雪旺細(xì)胞構(gòu)建人工神經(jīng)缺損中的修復(fù)作用

1、雪旺細(xì)胞構(gòu)建人工神經(jīng)缺損中的修復(fù)作用 【摘要】研究雪旺細(xì)胞與PLGA構(gòu)成的組織工程化人工神經(jīng)修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損的效果。方法將雪旺細(xì)胞接種在內(nèi)置polyglactin910纖維的PLGA中空管，構(gòu)建成組織工程人工神經(jīng)。將60只SD大鼠隨機(jī)分3組，每組20只，建立大鼠坐骨神經(jīng)缺損20mm的動(dòng)物模型。A組用切下的自體神經(jīng)段原位縫合，B組使用雪旺細(xì)胞組織工程人工神經(jīng)進(jìn)行修復(fù)，C組用未接種雪旺細(xì)胞的PLGA中空管進(jìn)行修復(fù)。術(shù)后8、12周使用神經(jīng)電生理和組織學(xué)觀察分別進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。結(jié)果在大體觀察、組織學(xué)觀察中，B組的恢復(fù)表現(xiàn)與A組相近。在神經(jīng)電生理檢測(cè)、小腿三頭肌肌肉重量測(cè)定、橋接物橫切面神經(jīng)纖維數(shù)量測(cè)

2、定的結(jié)果分析中B組略低于A組但明顯高于C組。B組大鼠橋接段遠(yuǎn)端辣根過氧化酶示蹤后在脊髓前角可以看到被標(biāo)記的神經(jīng)元。透射電鏡可見B組橋接物中段大量的再生神經(jīng)纖維。結(jié)論用雪旺細(xì)胞和PLGA構(gòu)建組織工程人工神經(jīng)修復(fù)大鼠外周神經(jīng)缺損，可以修復(fù)20mm的長段周圍神經(jīng)缺損，并可獲得接近于大鼠自體神經(jīng)修復(fù)的效果。 人工神經(jīng)是由支架材料和種子細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及誘導(dǎo)和促進(jìn)生長的因子等幾部分組成的有機(jī)統(tǒng)一體，在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中有重要的研究意義。雪旺細(xì)胞(Schwanncell)是其中最重要的種子細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)和純化后的雪旺細(xì)胞在支架內(nèi)類似于Bungner帶樣有序分布，并且分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，支持引導(dǎo)軸突的再生

3、，是提高修復(fù)神經(jīng)缺損效果的關(guān)鍵1,2。目前國內(nèi)外多用新生鼠、兔等動(dòng)物的周圍神經(jīng)原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞構(gòu)建人工神經(jīng)。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)置polyglactin910的聚羥基乙酸-聚乳酸(PLGA)導(dǎo)管制備三維多孔支架，通過接種人胚雪旺細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，構(gòu)建人工神經(jīng)，并橋接于大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，與自體神經(jīng)移植作對(duì)照，研究并評(píng)估其對(duì)大鼠外周神經(jīng)修復(fù)的效果。 1材料與方法 1.1主要試劑、材料和儀器 polyglactin910(聚羥基乙酸和聚乳酸共聚物纖維，美國強(qiáng)生公司);PLGA導(dǎo)管(聚乳酸聚羥基乙酸共聚體，中國科學(xué)院);抗S-100單克隆抗體(Sigma公司);20%胎牛血清DMEM(Gibaco公司)

4、;鼠尾膠(自制);0.1g/mL鹽酸氯胺酮注射液;2040mg/mL辣根過氧化酶液;DAB-H2O2作用液;3,3-二甲基聯(lián)苯胺(DAB)5mg，0.05mol/LTris-HCL緩沖液(pH值7.6)10mL，H2O2(30%)1l。 引產(chǎn)34個(gè)月嬰兒死胎6個(gè);3個(gè)月齡SD大鼠32只，體重200250g;SXP-1B手術(shù)顯微鏡;Leica冰凍切片機(jī);LeicaDMIRB圖像分析儀。 1.2組織工程人工神經(jīng)的制備 1.2.1取胎兒外周神經(jīng)，仔細(xì)剝離神經(jīng)外膜，剪成0.51mm3小塊，置于3.5cm培養(yǎng)皿中，使用反復(fù)植塊法和差速貼壁法獲得純度較高的雪旺細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量約在5104。 1.2.2將

5、鼠尾膠包埋polyglactin910纖維(直徑12m，長度2cm)，置入培養(yǎng)皿中，每1012根纖維中心相互重疊呈放射狀排列。使用直接植塊法將人胚雪旺細(xì)胞接種于polyglactin910纖維上。20%胎牛血清DMEM，37、5%CO2培養(yǎng)，備用。 1.2.3將20mm長度的PLGA導(dǎo)管預(yù)涂鼠尾膠后加入雪旺細(xì)胞懸液。37、5%CO2培養(yǎng)2周后，移入polyglactin910纖維，構(gòu)建成人工神經(jīng)導(dǎo)管，繼續(xù)培養(yǎng)2d，準(zhǔn)備植入。 1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將60只SD大鼠隨機(jī)分3組，每組20只。A組用自體神經(jīng)段原位縫合;B組用組織工程人工神經(jīng)修復(fù);C組用無雪旺細(xì)胞的PLGA中空管。腹腔注射氯胺酮200mg/

6、kg麻醉大鼠，常規(guī)消毒鋪洞巾后作股后側(cè)切口，暴露坐骨神經(jīng)，顯微尺測(cè)量下切除坐骨神經(jīng)18mm，自然回縮后造成20mm的神經(jīng)缺損。遠(yuǎn)側(cè)斷端距腓腸肌邊緣約5mm，用10的帶針縫線在10倍手術(shù)顯微鏡下，將橋接物與兩側(cè)神經(jīng)斷端的外膜縫合。關(guān)閉傷口，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)12周。術(shù)后第8周各組隨機(jī)取10只大鼠進(jìn)行觀察，第12周對(duì)各組剩下10只大鼠進(jìn)行觀察。 1.4統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P0.05時(shí)認(rèn)為差異有顯著性。 2結(jié)果 2.1一般觀察 術(shù)后觀察傷口愈合情況、大鼠的精神狀態(tài)、步態(tài)以及足部潰瘍情況等。術(shù)后1周傷口基本愈合，各組大鼠均出現(xiàn)明顯跛行。2周時(shí)各組大鼠均出現(xiàn)患肢足

7、跟潰瘍。12周時(shí)，A、B組大鼠患肢足跟潰瘍基本愈合，但患肢仍跛行;C組患肢足跟潰瘍未愈合，患肢肌肉明顯萎縮。 2.2植入物觀察 第8、12周時(shí)，切開傷口進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)各組大鼠取材神經(jīng)干呈乳白色連接遠(yuǎn)端神經(jīng)，沒有發(fā)現(xiàn)吻合口的斷裂。A、B組再生神經(jīng)直徑較粗，神經(jīng)近端未見神經(jīng)瘤形成，表面可見清晰的血管，同周圍組織均有黏連，但可以分離。B組PLGA管已基本降解。C組近端增粗，遠(yuǎn)段略塌陷，與周圍肌肉組織輕度黏連，PLGA導(dǎo)管幾乎完全降解吸收，神經(jīng)沒有長入遠(yuǎn)端。 2.3神經(jīng)電生理檢測(cè) 采用EsaoteBiomedicaPhasis肌電測(cè)定系統(tǒng)，輸出電刺激為單脈沖方波，電壓25V，時(shí)間0.010.02ms。

8、用2個(gè)雙極保護(hù)電極作為刺激電極分別作用于橋接段的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端，以圓心針單極電極插入腓腸肌肌腹中部，記錄再生神經(jīng)混合傳導(dǎo)速度(m/s)、復(fù)合動(dòng)作電位峰值(mV)。術(shù)后第8、12周，A、B組都有神經(jīng)傳導(dǎo)通過，在吻合口的遠(yuǎn)端都可以記錄到肌電圖，肌電圖測(cè)量2組傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位的振幅都較對(duì)側(cè)正常神經(jīng)有所下降。C組不能引出神經(jīng)再生的動(dòng)作電位，只有大量的失神經(jīng)電位。術(shù)后第8、12周各組電生理檢測(cè)的結(jié)果分別列在表1、2，與A組相比，B組神經(jīng)傳導(dǎo)速度較慢，復(fù)合動(dòng)作電位的峰值較低，兩組間的差別有顯著性(P0.05)表1術(shù)后第8周各組動(dòng)物電生理檢測(cè) 2.4辣根過氧化酶示蹤 術(shù)后12周，再次手術(shù)暴露出坐骨神經(jīng)和人

9、工神經(jīng)移植段，在人工神經(jīng)橋接段的遠(yuǎn)端1cm的神經(jīng)干內(nèi)注射30%的游離辣根過氧化酶液1l，繼續(xù)飼養(yǎng)48h后，在深度麻醉下經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定，取出L4、5脊髓，做冰凍切片，片厚40m，用TMB(3，3，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺)呈色，中性紅復(fù)染，光鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)和脊髓前角神經(jīng)元，在同側(cè)脊髓前角可以看到HRP標(biāo)記的呈棕色的神經(jīng)元(圖1)。 2.5小腿三頭肌肌肉測(cè)量 術(shù)后第8、12周取大鼠術(shù)側(cè)小腿三頭肌，吸取血跡，在分析天平上稱肌肉重量。各組大鼠小腿三頭肌肌肉較健側(cè)明顯萎縮，平均肌肉重量A組高于B組，B組高于C組，且差異有顯著性(P0.05)(表3)。表3術(shù)后各組大鼠小腿三頭肌重量的比 2.

10、6組織學(xué)觀察 術(shù)后第8、12周，在顯微鏡下取出橋接物。分別選擇近側(cè)吻合口段、橋接體中段、遠(yuǎn)側(cè)吻合口段取材，橫向連續(xù)切片，作HE染色和甲苯胺蘭染色，光鏡下觀察神經(jīng)再生和髓鞘形成情況。普通光鏡下，近端吻合口各組均有再生神經(jīng)纖維通過，A組再生神經(jīng)纖維排列致密，髓鞘清晰可見;B組再生神經(jīng)排列較為整齊，呈束狀，可見豐富的新生血管穿插于其間;C組再生神經(jīng)纖維較為雜亂，有較多的纖維組織增生。在橋接體中段，A組再生神經(jīng)排列整齊;B組再生神經(jīng)束較稀疏，但未見瘢痕形成或淋巴細(xì)胞侵潤;C組再生神經(jīng)纖維雜亂無章在遠(yuǎn)端吻合口，A、B2組仍有較多的再生神經(jīng)纖維通過(圖2);C組則沒有。B、C2組近、中、遠(yuǎn)三段均未見有po

11、lyglactin910纖維殘留。 2.7圖像分析 將術(shù)后12周各組甲苯胺蘭染色切片(圖3)置于圖像分析儀的顯微鏡下，采用LeicaQWin2.8圖像分析系統(tǒng)，對(duì)橋接體中段進(jìn)行測(cè)量分析，統(tǒng)計(jì)中段的再生神經(jīng)纖維數(shù)目、再生神經(jīng)束面積及神經(jīng)纖維密度列于(表4)。 圖像分析顯示B組再生神經(jīng)中段在再生神經(jīng)纖維數(shù)目與神經(jīng)纖維密度兩方面計(jì)數(shù)均少于A組，差別有顯著性(P0.05)。C組在再生神經(jīng)纖維數(shù)目與再生神經(jīng)束面積兩方面均明顯低于A、B2組，差別有顯著性(P0.05)。這與光鏡下HE染色切片觀察到神經(jīng)再生情況相吻合。表4術(shù)后12周各組橋接物中段橫切面圖像分析 2.8透射電鏡觀察 術(shù)后12周，取移植中段再生

12、神經(jīng)，D?Hanks液洗滌，2%戊二醛固定2h，4下D?Hanks液洗滌2次，1%鋨酸固定2h，乙醇逐級(jí)脫水，618環(huán)氧樹脂包埋，LKB-V超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，用PhilipsCM120透射電鏡拍片，觀察神經(jīng)再生和髓鞘形成情況。術(shù)后第12周，B組橋接物中段可見大量的再生神經(jīng)纖維，髓鞘形成良好(圖4)。 3討論 Aguayo等1979年首先將體外培養(yǎng)的乳鼠雪旺細(xì)胞種植到5mm長的血管段中，用于橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損，6周后發(fā)現(xiàn)有大量再生神經(jīng)纖維，為組織工程人工神經(jīng)的研究奠定了基礎(chǔ)。 xx年Evans等3用左旋聚乳酸導(dǎo)管種植同種異體的雪旺細(xì)胞修復(fù)大鼠12mm神經(jīng)缺損，2、4個(gè)月

13、時(shí)檢測(cè)神經(jīng)修復(fù)的各項(xiàng)指標(biāo)和同源雪旺細(xì)胞移植療效相當(dāng)，但是比自體神經(jīng)移植效果略差。同年Mosahebi等4用聚羥基丁酸戊酯導(dǎo)管種植同種異體雪旺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在6周時(shí)同種異體雪旺細(xì)胞受到排斥，但神經(jīng)軸突的長入情況與同源細(xì)胞移植相似，并且沒有導(dǎo)致有害的免疫反應(yīng)。國內(nèi)，xx年程飚5將成年兔雪旺細(xì)胞種植在醫(yī)用生物膜和polyglactin910纖維上，橋接2.5cm長坐骨神經(jīng)缺損，表現(xiàn)出與自體神經(jīng)移植相當(dāng)?shù)寞熜Аx年顧曉松等6用殼聚糖套管和聚乙醇酸纖維制成人工組織神經(jīng)移植物，輔加促神經(jīng)生長的中藥有效組分，成功修復(fù)大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損。 雖然大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示用神經(jīng)導(dǎo)管能有效修復(fù)短距離神經(jīng)缺損7，但目前還

14、沒有一種能夠在臨床上代替自體神經(jīng)移植。受神經(jīng)趨化和接觸引導(dǎo)的限制，人工神經(jīng)橋接的距離一般不超過30mm，而臨床上面臨的主要問題是長段缺損時(shí)自體神經(jīng)的不足8。 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，增強(qiáng)人工神經(jīng)所負(fù)載的雪旺細(xì)胞的功能，有希望增加橋接的距離。1998年Menei等9發(fā)現(xiàn)經(jīng)基因改良能分泌人BDNF的雪旺細(xì)胞可促進(jìn)大鼠神經(jīng)的軸突再生。馮世慶等10用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含NGF和BDNF表達(dá)基因的質(zhì)粒導(dǎo)入雪旺細(xì)胞，4周后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)明顯增加。電鏡下可見到轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞內(nèi)含豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。陳禮剛等11證實(shí)轉(zhuǎn)有pSVPoMcat微基因的雪旺細(xì)胞能穩(wěn)定分泌21.5KuMBP。Joung12等用腺病毒轉(zhuǎn)染

15、lacz基因到雪旺細(xì)胞上，基因持續(xù)表達(dá)5周以上。但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，要充分考慮到可能產(chǎn)生的不良后果。 國內(nèi)張琪13等曾將成人副神經(jīng)埋于裸鼠皮下模擬瓦氏變性處理，體外培養(yǎng)成功獲得人雪旺細(xì)胞。另一方面利用大鼠自體雪旺細(xì)胞構(gòu)建人工神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)14也得到成功。本實(shí)驗(yàn)采用引產(chǎn)死胎外周神經(jīng)作為雪旺細(xì)胞。34個(gè)月胎齡時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尚不充分，髓鞘尚未成熟，接種后雪旺細(xì)胞量大且容易生長。且胚胎神經(jīng)材料與成人神經(jīng)相比，所含結(jié)締組織成分較少，神經(jīng)外膜更易剝離。 本實(shí)驗(yàn)中將polyglactin910纖維植入PLGA可降解導(dǎo)管中，構(gòu)建雪旺細(xì)胞的三維生長空間，有利于細(xì)胞和周圍物質(zhì)之間的交換，促進(jìn)其分裂增殖。在評(píng)估神經(jīng)

16、再生情況時(shí)，除使用電生理方法外，同時(shí)通過活體肢體功能觀察、靶器官肌肉測(cè)量以及辣根過氧化物酶示蹤來綜合判斷損傷神經(jīng)修復(fù)后靶器官的功能恢復(fù)情況。這樣評(píng)估能較全面的對(duì)電生理的結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充支持，避免僅用電生理評(píng)估造成的偏差。 受損神經(jīng)修復(fù)再生時(shí)，許多小軸突常常在通過吻合口后就中止于微神經(jīng)瘤，這就會(huì)使再生神經(jīng)橫斷面圖像分析的結(jié)果與實(shí)際功能的恢復(fù)程度不一致。本實(shí)驗(yàn)分別選擇近側(cè)吻合口段、橋接體中段、遠(yuǎn)側(cè)吻合口段取材，切片染色后，光鏡下觀察神經(jīng)再生和髓鞘形成情況。并對(duì)再生神經(jīng)的纖維數(shù)目、再生神經(jīng)束面積以及有髓神經(jīng)纖維密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，能較全面的評(píng)價(jià)神經(jīng)再生的效果。 從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：在修復(fù)大鼠外周神經(jīng)缺損中，人胚雪旺細(xì)胞人工神經(jīng)的修復(fù)效果與大鼠自體神經(jīng)移植相近，且明顯高于空白管對(duì)照組。從近端切口往離心方向，距離越遠(yuǎn)神經(jīng)修復(fù)程度越低，可能是近端切口軸漿運(yùn)輸分泌神經(jīng)生長因子的關(guān)系。使用人胚雪旺細(xì)胞修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損可以獲得接近于大鼠自體神經(jīng)移植的效果，表明人雪旺細(xì)胞可以引導(dǎo)大鼠神經(jīng)細(xì)胞，并且分泌的生長因子對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞具有一定作用?？梢栽O(shè)想，在修復(fù)人體周圍神經(jīng)缺損時(shí)，人胚雪旺細(xì)胞人工神經(jīng)可能發(fā)揮更好的修復(fù)效果。 回顧整個(gè)實(shí)驗(yàn)，通過活體肢體功能觀察、靶器官肌肉測(cè)量、電生理