DNA測序的方法

1、DNA 測序的原理及方法,DNA 測序的原理 DNA測序的操作過程 DNA測序?qū)嵗?Sanger法DNA測序的原理,使用特異引物在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)、堿基特異性的鏈終止，以及采用聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分長度差一個(gè)核苷酸的單鏈DAN等3種方法。引入雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列測定技術(shù)才得到廣泛應(yīng)用。,2，3ddNTP與普通dNTP不同之它們可以在DNA聚合酶作用下通過其5 三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。 在DNA合成反應(yīng)混合物的

2、4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后， 鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。,在4組獨(dú)立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上.,DNA雙脫氧法測序的原理及方法,點(diǎn)擊查看相關(guān)網(wǎng)頁,雙脫氧法測序的原理,單擊查看DNA測序的動畫演示 DNA Seqamit.exe,常用測序方法,手工測序 讀序長度: 約 300bp 同位素32P, 35S標(biāo)記 結(jié)果通過人工肉眼分析,氬離子激光器測序儀 讀序長

3、度: 500-700bp 可見熒光 Fam, Hex, Rox, Tamra標(biāo)記 軟件自動讀序,紅外激光器測序儀 讀序長度: 1000-1400bp 紅外熒光標(biāo)記 軟件自動讀序,DNA Analysis Systems,IRD 800,Abs. Max.: 787nm,Em. Max: 807nm,Molar,Absorptivity: 200,000 m-1 cm-1,Quantum,Y,ield: 16.5%,熒光標(biāo)記染料種類,IRD 700,Abs. Max.: 685nm,Em. Max: 705nm,Molar,Absorptivity: 170,000 m-1 cm-1,Quant

4、um,Y,ield: 50%,Independent Channels,Dyes are separated by 110 nm Detector filters eliminate signal crossover Lasers excite only one dye at a time,Contrast to 4 colors,No software interpretation of dye spectra With 4 colors it is difficult to distinguish between a strong signal in one color or a weak

5、 signal in a second color No dye mobility shift corrections,四色熒光分析檢測,Detection Limits,檢測效果分析比較,A,T,C,G,800 nm,Detector,Laser,800 nm,700 nm,Detector,700 nm,Laser,Signal Processing,Computer,電泳帶型檢測,700,800,測序電泳圖譜,Channel 700,Channel 800,測序結(jié)果輸出,長片段測序策略,BI-DIRECTIONAL SEQUENCING,5,3,3,5,IRD700,IRD800,Two

6、 Primers/Template,TTCAGAC-PRIMER PRIMER-AAGTCTG,2000 bases,SBS Options,Minimum overlap Largest single strand coverage Inserts 2 kb,Maximum overlap Confirmed sequence in one tube Inserts of 1200 bases,1,2000 Bases,1,1000 Bases,長片段的正反向測序,Side View,測序硬件,Long ReadIR DNA Sequencer,Gene ReadIR DNA Analysis System,BIOTECHNOLOGY DIVISION,Software,Multitasking Base ImagIR Software,3-Data=Accuracy,DNA測序的應(yīng)用,Sequencing Mutation Screening Mutation Ana