PCR技術(shù)以及常見問題解析

1、PCR技術(shù)應(yīng)用和常見問題分析，南京凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司，郭強(qiáng)分子平臺(tái)負(fù)責(zé)人，目錄，基因表達(dá)研究背景傳統(tǒng)PCR技術(shù)(鏈聚合酶反應(yīng))PCR反應(yīng)系統(tǒng)和反應(yīng)程序PCR常見問題分析實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)實(shí)時(shí)定量PCR mRNA小細(xì)胞nuclearRNA、snRNA、kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限、凈作用因素、基因表達(dá)研究策略、保姆基因：house-keeping gene是所有細(xì)胞中表達(dá)的基因種類微管蛋白基因等。高級(jí)基因：Luxury gene是在特殊細(xì)胞類型中大量(通常)表達(dá)并編碼特殊功能產(chǎn)物的基因，具有組織特異性。kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司，3，基因表達(dá)研究戰(zhàn)略，kaiji生物

2、技術(shù)開發(fā)有限公司，基因表達(dá)研究戰(zhàn)略，cDNA:complementary DNA，RNA鏈的補(bǔ)充單鏈DNA，RNA在適當(dāng)?shù)囊锎嬖谙乱蕾嘡NA的DNA聚合，EST/mRNA，Genomic，擴(kuò)展，變性，退火，keki生物技術(shù)開發(fā)有限公司，PCR技術(shù)(聚合酶鏈反應(yīng))，PCR反應(yīng)循環(huán)，keki生物技術(shù)開發(fā)有限公司，PCR反應(yīng)系統(tǒng)/程序曲線，PCR brkeki生命技術(shù)開發(fā)有限公司，(4)dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，4種dNTP濃度必須相同濃度過高，才能容易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的混合，濃度過低，將反應(yīng)產(chǎn)量dNTP與Mg2結(jié)合，會(huì)降低游離Mg2濃度，影響DNA聚合酶的活性。kaiji生物技術(shù)開

3、發(fā)有限公司，(5) Mg2，Mg2是DNA聚合酶激活劑。適當(dāng)濃度為0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。如果Mg2濃度過低，Taq酶活性喪失，PCR產(chǎn)量下降。Mg2過高會(huì)影響反應(yīng)特異性。Mg2可以與負(fù)離子結(jié)合，因此反應(yīng)系統(tǒng)的dNTP、EDTA等濃度影響反應(yīng)中自由的Mg2濃度。凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司，2)由于循環(huán)參數(shù)變性，雙股DNA分解線由單股94，20-30秒(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度會(huì)減少引物和模板的非特異性結(jié)合。降低溫度會(huì)增加反應(yīng)的敏感性。凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司，(3)擴(kuò)大70-75，一般延長(zhǎng)72個(gè)時(shí)間由放大片段長(zhǎng)度決定，(4)循環(huán)次數(shù)主要是模板DNA的濃度一般超過

4、25-35次：放大效率降低錯(cuò)誤混合率增加，凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司，PCR常見問題解答： 具有非特異性條帶、引物和模板的非特異性退火基因特異性引物設(shè)計(jì)不良RNA中具有基因組DNA的污染，在引物二聚體鎂離子濃度過高，提高反應(yīng)溫度和特異性的引物中，特異性擴(kuò)增水平DNase處理RNA設(shè)計(jì)三端互補(bǔ)序列的引物中，優(yōu)化鎂離子濃度M 1 2，kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司，引物設(shè)計(jì)：(1)序列高度保守(2)底漆長(zhǎng)度15-40 BP為宜。(3)堿盡可能隨機(jī)分布，G C占40-60%。(4)引物內(nèi)部避免了二次結(jié)構(gòu)的形成。(5)兩個(gè)引物之間防止互補(bǔ)序列。(6)引物的3端是核心堿基。第5團(tuán)沒有嚴(yán)格的限制。kaiji

5、生物技術(shù)開發(fā)有限公司，分散(SMEAR)條帶生成，第一鏈產(chǎn)品含量過高的PCR反應(yīng)中引物過量循環(huán)數(shù)過多的退火溫度過低，因核苷酸片段引起的非特異性放大，減少第一鏈產(chǎn)品量的現(xiàn)有PCR階段中引物量，PCR的循環(huán)將組織或細(xì)胞的總RNA提取RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，目的基因引物設(shè)計(jì)為PCR，瓊脂糖電泳和數(shù)字照片分析電泳帶灰度值，判斷目標(biāo)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)變化，RT-PCR反應(yīng)示例，RT-PCR引物的選擇：1。 隨機(jī)引物2。Oligo dT 3 .基因特異性引物，RT-PCR例：一，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)?zāi)康腞NA提取方法；學(xué)習(xí)PCR分析的原理和技術(shù)。后代腎小管上皮細(xì)胞CTGF

6、基因表達(dá)分析藥物處理，凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司，第二，實(shí)驗(yàn)材料，工具和試劑1。材料：人腎小管上皮細(xì)胞等樣品組織2。工具：微吸管和吸頭、PCR儀器和PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備、DEPC水等3。試劑：Trizol試劑(kaiji)RT-PCR套件(keki kit)，kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司，1。RNA萃取參考RNA萃取套件指示，3，操作步驟，2。RNA質(zhì)量測(cè)定，280，320，230，260納米以下的吸光度分別表示核酸、背景、鹽濃度、蛋白質(zhì)等有機(jī)物的值。OD260/OD280(Ratio，R) 2.2 RNA分解，凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司，3 .rt reaction，RNA 2-4ug

7、XUL oligo dt 10um 1.5 ul depc water to 10 ul，70水浴10分鐘，冰浴5分鐘，添加以下成分：RNA inhibitor 40u/ul 0.5 ul 10 x AMM，凱基生物技術(shù)開發(fā)有限公司4。PCR Reaction，10 X PCR反應(yīng)緩沖2.5 L 25 mmol/L MGC L 2.0 L 10 mmol/L dntp 1.0 l 10 mol/l引物1.0 L 10mol/L引物2.0 L DNA 1.0 L Taq 0.2 L(5U目前，實(shí)時(shí)定量PCR是一種非常有效的實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公

8、司，real time PCR and conventional PCR，vs，1。實(shí)時(shí)在線監(jiān)控：監(jiān)控樣品放大的全過程，實(shí)時(shí)觀察產(chǎn)品增加，直觀地查看反應(yīng)的對(duì)數(shù)周期，2 .降低反應(yīng)的非特異性：使用引物和熒光探針，結(jié)合模板特異性，提高PCR反應(yīng)的特異性，3 .增加數(shù)量特異性：全面監(jiān)控，用精確算法量化；結(jié)果分析快速方便，無需執(zhí)行，凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司，熒光定量PCR與現(xiàn)有PCR技術(shù)的區(qū)別，現(xiàn)有PCR是通過電泳定性分析放大反應(yīng)的最終產(chǎn)物(定量不準(zhǔn)確)；熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中添加熒光組，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，使每個(gè)周期“可視化”(or cDNA)的起始濃度通過Ct值和標(biāo)

9、準(zhǔn)曲線量化(精確定量)的方法。，kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司Realtime PCR 25(4) :386-401.3。高性能模型of congenital tox oplasmis in guinea-pigs : use of quantitative and qualifitative PCR for the study of materno fet altransmisa quantitative real-time PCR method for detection of B- lymphocyte monoclonal ity by comparison of kappa and

10、lamb da immunoglobulin light chai N expressAnders sthlberg，clinical chemistry 49(1): 51-59，多實(shí)時(shí)熒光定量PCR，雙鏈DNA特異染料(SYBR)是一個(gè)反應(yīng)管中多用途產(chǎn)品熒光染料LUX這些熒光組的熒光發(fā)射波長(zhǎng)不同，可以分辨引物介導(dǎo)的放大產(chǎn)物。發(fā)夾引物，單鏈引物，擴(kuò)展引物dsDNA，keki生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Dyes Used for Real-Time PCR，Dyeexitation maximum(nm)emission maximum第二，材料實(shí)時(shí)定量PCR試劑：1。ABI TaqMan PCR核

11、心套件2。ABI SYBR PCR核心套件，kaiji生物技術(shù)開發(fā)有限公司，第3階段，方法1。SYBR greenkit的實(shí)時(shí)PCR，2 .實(shí)時(shí)定量PCR儀器設(shè)置，凱吉生物技術(shù)開發(fā)有限公司，階段時(shí)間溫度注意事項(xiàng)UNG(可選)防止殘留2分鐘50ung啟動(dòng)PCR產(chǎn)品中所有dUMP污染物PCR的初始激活階段15min 95激活HotStarTaq DNA聚合酶3(4)-階段循環(huán)：變性15s 9435-40個(gè)循環(huán)取決于起始模板DNA量。kj生物技術(shù)開發(fā)有限公司，實(shí)時(shí)PCR問題分析，Q1:沒有Ct信號(hào)1。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)不足，通常需要循環(huán)35個(gè)以上，但是如果太多，可以增加背景值。熒光信號(hào)檢測(cè)階段無效。SG方

12、法采用72擴(kuò)展詩集獲取，這是退火結(jié)束或擴(kuò)展結(jié)束時(shí)發(fā)生的TaqMan法則。引物或探針分解，頁面檢測(cè)完整性。引物或探針的設(shè)計(jì)，如果探針沒有足夠高到引物的溫度，探針就不會(huì)雜交，產(chǎn)品開始擴(kuò)展。4.模板不足5。模板分解，凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司，Q2: CT值出現(xiàn)得太晚1。放大效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，降低退火溫度，提高鎂離子濃度。2.反應(yīng)成分分解或樣品采集不足3。PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)，一般為80-150bp，凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司，Q3:標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不良1。樣品佛像坡度2。標(biāo)準(zhǔn)物分解，防止反復(fù)董潔融化3。底漆或探針設(shè)計(jì)不良4。模板中有抑制劑或模板濃度太高，凱基生命技術(shù)開發(fā)有限公司，Q4:溶解曲線存在多個(gè)主峰1。底漆設(shè)計(jì)未充分優(yōu)化2。底漆