細(xì)胞碎片，多糖，核糖體等雜質(zhì)從介質(zhì)中透過，而完全排阻包涵體顆粒。從而，經(jīng)過層析柱后，可以達(dá)到分離純化包涵體的目的。 在平衡液中加入無紫外吸收的非離子形表活劑Berol 185是為了防止在凝膠過濾過程中膜碎片的聚集和雜蛋白與包涵體非特異性的結(jié)合。這樣，分離和對包涵體的洗滌可以在一步凝膠過濾中實(shí)現(xiàn)。Fig.3是分離過程的層析譜圖。表1 是凝膠過濾分離與離心分離的比較。表1. 凝膠過濾與離心分離的比較GelfiltrationDifferential centrifugationInitial quantity of cells (g wet weight)3.245.00Fi

18、nal quantity of scFv inclusion bodyMass (mg)168.15243.75Sample volume (ml)29.512.5Concentration (mg/ml)5.719.5Protein recovery (mg/g cell wet weight)51.948.8Relative recovery106.4%100%a The recovery obtained by differential centrifugation set as 100%.表1. 凝膠過濾與離心分離的比較GelfiltrationDifferential centrif

19、ugationInitial quantity of cells (g wet weight)3.245.00Final quantity of scFv inclusion bodyMass (mg)168.15243.75Sample volume (ml)29.512.5Concentration (mg/ml)5.719.5Protein recovery (mg/g cell wet weight)51.948.8Relative recovery106.4%100%在Vo處出的峰就是包涵體蛋白質(zhì)的峰，收集后加入U(xiǎn)rea和DTE將包涵體蛋白質(zhì)徹底還原溶解。溶解后的樣品就可以不用離心直

20、接應(yīng)用于后繼的復(fù)性過程了，但對于標(biāo)準(zhǔn)的分離的過程最后一步的離心通常是需要的。圖5. Lanel:圖3* 峰，Lane2:通過離心及洗滌得到的scFv57P，Lane3:LMW marker，Lane4:*峰后面的峰，Lane5:Ecoli的總蛋白。不同復(fù)性方法的比較不同復(fù)性方法的結(jié)果的比較見表2。表2. 不同方法復(fù)性率的比較Refolding methodRecovery (%)Dilution (稀釋復(fù)性)14.6Dialysis (透析)0.4IMAC (金屬鰲合)14.7Gel filtration (no gradients)14.5(無梯度凝膠過濾)Gel filtration (o

21、nly urea gradient)17.3(脲梯度凝膠過濾)Gel filtration(both pH and urea gradient)25(pH 與脲梯度凝膠過濾)稀釋復(fù)性稀釋復(fù)性在蛋白質(zhì)復(fù)性中很常用6,7,8,9。在本實(shí)驗(yàn)中，稀釋復(fù)性用以下條件得到的復(fù)性率最高: 蛋白樣品稀釋200倍后至終濃度為25 mg/ml，在10下過夜。同時(shí)，復(fù)性緩沖液中含有0.5 M arginine，經(jīng)過優(yōu)化后的復(fù)性溫度是10。透析復(fù)性透析復(fù)性的復(fù)性率在所有方法中最低。因?yàn)樵诖诉^程中，蛋白質(zhì)的濃度變化不大，始終保持著較高的濃度，因此在復(fù)性的過程中可以很明顯的觀察到蛋白質(zhì)的聚集，但在其它方法中，聚集并不是很

22、明顯。用(IMAC) 進(jìn)行復(fù)性表3. 流速對IMAC復(fù)性的影響Flow rate (ml/min)Recovery (%)0.114.70.513.31.59.42.05.6IMAC 可以用來復(fù)性有his-tag 的蛋白質(zhì)10,11。在IMAC中，可以先將蛋白質(zhì)通過histine 的作用吸附在介質(zhì)上。然后，可以通過梯度的設(shè)定來逐步脫除urea 等變性劑。因此IMAC 復(fù)性可以得到比稀釋復(fù)性更高的復(fù)性率。如表3 所示，低流速下可以得到較高的復(fù)性率。這也說明對于scFvfragment 逐步脫除脲比快速稀釋的效果要好。脲濃度和pH 聯(lián)合梯度凝膠過濾復(fù)性圖4. 尿素與pH 聯(lián)合梯度凝膠過濾復(fù)性scF

23、v57P層析圖，點(diǎn)線為A280nm，實(shí)線為脲梯度，點(diǎn)線為pH梯度。大孔凝膠過濾介質(zhì)也曾經(jīng)被用于蛋白質(zhì)的復(fù)性12, 13, 14。但象本文這樣，用較小孔的凝膠過濾介質(zhì)，通過逐步脫除變性劑的方法還見未報(bào)道。我們選用預(yù)裝的Susssperdex 30進(jìn)行梯度凝膠過濾復(fù)性。將柱子先用脲及pH梯度預(yù)平衡后再進(jìn)行復(fù)性的效果最好(Fig.4,表2)。將溶于8 M urea中的scFv融合蛋白加入柱子頂端時(shí)，柱子的頂端也是8 M 的urea。而隨著層析過程的進(jìn)行，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小分子變性劑，被凝膠介質(zhì)排阻在外，因此蛋白質(zhì)的向下的移動(dòng)速度要遠(yuǎn)大于各種小分子。這樣scFv 融合蛋白就可以通過預(yù)先形成的

24、urea 及pH梯度，并最后轉(zhuǎn)移到復(fù)性緩沖液中(在柱子出口端占0.4 柱體積)。表4. 流速對IMAC復(fù)性的影響Flow rate (ml/min)Recovery (%)0.114.70.513.31.59.42.05.6 通過逐步增加pH及降低urea的濃度，變性蛋白質(zhì)可以在合適的氧化還原系統(tǒng)中逐步地復(fù)性成準(zhǔn)確的天然結(jié)構(gòu)。較低的起始pH可以使蛋白質(zhì)在形成二硫鍵之前先折疊成一定的類似天然的空間結(jié)構(gòu)，這樣可以抑制錯(cuò)配的二硫鍵。流速也是優(yōu)化復(fù)性過程的一個(gè)關(guān)鍵因素。如圖4 所示，流速越大，復(fù)性率越低。當(dāng)流速為1 ml/min 或更高時(shí)，蛋白質(zhì)可以在2 小時(shí)內(nèi)流到復(fù)性緩沖液中。時(shí)間較短，可以看作類似

25、于稀釋復(fù)性，而在此流速下的復(fù)性率也與稀釋復(fù)性類似(表2，4)。在一定范圍內(nèi)，樣品的體積對復(fù)性率的影響很小。增加GSSG與GSH并沒有使復(fù)性率有明顯提高，而且在此方法中精氨酸(arginine) 的濃度變化對復(fù)性率沒有影響， 因?yàn)閡rea本身也可以做為蛋白質(zhì)復(fù)性過程中的聚集抑制劑。 表2 中各種方法的比較說明脲及pH聯(lián)合梯度對scFv57P 融合蛋白的復(fù)性有促進(jìn)作用。只用脲梯度的復(fù)性率與IMAC的復(fù)性率相似。新方法促進(jìn)融合蛋白復(fù)性的原因可能是因?yàn)閷⒌鞍讖?fù)性的過程分為兩步：先在較低pH下通過逐步脫除脲抑制復(fù)性過程的聚集使蛋白質(zhì)盡可能地折疊成類似天然的結(jié)構(gòu)，然后通過逐步增加pH形成S-S 鍵。這樣在

26、類似天然的結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步的抑制錯(cuò)配S-S鍵(分子內(nèi)或分子間) 的形成，從而達(dá)到進(jìn)一步促進(jìn)正確折疊的目的。參考文獻(xiàn)1 Rudolph,R.,and Lilie, H.(1996)In vitro folding of inclu-sion body proteins. FASEB J. 10, 49-56.2 Al Moudallal, Z., Briand, J. P., and Van Regenmortel, M. H.V. (1985) A major part of the polypeptide chain of tobacco mosaic virus protein is

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