流式細(xì)胞術(shù)及其應(yīng)用.ppt

1、流式細(xì)胞術(shù)及其應(yīng)用,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 沈文飚 2007.4,生化分析技術(shù)專題,第 一 部 分 流式細(xì)胞術(shù)的一般介紹,概念,流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM） 利用流式細(xì)胞儀對處在快速、直線、流動(dòng)狀態(tài)中的單 細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對特 定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。 流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer) 集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算 機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的 一種新型高科技儀器。,流式細(xì)胞儀特點(diǎn),單細(xì)胞懸液或生物顆粒,分析速度高,多參數(shù),精度高,當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù),流式細(xì)胞發(fā)展史,1930年，Cas

2、persson 和Thorell開始致力于細(xì)胞的計(jì)數(shù)。 1934年，Moldaven 是世界上最早設(shè)想使細(xì)胞檢測自動(dòng)化的人，他試圖用光電儀 記錄流過一根毛細(xì)管的細(xì)胞。 1953年，Croslannd-Taylor 應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)數(shù)器。 同年，Parker 和Horst 描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流式細(xì)胞儀的雛形。 1965年，Kamemtsky等提出兩個(gè)設(shè)想，一是用分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分；二是結(jié)合測量值對細(xì)胞分類。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基礎(chǔ)上提出細(xì)胞分選的方法。,流式細(xì)胞發(fā)展史,1969年，Van Dil

3、la，F(xiàn)ulwyler及其同事們在Los Alamos，NM（即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs）發(fā)明第一臺熒光檢測細(xì)胞計(jì)。 1972年，Herzenberg 研制出一個(gè)細(xì)胞分選器的改進(jìn)型，能夠檢測出經(jīng)過熒光標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞的較弱的熒光信號。 1973年，BD公司與美國斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺商用流式細(xì)胞儀FACS I。 從此，大量的廠家不斷研制生產(chǎn)出自己的流式細(xì)胞儀，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)入了一個(gè)空前飛速發(fā)展的時(shí)代。進(jìn)入九十年代，流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)已經(jīng)日臻完善，而隨之而來的就是應(yīng)用領(lǐng)域的日趨廣泛。而今，流式細(xì)胞儀已經(jīng)深入到

4、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等的各個(gè)分支領(lǐng)域，并將在未來為我們的科學(xué)研究發(fā)揮更大的作用。,流式細(xì)胞儀及其工作原理,FACSCalibur,特點(diǎn)： 光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定 自動(dòng)化程度高 操作簡便 使用壽命長 配備1-2根激光 主要用于細(xì)胞分析,臨床型（臺式機(jī)）,BD LSR,特點(diǎn)： 配置三種激光器488/UV/633 最多可檢測六種熒光和兩個(gè)側(cè)向參數(shù) 可與下面FACS Vantage 連用.高效分選細(xì)胞,FACS Vantage DiVa,科研型（大型機(jī)） BD Biosciences,特點(diǎn)： 多數(shù)字化 適用用各類細(xì)胞分選 4路分選 分選10,000cells/second or more,FACSAria,

5、科研型,特點(diǎn)： 分辨率高 選配多種波長和類型激光器 可把感興趣細(xì)胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板） 適用于高速分選和多色分析,本校FACSCalibur,流式細(xì)胞儀檢測范圍,細(xì)胞大小 細(xì)胞粒度 細(xì)胞表面面積 核漿比例 DNA含量與細(xì)胞周期 RNA含量 蛋白質(zhì)含量,細(xì)胞結(jié)構(gòu),特異性抗原 （細(xì)胞表面/胞漿/核） 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 細(xì)胞活性 酶活性 激素結(jié)合位點(diǎn) 細(xì)胞受體,細(xì)胞功能,臨床研究,淋巴細(xì)胞亞群測定、血小板分析、網(wǎng)織紅細(xì)胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH診斷、人類同種異體器官移植中應(yīng)用、細(xì)胞因子測定、AIDS診斷與治療和療效評價(jià)、flow-FISH法測定端粒長

6、度,基礎(chǔ)研究,淋巴細(xì)胞功能、樹突狀細(xì)胞(DC)研究、造血干細(xì)胞研究、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡分析、凋亡相關(guān)蛋白分析、細(xì)胞功能研究、多藥耐藥基因研究(MDR)、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)研究、RNA測定、DNA測定、總蛋白測定、癌基因和抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物測定、血管內(nèi)皮細(xì)胞研究,流式細(xì)胞儀的工作原理,光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng) 液流系統(tǒng) 流動(dòng)室 液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 細(xì)胞分選系統(tǒng),激光光源,單波長、高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性 多采用氬離子激光器或氦氖激光器 一般選配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 最多檢測13個(gè)熒光參數(shù),氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光5

7、14nm和藍(lán)光488nm的譜線最強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以633nm較強(qiáng)。 免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。,光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）,熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光一般由光電倍增管（PMT）檢測。 PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級；光譜響應(yīng)特性好，在

8、200900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。 光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此對弱光測量十分有利。,FACSCalibur 光路圖,液流系統(tǒng)：流動(dòng)室、液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng),流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作，是液流系統(tǒng)的心臟。 樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出； 鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。,液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱,為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細(xì)胞被限制在液流的軸線上。,細(xì)胞分選系統(tǒng),細(xì)胞分選系統(tǒng),樣品分選原理 流式細(xì)胞儀的分選功能是由

9、細(xì)胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進(jìn)行分選的。 穩(wěn)定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。 一般液滴間距約距約數(shù)百m。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f = v / 4.5 d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。 使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選 150V，或-1

10、50V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，,不同分選系統(tǒng),信號檢測,液流中央的單個(gè)細(xì)胞通過測量區(qū)時(shí)，受到激光照射后,我們可以接收到兩種光信號. 第一種 散射光 受到激光照射會向立體角為2的整個(gè)空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān). 第二種 熒光 熒光染料在激光的激發(fā)下,發(fā)熒光可顯示出研究對象的相關(guān)信息.熒光信號主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長也與照射

11、激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。,在流式細(xì)胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量 FSC forward scatter light (“fsc”) or forward angle light scatter (“fals”). 小角散射又稱前向角散射光光它反應(yīng)細(xì)胞的相對大小和截面積的大小,一般說來，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大；對球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系 ； SSC side scatter light (“ssc”) or 90 light sca

12、tter. 側(cè)向角散射又稱90度角散射光代表細(xì)胞的顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化.,全血細(xì)胞流式FSC-SSC圖,紅細(xì)胞,白細(xì)胞,血小板及死細(xì)胞,單核細(xì)胞,信號檢測-熒光信號,熒光及發(fā)光原理,熒光的產(chǎn)生 一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。 熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。 可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒

13、光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。 壽命為10-8 10 -11s。由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)kf 為106109s-1。,熒光物質(zhì) 熒光色素 許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有： 異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490 495nm，最大發(fā)射光波長520 530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體

14、型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈橘紅色熒光。,其他熒光物質(zhì) 酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶

15、的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。 鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。,數(shù)據(jù)顯示類型,單參數(shù)直方圖（Histogram）,X軸：代表熒光信號或散射光信號的強(qiáng)度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強(qiáng)度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系 Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細(xì)胞的頻率,二維等高圖和密度圖,便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 不同的細(xì)胞群可以用不同的顏色標(biāo)記 主要表達(dá)方式,光譜交叉,兩色以

16、上熒光分析存在 光譜交叉,熒光補(bǔ)償方法,所有補(bǔ)償調(diào)為“0” 調(diào)節(jié)電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角” 依單陽群體調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償,抗體使用原則,根據(jù)儀器型號和抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇熒光抗體 低表達(dá)抗原標(biāo)記高S/N（信噪比）熒光素，如PE、APC 使用雙標(biāo)以上抗體必做熒光補(bǔ)償,樣品 培養(yǎng)細(xì)胞 新鮮組織 石蠟包埋,單細(xì)胞 懸液,標(biāo)記 熒光抗體,檢測,表型測定,細(xì)胞分選,流式細(xì)胞術(shù)操作流程,統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析,繼續(xù) 培養(yǎng),第 二 部 分 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用,細(xì) 胞 周 期 分 析,樣品制備,1000rpm 5分鐘 收集2X106個(gè)細(xì)胞,PBS漂洗 兩次,70%酒精 4度固定過夜,收集固定的細(xì)胞,PB

17、S漂洗,0.5 PBS 懸浮細(xì)胞,2.5l 10g/l RNase A,37度消化1小時(shí),過300目細(xì)胞篩,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，,1000rpm 5分鐘 離心,兩次,混勻，室溫 靜止5分鐘,上機(jī),建立獲取模式，獲取數(shù)據(jù) （PI單染分析細(xì)胞周期，同時(shí)看凋亡）,去甲斑蟊素對肝癌細(xì)胞周期的作用,數(shù)據(jù)分析,圈門去除細(xì)胞碎片，分析細(xì)胞凋亡,圈門去除粘連體，分析細(xì)胞周期,細(xì)胞凋亡分析,H2O2誘導(dǎo)成神經(jīng)瘤細(xì)胞的凋亡照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色是凋亡細(xì)胞。 A.K. Stout and J.T. Greenamyre, Emory University,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡 首先

18、出現(xiàn)的是染色質(zhì)的濃縮, 導(dǎo)致致密的、分離的、邊界清晰的半月形的染色質(zhì)顆粒集中于核膜邊緣; 隨后染色質(zhì)濃縮過程伴隨有核膜及細(xì)胞膜的內(nèi)陷, 接著核碎裂成分離的片段, 胞漿濃縮, 細(xì)胞支架斷裂,這些片段被細(xì)胞膜包裹; 跟著出現(xiàn)的是凋亡細(xì)胞斷裂成若干個(gè)有完整包膜包裹的凋亡小體(apoptosis body) , 小體的大小及其內(nèi)容差異甚大, 大部分含有若干核片段, 少數(shù)可能沒有核片段。,細(xì)胞核染色體局部凝聚,細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻染色體局部凝聚,引自 ,缺乏IL3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,Michael G. Ormerod Journal of Immunological Methods 265 (2002)

19、 73 80,Annexin V-PE/7-AAD 雙染色法,雙陰：活細(xì)胞 Annexin V-PE單陽：早期凋亡細(xì)胞 雙陽：晚期凋亡細(xì)胞 7-AADd單陽：壞死細(xì)胞,檢測淋巴細(xì)胞引起的細(xì)胞毒作用,細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞CTL和自然殺傷細(xì)胞NKC）能釋放包含穿孔素蛋白和顆粒酶的顆粒或通過Fas-Fas連接作用于靶細(xì)胞，引起靶細(xì)胞內(nèi)Caspase酶激增，導(dǎo)致細(xì)胞死亡包括凋亡。具有重大研究和應(yīng)用價(jià)值。 通常測定淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，用同位素51Cr，操作復(fù)雜危險(xiǎn)而且不利于單細(xì)胞分析。 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞毒作用(FCC)，利用Caspase專一性熒光底物測定受害細(xì)胞的細(xì)胞毒作用強(qiáng)

20、度。準(zhǔn)確簡便迅速。,The FCC assay provides rapid and sensitive detection of NK cell cytotoxicity. TFL2-labeled Jurkat cells were incubated with the NK cell line NK92 at an E/T ratio of 51 for the time indicated in the presence of the caspase 6 substrate. Significant cytotoxicity(50%) was detected as early as

21、20 min.,From: Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed. Edited by: T. S. Hawley and R. G. Hawley . Humana Press Inc., Totowa, NJ,The detection of NK92-mediated killing of breast carcinoma target cell lineMDA-MB-468 cells using both flow cytometry (A,B) and confocal microscopy (

22、C,D).Target cells were labeled with TFL2 and incubated without (A,C) or with (B,D) NK92cells for 2 h in the presence of caspase 6 substrate. Nonapoptotic target cells are red; apoptotic target cells have both red and green fluorescence signalsand therefore appear yellow.,參考資料,部分書籍及雜志： Methods in Molecular Bology : Flow Cytometry ProtocolsEdited by M J Jaroszeskl and R Heller 63 Humana Press Inc , Totowa, NJ Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.Edited by: T. S. Haw