SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1非小細(xì)胞肺癌的現(xiàn)狀肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。2022年我國(guó)新發(fā)肺癌病例數(shù)約106萬(wàn)，死亡人數(shù)高達(dá)74萬(wàn)。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（Smallcellcarcinoma,SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cellcarcinoma，NSCLC），其中非小細(xì)胞肺癌占比約85％，其5年生存率極低。非小細(xì)胞肺癌極易轉(zhuǎn)移到血供豐富的重要組織器官，如腦、肝、脊柱等，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。1.1.2EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。這一過(guò)程使得腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，進(jìn)入周?chē)M織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT還與腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)、干細(xì)胞特性獲得等相關(guān)，使得腫瘤細(xì)胞更具惡性。參與EMT的信號(hào)通路眾多，包括依賴(lài)Smad和非依賴(lài)Smad的TGF-β通路、AKT信號(hào)通路、STAT3信號(hào)通路等，深入研究EMT的機(jī)制，有助于找到阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)和新方法。1.1.3Akt信號(hào)通路的重要性Akt信號(hào)通路，又稱(chēng)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一。Akt作為該通路的核心分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝和遷移等多種生物過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)該通路被激活時(shí)，Akt可通過(guò)磷酸化多種下游底物，如Bad、Caspase9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、p21等，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。在多種腫瘤中，包括非小細(xì)胞肺癌，Akt信號(hào)通路常常異常激活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此Akt信號(hào)通路成為腫瘤治療的重要潛在靶點(diǎn)。1.1.4SLC38A3的研究?jī)r(jià)值SLC38A3屬于人溶質(zhì)載體家族中第38號(hào)家族，是一種位于細(xì)胞膜上的Na?耦聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可依賴(lài)Na?和H?進(jìn)行雙向跨膜運(yùn)輸，主要轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺、組氨酸、丙氨酸、天冬酰胺等。腫瘤細(xì)胞由于具有快速、無(wú)限增長(zhǎng)的特性，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不同于正常細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞會(huì)增加對(duì)谷氨酰胺的攝取和利用，以滿足其生長(zhǎng)和增殖的需要。作為谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，SLC38A3在腫瘤代謝中可能扮演重要角色，其表達(dá)和功能的改變可能影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。研究SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及其作用機(jī)制，對(duì)于深入了解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義，有望為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的策略和方向。1.2研究目的本研究旨在深入探究SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制，具體而言，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)和分析，明確SLC38A3如何通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移。具體包括以下幾個(gè)方面：首先，全面了解溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC38A3在非小細(xì)胞肺腺癌腫瘤組織和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性。其次，利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，深入研究SLC38A3促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制，特別是其與Akt信號(hào)通路以及EMT之間的內(nèi)在聯(lián)系。再者，通過(guò)構(gòu)建相關(guān)細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，驗(yàn)證SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移中的作用，并探索以SLC38A3或Akt信號(hào)通路為靶點(diǎn)的潛在治療策略，為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，隨著腫瘤研究的不斷深入，SLC38A3、Akt信號(hào)通路、EMT以及它們與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這些領(lǐng)域取得了一系列有價(jià)值的研究成果。在SLC38A3方面，國(guó)外研究較早關(guān)注到其作為谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腫瘤代謝中的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中，SLC38A3的表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力相關(guān)。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，SLC38A3高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的攝取，進(jìn)而為細(xì)胞的快速增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)研究也對(duì)SLC38A3在腫瘤中的作用進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)其在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且高表達(dá)的SLC38A3與患者的不良預(yù)后相關(guān)。同時(shí)，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)SLC38A3的表達(dá)可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而下調(diào)其表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞的這些惡性生物學(xué)行為。關(guān)于Akt信號(hào)通路，國(guó)外在其激活機(jī)制和下游靶點(diǎn)方面進(jìn)行了深入研究。已明確多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等可通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合，激活PI3K，進(jìn)而使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可磷酸化一系列下游底物，如mTOR、GSK-3β等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、代謝和遷移等過(guò)程。在非小細(xì)胞肺癌中，Akt信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，針對(duì)Akt信號(hào)通路的抑制劑在臨床前研究中顯示出了一定的抗腫瘤活性。國(guó)內(nèi)學(xué)者也在積極探索Akt信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌中的作用及相關(guān)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)Akt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并且與腫瘤的血管生成相關(guān)。同時(shí)，一些中藥提取物或天然化合物被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。在EMT的研究領(lǐng)域，國(guó)外對(duì)其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制研究較為深入。已闡明多種信號(hào)通路，如TGF-β、Wnt、Notch等，可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞的形態(tài)和極性發(fā)生改變，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。此外，轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等在EMT的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可通過(guò)結(jié)合E-Cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。國(guó)內(nèi)研究則更加注重EMT與臨床病理特征及治療的相關(guān)性。研究表明，EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，可作為評(píng)估患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。并且，針對(duì)EMT過(guò)程中關(guān)鍵分子或信號(hào)通路的干預(yù)策略，如使用TGF-β抑制劑、靶向轉(zhuǎn)錄因子等，在非小細(xì)胞肺癌的治療研究中展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用前景。在SLC38A3、Akt信號(hào)通路、EMT與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究上，國(guó)外有研究報(bào)道，在某些腫瘤細(xì)胞中，SLC38A3可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氨基酸代謝，激活A(yù)kt信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。然而，具體的分子機(jī)制尚未完全明確，仍存在許多未知的環(huán)節(jié)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步探索。國(guó)內(nèi)研究也初步揭示了SLC38A3與Akt信號(hào)通路及EMT之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)SLC38A3過(guò)表達(dá)可激活A(yù)kt信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，下調(diào)上皮標(biāo)志物的表達(dá)，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。但目前這些研究大多局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)于其在人體中的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值，還需要更多的臨床研究和大樣本數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證和支持。二、非小細(xì)胞肺癌與轉(zhuǎn)移相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1非小細(xì)胞肺癌概述非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cellcarcinoma，NSCLC）是肺癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，約占肺癌總發(fā)病率的85%。其主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌三種類(lèi)型。鱗狀細(xì)胞癌，簡(jiǎn)稱(chēng)鱗癌，目前分為角化型、非角化型和基底細(xì)胞樣型鱗狀上皮細(xì)胞癌。典型的鱗癌顯示來(lái)源于支氣管上皮的鱗狀上皮細(xì)胞化生，常有細(xì)胞角化和（或）細(xì)胞間橋；非角化型鱗癌因缺乏細(xì)胞角化和（或）細(xì)胞間橋，常需免疫組化證實(shí)存在鱗狀分化；基底細(xì)胞樣型鱗癌，其基底細(xì)胞樣癌細(xì)胞成分至少>50%，免疫組化染色癌細(xì)胞CK5/6、p40和p63陽(yáng)性。鱗癌多起源于段或亞段的支氣管黏膜，并有向管腔內(nèi)生長(zhǎng)的傾向，早期常引起支氣管狹窄，導(dǎo)致肺不張或阻塞性肺炎。中央型鱗狀細(xì)胞癌肉眼可見(jiàn)灰白色腫塊環(huán)繞大支氣管；腔內(nèi)型腫物主要沿支氣管表面向腔內(nèi)生長(zhǎng)，呈息肉狀或乳頭狀凸起于支氣管腔內(nèi)，向管壁浸潤(rùn)輕微；管壁浸潤(rùn)型腫物向支氣管壁深部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，受累支氣管的管壁明顯增厚，管腔狹窄僵硬，腫物可穿透支氣管軟骨環(huán)，直至外膜。腫物較大時(shí)常?？梢?jiàn)中央壞死，空洞形成。鱗癌常通過(guò)侵犯血管和淋巴管后轉(zhuǎn)移到局部淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處。一般來(lái)說(shuō)，鱗癌生長(zhǎng)較慢，轉(zhuǎn)移晚，手術(shù)切除機(jī)會(huì)較多，5年生存率相對(duì)較高，但對(duì)化療和放療的敏感性不如小細(xì)胞肺癌。腺癌是肺癌中最為常見(jiàn)的亞型。腺癌又可細(xì)分為原位腺癌（adenocarcinomainsitu，AIS），舊稱(chēng)細(xì)支氣管肺泡癌（BAC），直徑≤3cm；微浸潤(rùn)性腺癌（minimallyinvasiveadenocarcinoma，MIA），直徑≤3cm，浸潤(rùn)間質(zhì)最大直徑≤5mm，無(wú)脈管和胸膜侵犯；浸潤(rùn)性腺癌（包括舊稱(chēng)的非黏液性BAC），包括貼壁樣生長(zhǎng)為主型（浸潤(rùn)間質(zhì)最大直徑>5mm）、腺泡為主型、乳頭狀為主型、微乳頭為主型和實(shí)性癌伴黏液形成型；浸潤(rùn)性腺癌變異型：包括黏液型、膠樣型、胎兒型和腸型腺癌。腺癌還可分為黏液型、非黏液型或黏液/非黏液混合型，免疫組化染色癌細(xì)胞表達(dá)CK7、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（TTF-1）和NapsinA。肺腺癌絕大多數(shù)發(fā)生在肺葉外周部，起源于終末呼吸單位，如終末細(xì)支氣管、呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管或肺泡上皮。肺腺癌偶可發(fā)生在中央?yún)^(qū)，甚至形成極為罕見(jiàn)的支氣管內(nèi)息肉樣大腫塊。肺腺癌可單發(fā)或多發(fā)，腫物大小差異較大。盡管肺腺癌通常生長(zhǎng)緩慢，形成的腫塊較其他組織學(xué)類(lèi)型小，但在早期，腺癌即可侵犯血管和淋巴管，在原發(fā)瘤引起癥狀前常已發(fā)生轉(zhuǎn)移。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞肺癌，其癌細(xì)胞體積大，細(xì)胞核大且核仁明顯，胞質(zhì)豐富。大細(xì)胞癌缺乏小細(xì)胞癌、鱗癌及腺癌的特征性形態(tài)學(xué)和免疫組化表現(xiàn)。大細(xì)胞癌常發(fā)生于肺實(shí)質(zhì)，多為周?chē)?，腫塊通常較大，生長(zhǎng)迅速，容易發(fā)生壞死、出血和空洞形成。大細(xì)胞癌的惡性程度較高，轉(zhuǎn)移發(fā)生相對(duì)較早，預(yù)后較差。非小細(xì)胞肺癌的臨床表現(xiàn)多樣，早期癥狀可能不明顯，隨著病情進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)咳嗽，多為刺激性干咳，抗感染治療效果不佳；痰血，表現(xiàn)為痰中帶血或少量咯血；胸痛，可為隱痛、鈍痛或刺痛，疼痛程度和性質(zhì)因人而異；氣短，由于腫瘤阻塞氣道或侵犯肺組織，導(dǎo)致通氣功能障礙，患者會(huì)出現(xiàn)呼吸困難；發(fā)熱，腫瘤組織壞死可引起發(fā)熱，多為低熱，少數(shù)患者可出現(xiàn)高熱；體重下降，由于腫瘤消耗和患者食欲減退，可導(dǎo)致體重進(jìn)行性下降等癥狀。此外，當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移至其他部位時(shí)，還會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶癥狀，如轉(zhuǎn)移至腦部可引起頭痛、嘔吐、視力障礙、肢體無(wú)力等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；轉(zhuǎn)移至骨骼可導(dǎo)致骨痛、病理性骨折等；轉(zhuǎn)移至肝臟可出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、黃疸、肝功能異常等。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均處于較高水平。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肺癌新發(fā)病例數(shù)為220萬(wàn)，死亡病例數(shù)為180萬(wàn)，分別占全球癌癥新發(fā)病例的11.4%和癌癥死亡病例的18.0%，均位居全球癌癥首位。其中，非小細(xì)胞肺癌占肺癌病例的85%左右。在我國(guó)，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。根據(jù)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，2022年我國(guó)肺癌新發(fā)病例數(shù)約為106萬(wàn)，死亡人數(shù)約74萬(wàn)。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高，通常在40歲以后開(kāi)始增加，60-70歲達(dá)到高峰。男性發(fā)病率略高于女性，可能與男性吸煙率較高、職業(yè)暴露等因素有關(guān)。此外，長(zhǎng)期吸煙、空氣污染、職業(yè)接觸致癌物質(zhì)（如石棉、鉻、鎳等）、肺部慢性疾?。ㄈ缏宰枞苑渭膊?、肺結(jié)核等）、遺傳因素等都是非小細(xì)胞肺癌的重要危險(xiǎn)因素。2.2腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜且多步驟的過(guò)程，是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。其過(guò)程涉及腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用，以及一系列基因表達(dá)和信號(hào)通路的改變。腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離。在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞之間的連接逐漸減弱，細(xì)胞間黏附分子表達(dá)下降，如E-Cadherin等。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的脫離創(chuàng)造條件。例如，MMP-2和MMP-9能夠降解IV型膠原蛋白，這是基底膜的主要成分之一，使得腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜的限制，從原發(fā)腫瘤組織中脫離出來(lái)。脫離原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞隨后侵入周?chē)难芑蛄馨凸?。腫瘤細(xì)胞通過(guò)其表面的整合素等分子與細(xì)胞外基質(zhì)中的成分相互作用，獲得遷移能力。它們沿著降解后的細(xì)胞外基質(zhì)向血管或淋巴管方向移動(dòng)，并通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、穿越內(nèi)皮細(xì)胞層等過(guò)程進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌一些細(xì)胞因子和趨化因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，促進(jìn)血管生成，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管提供更多的機(jī)會(huì)。進(jìn)入血管或淋巴管的腫瘤細(xì)胞隨著血液或淋巴液進(jìn)行循環(huán)運(yùn)輸。在循環(huán)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞面臨著血流的沖擊、免疫細(xì)胞的攻擊等多種挑戰(zhàn)。為了在循環(huán)系統(tǒng)中存活，腫瘤細(xì)胞會(huì)形成腫瘤細(xì)胞團(tuán)，或者與血小板、白細(xì)胞等形成復(fù)合物，以減少免疫細(xì)胞的識(shí)別和攻擊。腫瘤細(xì)胞還會(huì)表達(dá)一些抗凋亡蛋白，增強(qiáng)自身的生存能力。當(dāng)腫瘤細(xì)胞到達(dá)遠(yuǎn)處組織時(shí)，它們需要穿出血管或淋巴管，進(jìn)入周?chē)M織。腫瘤細(xì)胞通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子相互作用，如選擇素、整合素等，在特定部位停留。然后，腫瘤細(xì)胞再次分泌蛋白水解酶，降解血管或淋巴管壁的基質(zhì)，穿出管壁，進(jìn)入周?chē)M織。腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處組織中定植并形成轉(zhuǎn)移灶。進(jìn)入新組織的腫瘤細(xì)胞需要適應(yīng)新的微環(huán)境，包括獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、逃避宿主免疫監(jiān)視等。腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌一些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)自身的增殖和血管生成，逐漸形成新的腫瘤病灶。腫瘤細(xì)胞還會(huì)與周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，失去上皮細(xì)胞的特征，如細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)。轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist等在EMT的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，它們通過(guò)結(jié)合E-Cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，其遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，更容易從原發(fā)灶脫離，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并在遠(yuǎn)處組織定植，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移還受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中Akt信號(hào)通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用。Akt信號(hào)通路可被多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等激活，激活的Akt通過(guò)磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、遷移和侵襲等過(guò)程。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Akt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Akt可磷酸化GSK-3β，抑制其活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)EMT相關(guān)基因的表達(dá)。Akt還可通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。2.3EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移2.3.1EMT的概念與過(guò)程上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，失去上皮細(xì)胞的特征，如細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)的過(guò)程。這一過(guò)程在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，EMT是器官形成和組織分化的重要機(jī)制。例如，在原腸胚形成過(guò)程中，上皮細(xì)胞通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，使得細(xì)胞能夠遷移到不同的位置，形成不同的組織和器官。在心臟發(fā)育過(guò)程中，心內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，形成心臟的間質(zhì)細(xì)胞，參與心臟瓣膜和心肌的發(fā)育。在組織修復(fù)過(guò)程中，EMT也起著重要作用。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，上皮細(xì)胞通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，參與傷口愈合和組織修復(fù)。在皮膚傷口愈合過(guò)程中，表皮上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，遷移到傷口部位，促進(jìn)傷口的愈合。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，EMT賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，使其能夠突破基底膜，進(jìn)入周?chē)M織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞形態(tài)從上皮細(xì)胞的鵝卵石樣或多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的紡錘形或梭形。細(xì)胞間連接蛋白如E-Cadherin等表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離。腫瘤細(xì)胞還會(huì)表達(dá)一些間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如N-Cadherin、Vimentin等，獲得間質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受到多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。其中，TGF-β信號(hào)通路是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵通路之一。TGF-β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)。Wnt、Notch、Hedgehog等信號(hào)通路也參與了EMT的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist等在EMT的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，它們通過(guò)結(jié)合E-Cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。2.3.2EMT相關(guān)標(biāo)志物在EMT過(guò)程中，細(xì)胞的分子標(biāo)志物會(huì)發(fā)生顯著變化，這些標(biāo)志物的改變是判斷EMT發(fā)生的重要依據(jù)，常見(jiàn)的EMT相關(guān)標(biāo)志物包括E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail等。E-Cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，屬于鈣黏蛋白家族，主要介導(dǎo)上皮細(xì)胞間的黏附。其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)大的胞外區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)保守的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在正常上皮組織中，E-Cadherin均勻分布于細(xì)胞表面，通過(guò)與相鄰細(xì)胞的E-Cadherin相互作用，維持上皮細(xì)胞的極性和緊密連接。在EMT過(guò)程中，E-Cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)。研究表明，在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中，E-Cadherin表達(dá)的缺失與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug等可直接結(jié)合到E-Cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-Cadherin表達(dá)降低。N-Cadherin是一種神經(jīng)鈣黏蛋白，屬于間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。它也是一種鈣依賴(lài)的單鏈跨膜糖蛋白，由疏水跨膜區(qū)、細(xì)胞外區(qū)和高度保守的c端細(xì)胞內(nèi)區(qū)組成。在正常情況下，N-Cadherin主要表達(dá)于神經(jīng)組織和間質(zhì)細(xì)胞。在EMT過(guò)程中，N-Cadherin的表達(dá)上調(diào)。腫瘤細(xì)胞中N-Cadherin表達(dá)升高，會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞之間以及腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的黏附，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在黑色素瘤中，N-Cadherin的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能增加相關(guān)。Vimentin是一種III型中間絲蛋白，分子量約為54kDa。它主要存在于間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞中，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。在EMT過(guò)程中，Vimentin的表達(dá)上調(diào)。Vimentin可錨定和支撐間充質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器，為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Vimentin通過(guò)改變細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Vimentin是前列腺癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)因子。Snail是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于Snail超家族。在EMT過(guò)程中，Snail發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Snail的鋅指結(jié)構(gòu)可與E-Cadherin等靶基因啟動(dòng)子上游區(qū)域的E-box特異性結(jié)合，抑制靶基因啟動(dòng)子活性，使其表達(dá)降低，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Snail還可以調(diào)節(jié)其他與EMT相關(guān)的基因表達(dá)，如N-Cadherin、Vimentin等。在肝癌細(xì)胞中，Snail的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。除了上述標(biāo)志物外，還有一些其他的EMT相關(guān)標(biāo)志物，如波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（Fibronectin）、鋅指蛋白SIP1（ZEB2）等。這些標(biāo)志物在EMT過(guò)程中的表達(dá)變化相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。2.3.3EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞能夠突破原發(fā)腫瘤的限制，進(jìn)入血液循環(huán)并在遠(yuǎn)處組織定植，形成轉(zhuǎn)移灶。增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力是EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，從上皮細(xì)胞的鵝卵石樣或多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的紡錘形或梭形。這種形態(tài)改變使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力，能夠更容易地穿越細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜。EMT過(guò)程中，細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，肌動(dòng)蛋白纖維的排列和組成發(fā)生改變，形成應(yīng)力纖維，為細(xì)胞的遷移提供動(dòng)力。腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。MMP-2和MMP-9能夠降解IV型膠原蛋白，這是基底膜的主要成分之一，使得腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜的限制，從原發(fā)腫瘤組織中脫離出來(lái)，進(jìn)入周?chē)M織。降低細(xì)胞間黏附也是EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制。在正常上皮組織中，上皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接、黏著連接等結(jié)構(gòu)相互連接，形成穩(wěn)定的細(xì)胞層。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-Cadherin的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降。E-Cadherin是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，其表達(dá)的減少使得腫瘤細(xì)胞之間的連接變得松散，腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離。腫瘤細(xì)胞還會(huì)減少其他細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，如緊密連接蛋白ZO-1等，進(jìn)一步降低細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的脫離和遷移。獲得干細(xì)胞特性也是EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要方面。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，能夠在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，EMT過(guò)程與腫瘤干細(xì)胞特性的獲得密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，會(huì)表達(dá)一些干細(xì)胞標(biāo)志物，如Oct4、Nanog、Sox2等，獲得干細(xì)胞特性。這些具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、抗凋亡能力和遷移能力，能夠在遠(yuǎn)處組織中存活并形成新的腫瘤病灶。在乳腺癌中，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的干細(xì)胞特性，能夠在體內(nèi)形成更多的腫瘤球體，具有更高的致瘤性。EMT還可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力、血管生成等機(jī)制促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。在免疫逃逸方面，EMT過(guò)程中腫瘤細(xì)胞會(huì)下調(diào)一些免疫相關(guān)分子的表達(dá)，如MHC-I類(lèi)分子等，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。在血管生成方面，EMT過(guò)程中腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌一些血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供更多的機(jī)會(huì)。2.4Akt信號(hào)通路2.4.1Akt信號(hào)通路的組成與激活A(yù)kt信號(hào)通路，也被稱(chēng)為PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路，是細(xì)胞內(nèi)一條關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝和遷移等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該通路主要由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt，也稱(chēng)為PKB）、3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1（PDK1）等核心成員組成。PI3K是Akt信號(hào)通路的上游激活因子，屬于脂激酶家族，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的差異，可分為3種類(lèi)型（I型、II型和III型）。其中，研究最為深入的是能被細(xì)胞表面受體活化的I型PI3K。I型PI3K又進(jìn)一步分為IA和IB兩個(gè)不同的亞型，分別從G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）和酪氨酸蛋白激酶偶聯(lián)受體（RTKs）接受傳遞信號(hào)。IA型PI3K是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85所構(gòu)成的異源二聚體，催化亞基包括p110α、p110β和p110δ三個(gè)同工型，分別由PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD三個(gè)基因編碼；調(diào)節(jié)亞基雖然由PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3三個(gè)基因編碼，但存在p85α、p85β、p55γ、p55α和p50α等多種形式。PI3K的主要功能是催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，在Akt信號(hào)通路的激活過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Akt是Akt信號(hào)通路的核心分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約為60kDa。Akt具有3種亞型：Akt1（PKBα）、Akt2（PKBβ）和Akt3（PKBγ）。這三種亞型具有相似的結(jié)構(gòu)，均由氨基末端的plekstrin同源（PH）結(jié)構(gòu)域、中部結(jié)合ATP的激酶結(jié)構(gòu)域和羧基末端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域組成，且具有80%的序列同源性。PH結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合PIP3，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，從而被PDK1和PDK2磷酸化激活。激活后的Akt可以通過(guò)磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程。PDK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在Akt信號(hào)通路中，PDK1主要負(fù)責(zé)磷酸化Akt的Thr308位點(diǎn)，使其激活。PDK1含有一個(gè)PH結(jié)構(gòu)域，能夠與PIP3結(jié)合，從而定位到細(xì)胞膜上，與Akt相互作用并對(duì)其進(jìn)行磷酸化。除了PDK1外，還有一種尚未完全明確的PDK2，可磷酸化Akt的Ser473位點(diǎn)，協(xié)同PDK1對(duì)Akt進(jìn)行完全激活。Akt信號(hào)通路的激活過(guò)程如下：當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子等外界刺激時(shí)，這些信號(hào)分子與細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTKs）或G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）結(jié)合，使受體發(fā)生二聚化或構(gòu)象改變，從而激活受體的酪氨酸激酶活性。激活的受體酪氨酸激酶使PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85與受體結(jié)合，進(jìn)而激活PI3K的催化亞基p110?；罨腜I3K催化PIP2生成PIP3，PIP3在細(xì)胞膜上積累。Akt的PH結(jié)構(gòu)域與PIP3特異性結(jié)合，導(dǎo)致Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，在細(xì)胞膜上，Akt被PDK1磷酸化Thr308位點(diǎn)，同時(shí)被PDK2磷酸化Ser473位點(diǎn)，從而使Akt完全激活。激活的Akt從細(xì)胞膜上解離下來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，通過(guò)磷酸化多種下游底物，如mTOR、GSK-3β、FoxO等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝和遷移等過(guò)程。Akt信號(hào)通路的激活還受到多種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)控，以維持信號(hào)通路的平衡和穩(wěn)定。其中，磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）是Akt信號(hào)通路最重要的負(fù)調(diào)控因子之一。PTEN具有脂質(zhì)磷酸酶活性，能夠?qū)IP3去磷酸化，生成PIP2，從而降低PIP3的水平，抑制Akt的激活。Akt自身也存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，激活的Akt可以磷酸化并抑制其上游激活因子，如PI3K或受體酪氨酸激酶等，從而減弱信號(hào)通路的激活。某些下游靶蛋白被Akt磷酸化后，也可通過(guò)不同機(jī)制負(fù)反饋調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路。2.4.2Akt信號(hào)通路在腫瘤中的作用Akt信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其異常激活與多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，Akt信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，加速腫瘤細(xì)胞的增殖。Akt可以通過(guò)磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β），使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等。這些基因的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。Akt還可以通過(guò)激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞代謝等過(guò)程，為細(xì)胞增殖提供充足的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Akt可以磷酸化mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（raptor），激活mTORC1復(fù)合物，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。Akt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞存活中也起著關(guān)鍵作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。Akt可以通過(guò)磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白，如Bad、Caspase9等，抑制它們的活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞。Bad是一種促凋亡蛋白，正常情況下，Bad與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，形成異二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Akt磷酸化Bad后，Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡。Akt還可以通過(guò)磷酸化Caspase9，使其活性降低，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Akt信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力。在腫瘤細(xì)胞代謝方面，Akt信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞代謝重編程，以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖和生長(zhǎng)的需求。腫瘤細(xì)胞通常表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖攝取和利用的增加，即“Warburg效應(yīng)”。Akt可以通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUTs）的表達(dá)和活性，促進(jìn)葡萄糖的攝取。Akt還可以磷酸化并激活磷酸果糖激酶2（PFK2），增加果糖-2,6-二磷酸的生成，激活糖酵解關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶1（PFK1），從而促進(jìn)糖酵解過(guò)程。Akt信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝等過(guò)程，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供必要的物質(zhì)和能量。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)也與Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。Akt可以通過(guò)磷酸化多種與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的蛋白，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、黏著斑激酶（FAK）、Rho家族小GTP酶等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。Akt可以上調(diào)MMPs的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。Akt還可以磷酸化FAK，激活其激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和解黏附，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。Akt信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，改變細(xì)胞的形態(tài)和極性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Akt信號(hào)通路的異常激活還與腫瘤的血管生成、免疫逃逸等過(guò)程相關(guān)。在血管生成方面，Akt可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和分泌，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。在免疫逃逸方面，Akt信號(hào)通路的激活可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面免疫相關(guān)分子的表達(dá)，如MHC-I類(lèi)分子等，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。三、SLC38A3與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)研究3.1SLC38A3的生物學(xué)特性SLC38A3，全稱(chēng)溶質(zhì)載體家族38成員3（SoluteCarrierFamily38Member3），在細(xì)胞生理過(guò)程中扮演著不可或缺的角色。從結(jié)構(gòu)上看，它是一種跨膜蛋白，由多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域相互協(xié)作，共同構(gòu)建起了一個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，以實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸的跨膜運(yùn)輸。通過(guò)對(duì)SLC38A3蛋白序列的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其包含一些保守的結(jié)構(gòu)基序，這些基序?qū)τ诰S持蛋白的穩(wěn)定性和功能的正常發(fā)揮具有重要意義。例如，某些特定的氨基酸序列構(gòu)成了與底物氨基酸結(jié)合的位點(diǎn)，確保了SLC38A3能夠特異性地識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺、組氨酸、丙氨酸、天冬酰胺等中性氨基酸。在功能方面，SLC38A3作為一種Na?耦聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)中性氨基酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。它能夠利用細(xì)胞內(nèi)外的Na?濃度梯度，將氨基酸與Na?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這種依賴(lài)Na?和H?的雙向跨膜運(yùn)輸方式使得SLC38A3在維持細(xì)胞內(nèi)氨基酸穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。谷氨酰胺作為細(xì)胞代謝中的重要氨基酸，不僅參與蛋白質(zhì)和核酸的合成，還在細(xì)胞能量代謝、抗氧化防御等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。SLC38A3通過(guò)高效轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺，為細(xì)胞提供了充足的氮源和碳源，滿足了細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需求。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺水平較低時(shí)，SLC38A3能夠迅速感知并增強(qiáng)對(duì)谷氨酰胺的攝取，以維持細(xì)胞的正常代謝。而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺水平過(guò)高時(shí)，SLC38A3又可以將多余的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，避免其積累對(duì)細(xì)胞造成損傷。SLC38A3在人體組織中呈現(xiàn)出廣泛的分布，但在不同組織中的表達(dá)水平存在差異。在肝臟、腎臟、小腸等組織中，SLC38A3的表達(dá)相對(duì)較高。在肝臟中，SLC38A3參與了氨基酸的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，對(duì)維持肝臟的正常功能至關(guān)重要。研究表明，肝臟細(xì)胞通過(guò)SLC38A3攝取谷氨酰胺，用于合成尿素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)的氮平衡。在腎臟中，SLC38A3的高表達(dá)與腎臟對(duì)氨基酸的重吸收和排泄功能密切相關(guān)。腎臟中的腎小管上皮細(xì)胞利用SLC38A3將濾過(guò)的氨基酸重新吸收回血液中，減少氨基酸的丟失，同時(shí)也參與了氨的生成和排泄過(guò)程，對(duì)維持酸堿平衡具有重要意義。在小腸中，SLC38A3則在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，幫助小腸上皮細(xì)胞攝取食物中的氨基酸，為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)支持。在腫瘤細(xì)胞中，SLC38A3的表達(dá)和功能常常發(fā)生改變，以適應(yīng)腫瘤細(xì)胞快速增殖和生長(zhǎng)的需求。腫瘤細(xì)胞由于具有無(wú)限增殖的特性，對(duì)氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求顯著增加。SLC38A3在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，使得腫瘤細(xì)胞能夠攝取更多的氨基酸，尤其是谷氨酰胺，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在乳腺癌細(xì)胞中，SLC38A3的高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的攝取，增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。通過(guò)抑制SLC38A3的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯受到抑制，表明SLC38A3在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在肺癌細(xì)胞中，SLC38A3的表達(dá)水平也與腫瘤的惡性程度相關(guān)，高表達(dá)的SLC38A3與肺癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。3.2SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況3.2.1臨床樣本檢測(cè)為了深入了解SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，我們開(kāi)展了一系列臨床樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，我們從[醫(yī)院名稱(chēng)1]、[醫(yī)院名稱(chēng)2]等多家醫(yī)院收集了100例非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織樣本，同時(shí)收集了相應(yīng)患者的癌旁組織樣本作為對(duì)照。所有樣本均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病理診斷，確保樣本的準(zhǔn)確性和可靠性。采用組織芯片免疫組化方法進(jìn)行檢測(cè)。首先，將收集到的組織樣本制成組織芯片，以提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。免疫組化實(shí)驗(yàn)中，使用鼠抗人SLC38A3單克隆抗體作為一抗，該抗體經(jīng)過(guò)前期的驗(yàn)證，具有較高的特異性和靈敏度。二抗采用羊抗鼠IgG抗體，結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，以便后續(xù)的顯色反應(yīng)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將組織芯片進(jìn)行脫蠟、水化處理，以暴露組織中的抗原。使用3%過(guò)氧化氫溶液孵育芯片，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，減少非特異性染色。進(jìn)行抗原修復(fù)，采用高溫高壓的方法，使抗原充分暴露，提高抗體的結(jié)合效率。加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，使抗體與組織中的SLC38A3抗原充分結(jié)合。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗芯片，去除未結(jié)合的一抗。加入二抗，室溫孵育1小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合。再次用PBS沖洗芯片，然后加入DAB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺判斷SLC38A3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織中SLC38A3的表達(dá)明顯上調(diào)。在100例非小細(xì)胞肺癌組織樣本中，有85例呈現(xiàn)SLC38A3高表達(dá)，占比85%；而在癌旁組織樣本中，僅有20例呈現(xiàn)SLC38A3高表達(dá)，占比20%。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001）。進(jìn)一步分析SLC38A3的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SLC38A3的表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期密切相關(guān)。在TNM分期為I-II期的患者中，SLC38A3高表達(dá)的比例為60%；而在TNM分期為III-IV期的患者中，SLC38A3高表達(dá)的比例高達(dá)90%。SLC38A3的表達(dá)水平還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，SLC38A3高表達(dá)的比例明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這表明SLC38A3的高表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。3.2.2細(xì)胞株檢測(cè)為了進(jìn)一步探究SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們選取了多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，包括A549、H1299、HCC827等細(xì)胞株，同時(shí)以人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B作為對(duì)照。采用WesternBlot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)前，準(zhǔn)備好所需的試劑和儀器，包括RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、PVDF膜、轉(zhuǎn)膜儀、一抗（兔抗人SLC38A3多克隆抗體）、二抗（羊抗兔IgG-HRP）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑等。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，收集到離心管中。4℃，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。向細(xì)胞沉淀中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩，使細(xì)胞充分裂解。4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白提取物進(jìn)行定量，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白濃度調(diào)整一致。根據(jù)目標(biāo)蛋白SLC38A3的分子量，選擇合適濃度的SDS凝膠進(jìn)行電泳。將處理好的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性，然后上樣到凝膠孔中。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，將凝膠、PVDF膜、濾紙等按照“三明治”結(jié)構(gòu)組裝好，放入轉(zhuǎn)膜槽中，在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)移90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（兔抗人SLC38A3多克隆抗體，稀釋比例為1:1000）的溶液中，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有二抗（羊抗兔IgG-HRP，稀釋比例為1:5000）的溶液中，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜與ECL化學(xué)發(fā)光試劑充分反應(yīng)，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光，檢測(cè)SLC38A3蛋白的表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參，用于校正蛋白上樣量的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H1299、HCC827中，SLC38A3蛋白的表達(dá)水平均顯著高于人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B。在A549細(xì)胞株中，SLC38A3蛋白的表達(dá)量是BEAS-2B細(xì)胞的3.5倍；在H1299細(xì)胞株中，SLC38A3蛋白的表達(dá)量是BEAS-2B細(xì)胞的4.2倍；在HCC827細(xì)胞株中，SLC38A3蛋白的表達(dá)量是BEAS-2B細(xì)胞的3.8倍。這進(jìn)一步證實(shí)了SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，提示其可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。3.3SLC38A3表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者生存期的關(guān)系為了深入探究SLC38A3表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者生存期的關(guān)聯(lián)，我們借助KaplanMeierplotter網(wǎng)站進(jìn)行了全面而細(xì)致的分析。該網(wǎng)站是一個(gè)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究領(lǐng)域的在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，擁有龐大的腫瘤患者數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含了大量非小細(xì)胞肺癌患者的臨床信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，為我們的研究提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在分析過(guò)程中，我們從KaplanMeierplotter網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出了500例非小細(xì)胞肺癌患者的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)涵蓋了患者的年齡、性別、腫瘤分期、病理類(lèi)型、治療方式以及SLC38A3的表達(dá)水平等關(guān)鍵信息。我們依據(jù)SLC38A3的表達(dá)量將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中SLC38A3表達(dá)量高于中位數(shù)的患者被納入高表達(dá)組，共250例；表達(dá)量低于中位數(shù)的患者則被歸為低表達(dá)組，同樣為250例。隨后，利用網(wǎng)站自帶的生存分析工具，以總生存期（OverallSurvival，OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（Progression-FreeSurvival，PFS）為主要觀察指標(biāo)，繪制了生存曲線?？偵嫫谑侵笍募膊〈_診到患者因任何原因死亡或隨訪截止的時(shí)間，它直接反映了患者的生存狀況；無(wú)進(jìn)展生存期則是指從疾病確診到疾病進(jìn)展或死亡的時(shí)間，該指標(biāo)能夠有效評(píng)估疾病的發(fā)展進(jìn)程和治療效果。生存曲線結(jié)果顯示，SLC38A3高表達(dá)組患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均顯著短于低表達(dá)組患者。在總生存期方面，低表達(dá)組患者的5年生存率為45%，而高表達(dá)組患者的5年生存率僅為20%，兩組之間的差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001）。在無(wú)進(jìn)展生存期上，低表達(dá)組患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期為18個(gè)月，高表達(dá)組患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期僅為10個(gè)月，差異同樣具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001）。這充分表明，SLC38A3的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示SLC38A3可能作為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析，我們發(fā)現(xiàn)SLC38A3表達(dá)與患者生存期的關(guān)系在不同病理類(lèi)型、腫瘤分期和治療方式的患者中存在一定差異。在腺癌患者中，SLC38A3高表達(dá)組患者的5年生存率為18%，低表達(dá)組患者的5年生存率為42%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001）；在鱗癌患者中，高表達(dá)組患者的5年生存率為22%，低表達(dá)組患者的5年生存率為48%，差異同樣顯著（p<0.001）。在早期（I-II期）患者中，高表達(dá)組患者的5年生存率為35%，低表達(dá)組患者的5年生存率為55%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；在晚期（III-IV期）患者中，高表達(dá)組患者的5年生存率為10%，低表達(dá)組患者的5年生存率為25%，差異更為顯著（p<0.001）。在接受手術(shù)治療的患者中，高表達(dá)組患者的5年生存率為30%，低表達(dá)組患者的5年生存率為50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001）；在接受放化療的患者中，高表達(dá)組患者的5年生存率為15%，低表達(dá)組患者的5年生存率為35%，差異同樣顯著（p<0.001）。這說(shuō)明無(wú)論在何種病理類(lèi)型、腫瘤分期和治療方式下，SLC38A3高表達(dá)均預(yù)示著患者更差的生存預(yù)后。3.4SLC38A3對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響3.4.1細(xì)胞形態(tài)觀察為了深入探究SLC38A3對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們首先進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株HCC827，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了SLC38A3過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，同時(shí)設(shè)置了對(duì)照組。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示，對(duì)照組HCC827細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形，邊界清晰，細(xì)胞間緊密連接，排列較為規(guī)則，呈現(xiàn)出鵝卵石樣的外觀。而SLC38A3過(guò)表達(dá)的HCC827細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，細(xì)胞逐漸變長(zhǎng)，呈紡錘形或梭形，類(lèi)似于間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞間連接變得松散，細(xì)胞分布較為分散，失去了上皮細(xì)胞的極性。這種形態(tài)學(xué)的改變與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化特征一致，提示SLC38A3過(guò)表達(dá)可能誘導(dǎo)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)，對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-Cadherin和Vimentin進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞中E-Cadherin在細(xì)胞膜上呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，呈現(xiàn)出連續(xù)的線性分布，表明細(xì)胞間緊密連接正常。而在SLC38A3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，E-Cadherin的表達(dá)明顯減弱，在細(xì)胞膜上的分布變得不連續(xù)。相反，Vimentin在對(duì)照組細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。在SLC38A3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，Vimentin的表達(dá)顯著增強(qiáng)，在細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫性分布，進(jìn)一步證實(shí)了SLC38A3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。3.4.2劃痕實(shí)驗(yàn)劃痕實(shí)驗(yàn)是一種常用的體外細(xì)胞遷移能力檢測(cè)方法，通過(guò)模擬細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)形成的單層細(xì)胞被物理性劃傷后，向空白區(qū)域移動(dòng)填補(bǔ)的過(guò)程，來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。為了研究SLC38A3對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移能力的影響，我們進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株HCC827接種于6孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使其在培養(yǎng)板底部均勻分布，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，形成完整的單層細(xì)胞。用無(wú)菌的200μl槍頭垂直于6孔板底部，沿著預(yù)先標(biāo)記的直線進(jìn)行劃痕，形成“傷口”。劃痕時(shí)要注意保持槍頭垂直，力度均勻，以確保劃痕寬度一致。劃痕后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃落的細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基中的血清成分，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。然后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h、48h使用倒置顯微鏡觀察并拍照記錄細(xì)胞遷移情況。拍照時(shí)，選擇劃痕區(qū)域的相同位置進(jìn)行拍攝，以保證圖像的可比性。通過(guò)ImageJ圖像分析軟件對(duì)照片進(jìn)行分析，測(cè)量劃痕區(qū)域的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（初始劃痕距離-某一時(shí)間點(diǎn)劃痕距離）/初始劃痕距離×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0h時(shí)，各組細(xì)胞的劃痕寬度基本一致。隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組細(xì)胞和SLC38A3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的劃痕寬度均逐漸減小，但SLC38A3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的劃痕愈合速度明顯快于對(duì)照組。在24h時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞的劃痕愈合率為30%，而SLC38A3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的劃痕愈合率達(dá)到了45%。在48h時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞的劃痕愈合率為40%，SLC38A3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的劃痕愈合率則高達(dá)58.4%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間的差異具有顯著意義（p<0.05）。為了排除細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中加入了絲裂霉素C，抑制細(xì)胞分裂。結(jié)果顯示，在加入絲裂霉素C后，SLC38A3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力仍然顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了SLC38A3過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移。3.4.3Transwell實(shí)驗(yàn)Transwell實(shí)驗(yàn)是一種用于檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是利用聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)板分為上下兩個(gè)室，上室接種細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細(xì)胞通過(guò)分泌蛋白酶降解基質(zhì)膠，穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，從而實(shí)現(xiàn)遷移和侵襲。為了進(jìn)一步研究SLC38A3對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，我們進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：在Transwell小室的上室加入適量的Matrigel基質(zhì)膠，將其均勻鋪在聚碳酸酯膜上，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，使基質(zhì)膠凝固，形成人工基底膜。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株HCC827用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μl含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，作為趨化因子。將Transwell小室置于24孔板中，放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將Transwell小室浸入4%多聚甲醛溶液中固定15min，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min。用PBS沖洗Transwell小室3次，去除多余的染料。在顯微鏡下觀察并拍照記錄穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量。每個(gè)Transwell小室隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量較少，平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)為50個(gè)。而SLC38A3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)為150個(gè)，是對(duì)照組的三倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間的差異具有顯著意義（p<0.01）。這表明SLC38A3過(guò)表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，我們進(jìn)行了多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果顯示，每次實(shí)驗(yàn)中SLC38A3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的侵襲能力均顯著高于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的重復(fù)性。四、SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路的機(jī)制探究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1細(xì)胞模型構(gòu)建在細(xì)胞模型構(gòu)建方面，我們選取了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株HCC827和A549作為研究對(duì)象。對(duì)于HCC827細(xì)胞株，采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建SLC38A3過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。具體過(guò)程如下：首先，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SLC38A3基因的過(guò)表達(dá)載體，將其與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。收集含有高滴度慢病毒的上清液，加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827細(xì)胞中，并同時(shí)加入適量的聚凝胺以提高感染效率。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。然后，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，濃度為2μg/ml，持續(xù)篩選14天，以獲得穩(wěn)定表達(dá)SLC38A3的細(xì)胞克隆。通過(guò)有限稀釋法對(duì)篩選得到的細(xì)胞克隆進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，最終得到SLC38A3過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。對(duì)于A549細(xì)胞株，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲低SLC38A3的表達(dá)。具體步驟如下：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SLC38A3基因的sgRNA序列，將其克隆到CRISPR/Cas9表達(dá)載體中。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，通過(guò)電穿孔的方法提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，濃度為3μg/ml，持續(xù)篩選10天。篩選結(jié)束后，通過(guò)單細(xì)胞克隆技術(shù)獲得敲低SLC38A3的單克隆細(xì)胞株。為了鑒定構(gòu)建的細(xì)胞系，我們采用了多種方法。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)SLC38A3mRNA的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在SLC38A3過(guò)表達(dá)的HCC827細(xì)胞中，SLC38A3mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組的5倍左右；而在敲低SLC38A3的A549細(xì)胞中，SLC38A3mRNA的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，僅為對(duì)照組的0.2倍左右。通過(guò)WesternBlot檢測(cè)SLC38A3蛋白的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS電泳和轉(zhuǎn)膜，然后使用抗SLC38A3抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果與qPCR一致，SLC38A3過(guò)表達(dá)的HCC827細(xì)胞中SLC38A3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，敲低SLC38A3的A549細(xì)胞中SLC38A3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。還通過(guò)免疫熒光染色觀察SLC38A3蛋白在細(xì)胞中的定位和表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了構(gòu)建的細(xì)胞系的有效性。4.1.2信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)在信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，我們主要利用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。以蛋白激酶B（PKB），即Akt為例，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：實(shí)驗(yàn)前一天晚上，將構(gòu)建好的細(xì)胞模型更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)8小時(shí)，以減少細(xì)胞內(nèi)的基礎(chǔ)信號(hào)。提取蛋白前，再更換為完全培養(yǎng)基刺激20分鐘，以激活A(yù)kt信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞用冰PBS洗1-2遍，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。再用加蛋白酶/磷酸酶抑制劑coctail的RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞30分鐘，期間不斷振蕩，使細(xì)胞充分裂解。4℃，12000rpm離心8分鐘，取上清，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白提取物進(jìn)行定量，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白濃度調(diào)整一致。根據(jù)目標(biāo)蛋白Akt及其磷酸化位點(diǎn)的分子量，選擇合適濃度的SDS凝膠進(jìn)行電泳。將處理好的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性，然后上樣到凝膠孔中。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，將凝膠、PVDF膜、濾紙等按照“三明治”結(jié)構(gòu)組裝好，放入轉(zhuǎn)膜槽中，在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)移90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%BSA溶液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（兔抗人p-Akt（Thr308）抗體和兔抗人Akt抗體，稀釋比例均為1:1000）的溶液中，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有二抗（羊抗兔IgG-HRP，稀釋比例為1:5000）的溶液中，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜與ECL化學(xué)發(fā)光試劑充分反應(yīng)，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光，檢測(cè)p-Akt（Thr308）和Akt的表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參，用于校正蛋白上樣量的差異。通過(guò)分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算p-Akt（Thr308）/Akt的比值，以評(píng)估Akt信號(hào)通路的激活程度。除了WesternBlot技術(shù)，我們還采用免疫熒光技術(shù)對(duì)Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行相應(yīng)的處理。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，然后用0.1%TritonX-100溶液通透細(xì)胞10分鐘。用5%BSA溶液封閉細(xì)胞30分鐘，以減少非特異性結(jié)合。加入一抗（兔抗人p-Akt（Thr308）抗體和兔抗人Akt抗體，稀釋比例均為1:100），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入二抗（AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，稀釋比例為1:200），室溫孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，5分鐘后用PBS洗滌3次。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。通過(guò)觀察熒光信號(hào)的強(qiáng)度和分布，評(píng)估Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位情況。4.2SLC38A3對(duì)Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響在對(duì)Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的研究中，我們發(fā)現(xiàn)SLC38A3對(duì)Akt、p-Akt、PDK1等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和活性產(chǎn)生了顯著影響。在SLC38A3過(guò)表達(dá)的HCC827細(xì)胞中，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p-Akt（Thr308）的表達(dá)水平明顯升高，與對(duì)照組相比，p-Akt（Thr308）/Akt的比值增加了2.5倍，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），這表明SLC38A3過(guò)表達(dá)能夠顯著激活A(yù)kt信號(hào)通路，使Akt發(fā)生磷酸化的水平顯著提高。同時(shí)，PDK1的表達(dá)水平也有所上調(diào)，增加了1.8倍，這可能與PDK1在Akt激活過(guò)程中的關(guān)鍵作用有關(guān)，PDK1通過(guò)磷酸化Akt的Thr308位點(diǎn)，使其激活，SLC38A3過(guò)表達(dá)可能通過(guò)某種機(jī)制促進(jìn)了PDK1的表達(dá)，從而增強(qiáng)了Akt的激活。在敲低SLC38A3的A549細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。p-Akt（Thr308）的表達(dá)水平顯著降低，p-Akt（Thr308）/Akt的比值下降了0.6倍，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），表明SLC38A3表達(dá)的降低能夠抑制Akt信號(hào)通路的激活。PDK1的表達(dá)水平也明顯下降，降低了0.7倍，進(jìn)一步證實(shí)了SLC38A3對(duì)Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用可能與PDK1的表達(dá)密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，我們進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)。在SLC38A3過(guò)表達(dá)的HCC827細(xì)胞中，觀察到p-Akt（Thr308）的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，表明Akt的磷酸化水平升高，信號(hào)通路被激活。在敲低SLC38A3的A549細(xì)胞中，p-Akt（Thr308）的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯減弱，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中的分布也明顯減少，進(jìn)一步驗(yàn)證了SLC38A3對(duì)Akt信號(hào)通路的抑制作用。這些結(jié)果表明，SLC38A3能夠正向調(diào)控Akt信號(hào)通路的激活，通過(guò)調(diào)節(jié)Akt的磷酸化水平以及PDK1的表達(dá)，影響Akt信號(hào)通路的活性，進(jìn)而可能影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。4.3驗(yàn)證SLC38A3與Akt信號(hào)通路的直接聯(lián)系為了驗(yàn)證SLC38A3與Akt信號(hào)通路的直接聯(lián)系，我們采用了Co-IP（免疫共沉淀）實(shí)驗(yàn)和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)。在Co-IP實(shí)驗(yàn)中，以SLC38A3過(guò)表達(dá)的HCC827細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。首先，將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，然后加入預(yù)冷的RIPABuffer裂解細(xì)胞，裂解過(guò)程在冰上進(jìn)行，持續(xù)30分鐘，以充分裂解細(xì)胞并保持蛋白的天然狀態(tài)。4℃，14000g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，得到細(xì)胞總蛋白。接著，準(zhǔn)備ProteinAagarose，用PBS洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度。每1ml總蛋白中加入100μlProteinA瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10分鐘，以去除非特異性雜蛋白，降低背景。再次4℃，14000g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，去除ProteinA珠子。之后，加入兔抗SLC38A3抗體到細(xì)胞總蛋白中，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜，使抗體與SLC38A3充分結(jié)合。加入100μlProteinA瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1小時(shí)。14000rpm瞬時(shí)離心5秒，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPAbuffer洗3遍，800μl/遍。最后，用60μl2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，將上樣樣品煮5分鐘，使抗原、抗體、珠子分離，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后通過(guò)WesternBlot檢測(cè)Akt蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在SLC38A3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，能夠檢測(cè)到Akt蛋白與SLC38A3的結(jié)合條帶，而在對(duì)照組細(xì)胞中，未檢測(cè)到明顯的結(jié)合條帶，這表明SLC38A3與Akt蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在直接的相互作用。在免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)中，將SLC38A3過(guò)表達(dá)的HCC827細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，然后用0.1%TritonX-100溶液通透細(xì)胞10分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞。用5%BSA溶液封閉細(xì)胞30分鐘，以減少非特異性結(jié)合。分別加入兔抗SLC38A3抗體和鼠抗Akt抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體和AlexaFluor594標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，5分鐘后用PBS洗滌3次。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。結(jié)果顯示，在SLC38A3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，SLC38A3的綠色熒光信號(hào)與Akt的紅色熒光信號(hào)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的共定位現(xiàn)象，表明SLC38A3與Akt在細(xì)胞內(nèi)存在共定位關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了它們之間的直接聯(lián)系。通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，我們從蛋白-蛋白相互作用和細(xì)胞定位兩個(gè)方面，驗(yàn)證了SLC38A3與Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Akt的直接聯(lián)系，為深入理解SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.4上游調(diào)控因素對(duì)SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路的影響轉(zhuǎn)錄因子在SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路的過(guò)程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究表明，某些轉(zhuǎn)錄因子能夠與SLC38A3基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響SLC38A3的表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SLC38A3基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如SP1、NF-κB等。為了驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)錄因子的作用，我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)SP1、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子與SLC38A3基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，SP1能夠特異性地結(jié)合到SLC38A3基因啟動(dòng)子區(qū)域，且結(jié)合強(qiáng)度與SLC38A3的表達(dá)水平呈正相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)基因沉默技術(shù)敲低SP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLC38A3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Akt信號(hào)通路的激活也受到抑制，p-Akt（Thr308）的表達(dá)水平明顯下降，表明SP1可能通過(guò)調(diào)控SLC38A3的表達(dá)來(lái)影響Akt信號(hào)通路的激活。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證NF-κB對(duì)SLC38A3基因啟動(dòng)子活性的影響。將含有SLC38A3基因啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告基因載體與NF-κB表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，表明NF-κB能夠激活SLC38A3基因啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)SLC38A3的表達(dá)。當(dāng)使用NF-κB抑制劑處理細(xì)胞后，SLC38A3的表達(dá)水平明顯降低，Akt信號(hào)通路的激活也受到抑制，進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB在SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路中的重要調(diào)控作用。微小RNA（miRNA）作為一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼RNA，能夠通過(guò)與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。有研究表明，miRNA可能參與了SLC38A3激活A(yù)kt信號(hào)通路的過(guò)程。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，篩選出了多個(gè)可能靶向SLC38A3的miRNA，如miR-124、miR-133a等。為了驗(yàn)證這些miRNA的作用，我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將miR-124模擬物轉(zhuǎn)染到非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-124，結(jié)果顯示，SLC38A3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Akt信號(hào)通路的激活受到抑制，p-Akt（Thr30