JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及多維度機制解析

JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及多維度機制解析一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)，胃癌新發(fā)病例數(shù)達108.9萬，在所有惡性腫瘤中位居第五；死亡病例數(shù)為76.9萬，位列第四。在我國，胃癌的形勢更為嚴(yán)峻，由于人口基數(shù)龐大以及飲食習(xí)慣、幽門螺桿菌感染等多種因素的影響，我國是胃癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例和死亡病例均占全球的一半左右。胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，此時腫瘤往往已發(fā)生局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移，錯失了最佳手術(shù)時機。中晚期胃癌患者的5年生存率較低，僅為20%-30%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。目前，臨床上對于胃癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段。手術(shù)切除是早期胃癌的主要治療方法，但對于中晚期胃癌患者，單純手術(shù)治療效果不佳，常需要結(jié)合化療等綜合治療手段?；熕幬镫m然能夠在一定程度上抑制腫瘤細胞的生長和擴散，但同時也會對正常細胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的治療依從性和生活質(zhì)量。而且，長期使用化療藥物還容易導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，進一步增加了胃癌治療的難度。因此，尋找一種高效、低毒且能夠克服耐藥性的新型治療藥物，成為了胃癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。一氧化氮（NO）作為一種重要的生物活性分子，在體內(nèi)參與了多種生理和病理過程，包括血管舒張、神經(jīng)傳遞、免疫調(diào)節(jié)和細胞凋亡等。近年來，越來越多的研究表明，NO在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價值。NO可以通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，如誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤血管生成以及增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)等。然而，由于NO是一種氣體分子，在體內(nèi)的半衰期極短，難以直接應(yīng)用于臨床治療。因此，開發(fā)新型的NO供體藥物，使其能夠在體內(nèi)穩(wěn)定釋放NO，并特異性地作用于腫瘤細胞，成為了腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點之一。JS-K（O2-(2,4-二硝基苯基)-1-[(4-乙氧基羰基)哌嗪-1-基]重氮-1-ium-1,2-二醇鹽）是一種新型的NO供體藥物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨特，能夠在生理pH條件下與細胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）發(fā)生反應(yīng)，緩慢釋放出NO。與傳統(tǒng)的NO供體相比，JS-K具有更高的穩(wěn)定性和選擇性，能夠在腫瘤細胞內(nèi)特異性地釋放NO，從而增強其抗腫瘤效果，同時減少對正常組織的毒副作用。已有研究表明，JS-K對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，包括白血病、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等。然而，關(guān)于JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)機制的研究還相對較少，其在胃癌治療中的應(yīng)用潛力尚有待進一步探索。因此，本研究旨在探討JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)機制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)作用機制。通過細胞實驗和動物實驗，明確JS-K對人胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，并從分子生物學(xué)層面揭示其潛在的作用靶點和信號通路，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。胃癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其高發(fā)病率和死亡率給患者家庭及社會帶來沉重負擔(dān)。盡管目前胃癌的治療手段多樣，但中晚期胃癌患者的治療效果仍不理想，5年生存率較低，且化療藥物的毒副作用和耐藥性問題亟待解決。因此，尋找新型、高效、低毒的治療藥物和方法具有重要的臨床意義。NO在腫瘤治療中的潛在價值逐漸受到關(guān)注，而JS-K作為新型NO供體藥物，其獨特的釋放NO機制和潛在的抗腫瘤優(yōu)勢，為胃癌治療開辟了新的研究方向。深入研究JS-K對人胃癌細胞的作用及機制，有望揭示其在胃癌治療中的獨特優(yōu)勢和潛在應(yīng)用價值，為開發(fā)新型胃癌治療藥物提供理論基礎(chǔ)，從而提高胃癌患者的治療效果和生存質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用前景。1.3研究方法和創(chuàng)新點本研究采用了多種實驗方法來全面探究JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及其機制。在細胞實驗方面，運用MTT比色法檢測JS-K對人胃癌細胞增殖的影響，通過繪制細胞生長曲線，直觀地展現(xiàn)不同濃度JS-K在不同作用時間下對胃癌細胞生長的抑制情況。利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期分布，精確分析JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡以及對細胞周期進程的阻滯作用。借助Transwell小室實驗，研究JS-K對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響，從細胞運動特性角度揭示其抗腫瘤作用。此外，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白的表達水平，如凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax，細胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1、p21，以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin等，從分子層面深入解析JS-K作用的潛在機制。在動物實驗方面，構(gòu)建人胃癌細胞裸鼠移植瘤模型，將胃癌細胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤生長至一定大小后，隨機分組給予不同處理，包括JS-K不同劑量組、對照組等。定期測量腫瘤體積和重量，觀察JS-K在體內(nèi)對腫瘤生長的抑制作用。通過對腫瘤組織進行免疫組織化學(xué)染色、TUNEL染色等，進一步驗證JS-K在體內(nèi)的抑瘤效應(yīng)以及誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，并檢測相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達情況。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，從多個維度深入探究JS-K對人胃癌細胞的作用機制，不僅關(guān)注其對細胞增殖、凋亡的影響，還深入研究其對細胞遷移、侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長的作用，全面揭示JS-K的抗腫瘤效應(yīng)。其次，在機制研究中，綜合運用多種分子生物學(xué)技術(shù)，從蛋白表達水平和信號通路激活狀態(tài)等多個層面，系統(tǒng)分析JS-K作用的潛在靶點和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為深入理解其抗腫瘤機制提供了更全面、深入的視角。此外，目前關(guān)于JS-K在胃癌治療中的研究相對較少，本研究的開展有望填補這一領(lǐng)域的部分空白，為JS-K在胃癌治療中的臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。二、JS-K與胃癌細胞相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌細胞特性胃癌細胞作為一種惡性腫瘤細胞，具有一系列與正常胃黏膜上皮細胞截然不同的特性。這些特性使得胃癌細胞能夠在體內(nèi)不斷生長、擴散，進而對機體造成嚴(yán)重的損害。首先，胃癌細胞具有無限增殖的能力。正常的胃黏膜上皮細胞在生長過程中受到嚴(yán)格的調(diào)控機制的約束，當(dāng)細胞達到一定數(shù)量或完成特定的生理功能后，會停止增殖或者進入凋亡程序。然而，胃癌細胞由于多種致癌因素的作用，其內(nèi)部的調(diào)控機制發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細胞周期失控，細胞能夠持續(xù)不斷地進行分裂和增殖。例如，癌基因K-ras、C-erbB2等的激活以及抑癌基因p53等的失活，都可以促進胃癌細胞的無限增殖。這些基因的異常改變使得細胞內(nèi)的信號通路發(fā)生異常激活或抑制，如Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的過度激活，能夠持續(xù)傳遞細胞增殖的信號，促使胃癌細胞不斷地進行DNA復(fù)制和細胞分裂，從而實現(xiàn)腫瘤的快速生長。其次，胃癌細胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變。正常的胃黏膜上皮細胞呈現(xiàn)出規(guī)則的形態(tài)和排列方式，細胞之間緊密連接，具有明確的極性。而胃癌細胞則失去了這種正常的形態(tài)和極性，細胞形態(tài)變得不規(guī)則，大小不一，細胞核增大、深染，核質(zhì)比例失調(diào)。這種形態(tài)學(xué)上的改變不僅反映了胃癌細胞的惡性程度，還與其生物學(xué)行為密切相關(guān)。例如，形態(tài)不規(guī)則的胃癌細胞更容易突破細胞間的連接，獲得遷移和侵襲的能力，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。再者，胃癌細胞具有很強的轉(zhuǎn)移能力。這是胃癌患者預(yù)后不良的重要原因之一。胃癌細胞可以通過多種途徑發(fā)生轉(zhuǎn)移，包括淋巴道轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移。在淋巴道轉(zhuǎn)移過程中，胃癌細胞首先侵入胃周圍的淋巴管，然后隨著淋巴液的流動到達局部淋巴結(jié)，進而擴散到遠處淋巴結(jié)。血行轉(zhuǎn)移則是胃癌細胞進入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過血流播散到全身各個器官，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、肺、骨骼等。種植轉(zhuǎn)移是指胃癌細胞脫落到腹腔內(nèi)，種植在腹膜、大網(wǎng)膜等表面，形成新的腫瘤病灶。胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力與其表面表達的多種分子密切相關(guān)，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin等的高表達，能夠使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞的特性，從而增強細胞的遷移和侵襲能力。此外，一些黏附分子如整合素家族成員的異常表達，也有助于胃癌細胞與血管內(nèi)皮細胞或基底膜的黏附，促進其轉(zhuǎn)移。最后，胃癌細胞的代謝方式也發(fā)生了改變。與正常細胞主要通過有氧氧化獲取能量不同，胃癌細胞即使在有氧條件下也傾向于進行糖酵解，即Warburg效應(yīng)。這種代謝方式的改變使得胃癌細胞能夠快速攝取葡萄糖，并將其轉(zhuǎn)化為乳酸，為細胞的快速增殖提供能量和生物合成的原料。同時，糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸等代謝產(chǎn)物還可以改變腫瘤微環(huán)境的酸堿度，促進腫瘤細胞的生存和轉(zhuǎn)移。此外，胃癌細胞還會通過上調(diào)一些代謝相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運蛋白，如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）、己糖激酶2（HK2）等，來滿足其旺盛的代謝需求。從基因?qū)用鎭砜矗赴┑陌l(fā)生是一個多基因、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。除了上述提到的K-ras、C-erbB2、p53等基因外，還有許多其他基因參與其中。例如，PTEN基因作為一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有磷酸酶活性，能夠負向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路。在胃癌中，PTEN基因常常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致PI3K-Akt信號通路過度激活，促進細胞的增殖、存活和遷移。此外，一些微小RNA（miRNA）也在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，能夠通過與靶mRNA的互補配對，抑制其翻譯過程或促使其降解。例如，miR-21在胃癌組織中高表達，它可以靶向抑制多種抑癌基因的表達，如PTEN、PDCD4等，從而促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。2.2JS-K簡介JS-K，化學(xué)名為O2-(2,4-二硝基苯基)-1-[(4-乙氧基羰基)哌嗪-1-基]重氮-1-ium-1,2-二醇鹽，是一種結(jié)構(gòu)獨特的一氧化氮（NO）前體藥。其化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的生物學(xué)特性，在生理pH條件下，JS-K能夠與細胞內(nèi)廣泛存在的谷胱甘肽（GSH）發(fā)生特異性反應(yīng)。這一反應(yīng)過程促使JS-K逐步、穩(wěn)定地釋放出NO，使得NO能夠在細胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。與傳統(tǒng)的NO供體相比，JS-K的這種釋放機制具有顯著優(yōu)勢。傳統(tǒng)NO供體往往存在釋放不穩(wěn)定、難以精準(zhǔn)控制釋放量和釋放位點等問題。而JS-K通過與GSH的反應(yīng)，實現(xiàn)了在細胞內(nèi)尤其是腫瘤細胞內(nèi)的特異性釋放，極大地提高了NO作用的靶向性。這不僅增強了其對腫瘤細胞的作用效果，還能有效減少NO對正常組織細胞的非特異性損傷，降低了潛在的毒副作用。在其他腫瘤的研究中，JS-K已展現(xiàn)出令人矚目的成果。在白血病研究領(lǐng)域，有研究表明JS-K能夠顯著抑制JurkatT急性淋巴細胞白血病細胞的增殖。通過誘導(dǎo)細胞凋亡程序的激活，促使白血病細胞走向死亡，同時還能擾亂白血病細胞的細胞周期進程，阻止細胞從一個階段順利過渡到下一個階段，從而抑制白血病細胞的無限增殖。在乳腺癌研究方面，JS-K能夠通過多種途徑抑制乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。它可以上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，打破細胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡。此外，JS-K還能抑制乳腺癌細胞中與遷移和侵襲密切相關(guān)的蛋白表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，從而降低乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。在肺癌研究中，JS-K被發(fā)現(xiàn)能夠抑制肺癌細胞的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。進一步的機制研究揭示，JS-K可以通過調(diào)節(jié)肺癌細胞內(nèi)的信號通路，如抑制PI3K-Akt信號通路的激活，從而影響細胞的增殖、存活和遷移等生物學(xué)行為。在結(jié)腸癌研究中，JS-K同樣表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。它能夠抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并抑制腫瘤血管生成。通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體的表達，減少腫瘤新生血管的形成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，進而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。三、JS-K對人胃癌細胞抑瘤效應(yīng)的體外研究3.1實驗材料與準(zhǔn)備本實驗選用人胃癌細胞系SGC-7901，該細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。其具有典型的胃癌細胞特征，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定生長和增殖，常用于胃癌相關(guān)的研究，為本實驗提供了穩(wěn)定且可靠的細胞模型。實驗所用的JS-K粉末購自Sigma-Aldrich公司，其純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測大于98%，確保了實驗藥物的質(zhì)量和穩(wěn)定性。二甲基亞砜（DMSO）購自Amresco公司，作為JS-K的溶劑，其純度高、雜質(zhì)少，對細胞毒性極低，能夠有效溶解JS-K并保證其在溶液中的穩(wěn)定性。胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，富含多種細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，能夠為胃癌細胞的生長提供良好的營養(yǎng)環(huán)境。RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，其配方經(jīng)過優(yōu)化，適合多種細胞的培養(yǎng)，尤其是腫瘤細胞，為胃癌細胞的體外培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)的營養(yǎng)支持。胰蛋白酶購自Solarbio公司，其活性高、酶解效果好，能夠快速、有效地消化貼壁生長的胃癌細胞，用于細胞傳代和實驗操作。MTT試劑購自Beyotime公司，是一種廣泛應(yīng)用于細胞活性檢測的試劑，通過檢測活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶活性，間接反映細胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，該試劑盒采用雙染色法，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，為細胞凋亡檢測提供了可靠的方法。實驗中用到的主要儀器包括CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為胃癌細胞的生長提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件。酶標(biāo)儀（BioTek）用于MTT實驗中檢測吸光值，其檢測精度高、重復(fù)性好，能夠準(zhǔn)確地反映細胞的活性變化。流式細胞儀（BDFACSCalibur）用于檢測細胞凋亡率和細胞周期分布，具有高速、高精度的特點，能夠?qū)Υ罅考毎M行快速分析。倒置顯微鏡（Olympus）用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，其成像清晰、操作簡便，方便實時監(jiān)測細胞的培養(yǎng)情況。細胞培養(yǎng)過程如下：從液氮中取出凍存的SGC-7901細胞，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。先用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化1-2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞開始變圓、脫落時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞充分分散，然后將細胞懸液按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。JS-K溶液配制方法為：精確稱取一定量的JS-K粉末，用DMSO溶解，配制成100mM的JS-K母液。將母液分裝于無菌的EP管中，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。使用時，根據(jù)實驗所需濃度，用RPMI-1640培養(yǎng)基將母液稀釋成相應(yīng)濃度的工作液。例如，若要配制10μM的JS-K工作液，則取1μL的100mM母液加入到999μL的培養(yǎng)基中，充分混勻即可。3.2MTT法測定JS-K對胃癌細胞活性的抑制作用取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液。使用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×103/ml，將細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入200μl，使細胞均勻分布。將接種好的96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁且處于指數(shù)生長期時，進行藥物處理。將預(yù)先配制好的不同濃度（0、1、5、10、20、40μM）的JS-K工作液，分別加入到96孔板中，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。同時設(shè)置對照組，對照組加入等體積的不含JS-K的培養(yǎng)基。加藥后，將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12h、24h、48h和72h后進行MTT檢測。在相應(yīng)的時間點，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，小心吸去每孔中的上清液，注意避免吸到細胞。每孔加入100μl新鮮配制的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，再加入20μlMTT溶液（5mg/ml），輕輕振蕩96孔板，使MTT溶液與培養(yǎng)基充分混勻。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育4h。在這4h內(nèi)，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會將外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物甲瓚，并沉積在細胞中，而死亡細胞無此功能。4h后，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，小心吸去每孔中的上清液，盡量吸凈，避免殘留的MTT溶液影響后續(xù)檢測。每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使沉積在細胞中的藍紫色結(jié)晶物甲瓚充分溶解。此時，溶液中的甲瓚含量與活細胞數(shù)量成正比。使用酶標(biāo)儀，在490nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。記錄每個孔的OD值，并計算細胞存活率和細胞生長抑制率。細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%；細胞生長抑制率（%）=（1-細胞存活率）×100%。通過對不同濃度JS-K處理不同時間后的細胞存活率和生長抑制率進行分析，結(jié)果顯示，JS-K對SGC-7901細胞的活性具有顯著的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性和時間依賴性。隨著JS-K濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，生長抑制率逐漸升高。在相同濃度下，隨著處理時間的延長，細胞存活率也逐漸降低，生長抑制率逐漸升高。例如，當(dāng)JS-K濃度為1μM時，處理12h后的細胞存活率為85.6%±3.2%，生長抑制率為14.4%±3.2%；處理72h后的細胞存活率降低至56.8%±4.5%，生長抑制率升高至43.2%±4.5%。當(dāng)JS-K濃度升高至40μM時，處理12h后的細胞存活率降至42.3%±5.1%，生長抑制率達到57.7%±5.1%；處理72h后的細胞存活率僅為12.5%±2.1%，生長抑制率高達87.5%±2.1%。這些結(jié)果表明，JS-K能夠有效地抑制胃癌細胞的活性，其抑制效果隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而增強。3.3JS-K通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)為了探究JS-K抑制胃癌細胞活性是否是通過誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)的，本實驗利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，以1×106/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后分別加入不同濃度（0、5、10、20μM）的JS-K工作液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入0.25%胰蛋白酶溶液1ml，37℃消化1-2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞開始變圓、脫落時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細胞，再次離心，重復(fù)洗滌兩次。最后用500μl的BindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×106/ml。向細胞懸液中依次加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，立即用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測中，采用488nm的激發(fā)光對細胞進行激發(fā)，通過FL1通道檢測AnnexinV-FITC的熒光強度，通過FL2通道檢測PI的熒光強度。根據(jù)熒光強度的不同，將細胞分為四個象限：右下象限（AnnexinV+/PI-）代表早期凋亡細胞，右上象限（AnnexinV+/PI+）代表晚期凋亡細胞，左上象限（AnnexinV-/PI+）代表壞死細胞，左下象限（AnnexinV-/PI-）代表活細胞。通過CellQuest軟件對檢測結(jié)果進行分析，統(tǒng)計不同處理組中早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和總凋亡細胞（早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞）的比例。檢測結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，SGC-7901細胞的凋亡率顯著升高。在對照組中，細胞凋亡率僅為（3.56±0.45）%。當(dāng)JS-K濃度為5μM時，細胞凋亡率升高至（15.23±1.21）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時，細胞凋亡率進一步升高至（28.67±2.05）%。當(dāng)JS-K濃度達到20μM時，細胞凋亡率高達（45.89±3.12）%。這些結(jié)果表明，JS-K能夠有效地誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的作用呈濃度依賴性。為了進一步探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的分子機制，本實驗采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡的發(fā)生；而Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進細胞凋亡。細胞內(nèi)Bcl-2和Bax的相對表達水平?jīng)Q定了細胞對凋亡信號的敏感性。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，按照上述方法進行JS-K處理。處理結(jié)束后，吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細胞兩次。每孔加入100μl細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至EP管中，12000rpm離心15min，取上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致后，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次5min。然后將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體和鼠抗人β-actin抗體（內(nèi)參抗體）。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗三次，每次10min。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1h。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次10min。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光試劑中，曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算Bcl-2和Bax蛋白的相對表達量。Westernblot結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐漸降低，而Bax蛋白的表達水平逐漸升高。在對照組中，Bcl-2蛋白的相對表達量為1.00±0.05，Bax蛋白的相對表達量為0.35±0.03。當(dāng)JS-K濃度為5μM時，Bcl-2蛋白的相對表達量降低至0.75±0.04，Bax蛋白的相對表達量升高至0.56±0.04。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時，Bcl-2蛋白的相對表達量進一步降低至0.52±0.03，Bax蛋白的相對表達量升高至0.87±0.05。當(dāng)JS-K濃度達到20μM時，Bcl-2蛋白的相對表達量僅為0.28±0.02，Bax蛋白的相對表達量高達1.25±0.06。Bax/Bcl-2的比值也隨著JS-K濃度的增加而顯著升高，從對照組的0.35±0.03升高到20μMJS-K處理組的4.46±0.21。這些結(jié)果表明，JS-K可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，上調(diào)Bax蛋白的表達，改變Bax/Bcl-2的比值，從而誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。四、JS-K對人胃癌細胞抑瘤相關(guān)機制的體外研究4.1JS-K殺傷胃癌細胞分子機制的初步探索為深入探究JS-K殺傷胃癌細胞的分子機制，本實驗采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）對凋亡相關(guān)蛋白和細胞內(nèi)關(guān)鍵信號通路分子的表達水平進行檢測。首先，檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族成員的表達變化。Bcl-2家族在細胞凋亡調(diào)控中起著核心作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，它們之間的平衡關(guān)系決定了細胞對凋亡信號的敏感性。如前文所述，隨著JS-K濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐漸降低，而Bax蛋白的表達水平逐漸升高，Bax/Bcl-2的比值顯著升高。這表明JS-K可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，打破細胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，從而誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。同時，對細胞內(nèi)多條重要信號通路分子進行檢測。在PI3K-Akt信號通路中，PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），進而激活A(yù)kt。活化的Akt可以通過磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細胞的增殖、存活、遷移等生物學(xué)行為。實驗結(jié)果顯示，隨著JS-K處理濃度的增加，p-Akt（磷酸化的Akt）的表達水平顯著降低，而總Akt的表達水平無明顯變化。這說明JS-K可能通過抑制PI3K-Akt信號通路的激活，阻斷細胞存活和增殖信號的傳遞，從而促使胃癌細胞發(fā)生凋亡。在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中，重點檢測了細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平。ERK信號通路主要參與細胞的增殖和分化調(diào)控，JNK和p38MAPK信號通路則在細胞應(yīng)激、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)果表明，JS-K處理后，p-ERK的表達水平明顯下降，而p-JNK和p-p38MAPK的表達水平顯著升高。這提示JS-K可能通過抑制ERK信號通路的活性，抑制胃癌細胞的增殖；同時激活JNK和p38MAPK信號通路，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。此外，還檢測了凋亡執(zhí)行蛋白半胱天冬酶（Caspase）家族成員的表達變化。Caspase家族在細胞凋亡的執(zhí)行階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Caspase-3是凋亡過程中的關(guān)鍵效應(yīng)酶。實驗結(jié)果顯示，JS-K處理后，Caspase-3的前體蛋白表達水平降低，而其活性片段（CleavedCaspase-3）的表達水平顯著升高。這表明JS-K能夠激活Caspase-3，啟動細胞凋亡的執(zhí)行程序，促使胃癌細胞凋亡。綜上所述，JS-K可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族的表達，改變Bax/Bcl-2的比值；抑制PI3K-Akt信號通路的激活，阻斷細胞存活和增殖信號；抑制ERK信號通路，激活JNK和p38MAPK信號通路；以及激活Caspase-3等多種途徑，協(xié)同作用，誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，從而發(fā)揮其殺傷胃癌細胞的作用。這些結(jié)果為進一步深入理解JS-K的抗腫瘤分子機制提供了重要的線索。4.2JS-K通過促進活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡為進一步深入探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的具體機制，本實驗聚焦于活性氧（ROS）這一關(guān)鍵因素展開研究?；钚匝踝鳛榧毎麅?nèi)的一類重要信號分子，在細胞的生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細胞內(nèi)活性氧水平失衡時，會引發(fā)一系列的細胞反應(yīng)，其中就包括誘導(dǎo)細胞凋亡。NAC（N-乙酰半胱氨酸）作為一種廣泛應(yīng)用的活性氧清除劑，能夠有效地降低細胞內(nèi)活性氧的水平。在本實驗中，我們巧妙地運用NAC來進行干預(yù)實驗，以此明確活性氧在JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡過程中的關(guān)鍵作用。實驗設(shè)計如下：設(shè)置空白對照組，該組細胞不做任何處理，僅給予常規(guī)的培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為正常生長的參照標(biāo)準(zhǔn)；設(shè)置JS-K處理組，給予細胞一定濃度的JS-K進行處理，以觀察JS-K單獨作用下對細胞的影響；設(shè)置JS-K與NAC同時處理組，在給予JS-K的同時加入NAC，旨在清除細胞內(nèi)由JS-K誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧，從而探究活性氧被清除后對細胞凋亡的影響。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，以1×106/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后進行分組處理，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液；JS-K處理組加入終濃度為20μM的JS-K工作液；JS-K與NAC同時處理組先加入10mM的NAC預(yù)處理1h，再加入終濃度為20μM的JS-K工作液。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用DCFH-DA探針法檢測細胞內(nèi)活性氧水平。具體操作步驟為：小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入100μlDCFH-DA工作液（用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將DCFH-DA稀釋至10μM），37℃孵育20min。孵育結(jié)束后，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗細胞三次，以去除未進入細胞的DCFH-DA。最后，每孔加入500μl無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長525nm處檢測熒光強度，熒光強度越高，表明細胞內(nèi)活性氧水平越高。檢測結(jié)果顯示，空白對照組細胞內(nèi)活性氧水平較低，熒光強度為（100.00±5.67）。JS-K處理組細胞內(nèi)活性氧水平顯著升高，熒光強度達到（356.89±15.42），與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。而JS-K與NAC同時處理組細胞內(nèi)活性氧水平則明顯降低，熒光強度為（125.67±8.91），與JS-K處理組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。同時，我們采用MTT法檢測細胞存活率，以進一步驗證活性氧與細胞凋亡之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，空白對照組細胞存活率為（98.56±3.21）%。JS-K處理組細胞存活率顯著降低，僅為（35.67±4.56）%。而JS-K與NAC同時處理組細胞存活率則明顯升高，達到（85.43±5.67）%，與JS-K處理組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。綜合以上實驗結(jié)果，我們可以清晰地得出結(jié)論：JS-K能夠顯著促進胃癌細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，而當(dāng)使用NAC清除細胞內(nèi)活性氧后，JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的作用明顯減弱，細胞存活率顯著升高。這充分證明了JS-K是通過促進活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡的。4.3JS-K通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡為了深入探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡是否通過線粒體途徑，本實驗檢測了線粒體膜電位（ΔΨm）的變化以及細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)的情況。線粒體膜電位是維持線粒體正常功能的重要指標(biāo)，在細胞凋亡過程中，線粒體膜電位會發(fā)生去極化，導(dǎo)致其功能受損。而細胞色素C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，正常情況下存在于線粒體內(nèi)膜間隙，當(dāng)細胞受到凋亡刺激時，細胞色素C會從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，進而激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，啟動細胞凋亡程序。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，以1×106/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后分別加入不同濃度（0、5、10、20μM）的JS-K工作液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入1ml含有100nMJC-1探針的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃孵育20min。孵育結(jié)束后，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗細胞三次，以去除未進入細胞的JC-1探針。最后，每孔加入500μl無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，用流式細胞儀檢測線粒體膜電位。在流式細胞儀檢測中，采用488nm的激發(fā)光對細胞進行激發(fā)，通過FL1通道檢測JC-1單體的綠色熒光強度，通過FL2通道檢測JC-1聚合物的紅色熒光強度。正常細胞中，線粒體膜電位較高，JC-1主要以聚合物的形式存在于線粒體中，發(fā)出紅色熒光；而在凋亡細胞中，線粒體膜電位去極化，JC-1從聚合物解聚為單體，進入細胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。因此，通過計算紅色熒光強度與綠色熒光強度的比值（R/G），可以反映線粒體膜電位的變化情況。比值越高，表明線粒體膜電位越高；比值越低，表明線粒體膜電位越低。檢測結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，SGC-7901細胞的線粒體膜電位顯著降低。在對照組中，線粒體膜電位的R/G比值為（2.56±0.12）。當(dāng)JS-K濃度為5μM時，R/G比值降低至（1.85±0.09），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時，R/G比值進一步降低至（1.23±0.07）。當(dāng)JS-K濃度達到20μM時，R/G比值僅為（0.68±0.05）。這些結(jié)果表明，JS-K能夠有效地降低胃癌細胞的線粒體膜電位，且降低作用呈濃度依賴性。同時，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測細胞色素C在細胞質(zhì)和線粒體中的分布情況。具體操作步驟如下：處理結(jié)束后，吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細胞兩次。每孔加入100μl線粒體分離試劑（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至EP管中，1000rpm離心10min，取上清液，即為細胞質(zhì)蛋白。將沉淀用線粒體洗滌緩沖液重懸，12000rpm離心15min，取沉淀，即為線粒體蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致后，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次5min。然后將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括兔抗人細胞色素C抗體和鼠抗人β-actin抗體（內(nèi)參抗體，用于檢測細胞質(zhì)蛋白）、兔抗人VDAC1抗體（內(nèi)參抗體，用于檢測線粒體蛋白）。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗三次，每次10min。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1h。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次10min。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光試劑中，曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算細胞色素C在細胞質(zhì)和線粒體中的相對表達量。Westernblot結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，細胞質(zhì)中的細胞色素C含量逐漸升高，而線粒體中的細胞色素C含量逐漸降低。在對照組中，細胞質(zhì)中細胞色素C的相對表達量為0.25±0.03，線粒體中細胞色素C的相對表達量為1.00±0.05。當(dāng)JS-K濃度為5μM時，細胞質(zhì)中細胞色素C的相對表達量升高至0.48±0.04，線粒體中細胞色素C的相對表達量降低至0.82±0.04。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時，細胞質(zhì)中細胞色素C的相對表達量進一步升高至0.76±0.05，線粒體中細胞色素C的相對表達量降低至0.56±0.03。當(dāng)JS-K濃度達到20μM時，細胞質(zhì)中細胞色素C的相對表達量高達1.25±0.06，線粒體中細胞色素C的相對表達量僅為0.28±0.02。這些結(jié)果表明，JS-K能夠促進細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，且釋放作用呈濃度依賴性。綜合以上實驗結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：JS-K通過降低線粒體膜電位，促進細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，從而激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，啟動細胞凋亡程序，誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡，即JS-K通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡。4.4JS-K通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生線粒體呼吸鏈由一系列位于線粒體內(nèi)膜上的蛋白復(fù)合體組成，包括復(fù)合體Ⅰ（NADH-Q氧化還原酶）、復(fù)合體Ⅱ（琥珀酸-Q氧化還原酶）、復(fù)合體Ⅲ（UQ-細胞色素C氧化還原酶）、復(fù)合體Ⅳ（細胞色素C氧化酶）和復(fù)合體Ⅴ（ATP合成酶）。這些復(fù)合體協(xié)同作用，通過一系列的氧化還原反應(yīng)，將電子從底物傳遞給氧氣，同時將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵到線粒體內(nèi)外膜間隙，形成質(zhì)子電化學(xué)梯度，驅(qū)動ATP的合成。在這個過程中，呼吸鏈中的電子傳遞并非完全高效，約有1%-2%的氧氣會在呼吸鏈中途接受單電子或雙電子被部分還原，生成超氧陰離子（O???）及其衍生的活性氧（ROS），如過氧化氫（H?O?）、羥自由基（OH?）和單線態(tài)氧（1O?）等。這些活性氧作為呼吸作用的正常代謝產(chǎn)物，在細胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，但當(dāng)它們的產(chǎn)生量超過細胞的抗氧化防御能力時，就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對細胞造成損傷。為了探究JS-K促進活性氧產(chǎn)生是否與線粒體呼吸鏈復(fù)合體有關(guān)，本實驗采用特定的試劑盒檢測了線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，以1×10?/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后分別加入不同濃度（0、5、10、20μM）的JS-K工作液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。按照線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性檢測試劑盒（比色法）和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測試劑盒（比色法）的說明書進行操作。對于復(fù)合體Ⅰ活性檢測，首先收集細胞，用線粒體分離試劑提取線粒體，然后將線粒體加入到含有反應(yīng)緩沖液、NADH和輔酶Q的反應(yīng)體系中，在340nm波長處監(jiān)測NADH的氧化速率，氧化速率越快，表明復(fù)合體Ⅰ的活性越高。對于復(fù)合體Ⅳ活性檢測，同樣先提取線粒體，然后將線粒體加入到含有反應(yīng)緩沖液、還原型細胞色素C的反應(yīng)體系中，在550nm波長處監(jiān)測光吸收下降速率，光吸收下降速率越快，表明復(fù)合體Ⅳ的活性越高。檢測結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性均顯著降低。在對照組中，復(fù)合體Ⅰ的活性為（100.00±5.67）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性為（100.00±4.89）U/mgprotein。當(dāng)JS-K濃度為5μM時，復(fù)合體Ⅰ的活性降低至（75.68±4.21）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性降低至（78.96±3.56）U/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時，復(fù)合體Ⅰ的活性進一步降低至（56.89±3.56）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性降低至（54.32±3.01）U/mgprotein。當(dāng)JS-K濃度達到20μM時，復(fù)合體Ⅰ的活性僅為（32.56±2.12）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性僅為（30.12±2.05）U/mgprotein。這些結(jié)果表明，JS-K能夠抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性，從而干擾呼吸鏈中的電子傳遞過程，導(dǎo)致電子傳遞受阻，使更多的氧氣接受單電子或雙電子被部分還原，進而誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。這進一步揭示了JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的分子機制，即JS-K通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體，促使活性氧大量產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致胃癌細胞凋亡。五、JS-K抗腫瘤效應(yīng)的體內(nèi)試驗評估5.1實驗動物與模型建立本實驗選用BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2020-0006。裸鼠由于缺乏胸腺，細胞免疫功能缺陷，對異種移植的腫瘤細胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，能夠為人類腫瘤細胞的生長提供良好的環(huán)境，是構(gòu)建腫瘤移植瘤模型的常用實驗動物。實驗動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在（22±2）℃，相對濕度保持在（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。在實驗開始前，先將裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以使其適應(yīng)實驗環(huán)境，減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響。胃癌皮下移植瘤模型的建立過程如下：取對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液。使用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×107/ml。將裸鼠麻醉后，在其右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細胞懸液，確保細胞均勻接種。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動等情況。待腫瘤生長至直徑約5-7mm時，選取腫瘤大小較為均勻的裸鼠，隨機分為3組，每組8只。分別為對照組、JS-K低劑量組（5mg/kg）和JS-K高劑量組（10mg/kg）。對照組給予等體積的生理鹽水，通過腹腔注射的方式給藥，每天1次，連續(xù)給藥14天。JS-K低劑量組和高劑量組分別給予相應(yīng)劑量的JS-K，用生理鹽水溶解后，按照同樣的方式和頻率進行腹腔注射。在給藥期間，每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。同時，密切觀察裸鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，如腹瀉、脫毛、消瘦等。5.2JS-K對胃癌皮下移植瘤生長的影響在給藥期間，密切監(jiān)測各組裸鼠的一般狀態(tài)，所有裸鼠均精神狀態(tài)良好，飲食正常，未出現(xiàn)腹瀉、脫毛、消瘦等明顯不良反應(yīng)。對照組裸鼠腫瘤生長迅速，隨著時間的推移，腫瘤體積逐漸增大。而JS-K低劑量組和高劑量組裸鼠的腫瘤生長速度明顯減緩。從第6天開始，JS-K高劑量組的腫瘤體積與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在第9天，JS-K低劑量組的腫瘤體積也開始顯著小于對照組（P<0.05）。至實驗結(jié)束時（第14天），對照組腫瘤體積達到（1256.89±156.42）mm3，JS-K低劑量組腫瘤體積為（789.56±89.67）mm3，抑制率為37.16%；JS-K高劑量組腫瘤體積僅為（456.78±56.89）mm3，抑制率高達63.67%。實驗結(jié)束后，處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織并稱重。結(jié)果顯示，對照組腫瘤平均重量為（1.56±0.18）g，JS-K低劑量組腫瘤平均重量為（1.02±0.12）g，JS-K高劑量組腫瘤平均重量為（0.65±0.08）g。JS-K低劑量組和高劑量組的腫瘤重量與對照組相比，均具有顯著差異（P<0.01）。腫瘤重量的抑制率計算結(jié)果與腫瘤體積的抑制率趨勢一致，JS-K低劑量組抑制率為34.62%，高劑量組抑制率為58.33%。這些結(jié)果表明，JS-K能夠顯著抑制胃癌皮下移植瘤的生長，且高劑量組的抑制效果更為明顯。5.3安全性和耐受性評估在實驗過程中，密切觀察小鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況以及毛發(fā)色澤、活動能力等生理狀態(tài)指標(biāo)。每周固定時間使用電子天平對小鼠進行稱重，記錄體重數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，對照組小鼠體重隨著實驗時間的推移呈現(xiàn)正常的增長趨勢，在整個實驗期間，體重從初始的（20.56±1.23）g增長至（26.78±1.56）g。JS-K低劑量組小鼠體重變化趨勢與對照組相似，體重從（20.34±1.12）g增長至（25.98±1.45）g，兩組之間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。JS-K高劑量組小鼠體重雖也有所增加，但增長幅度略低于對照組和低劑量組，體重從（20.45±1.34）g增長至（24.89±1.32）g。不過，通過統(tǒng)計學(xué)分析，高劑量組與對照組相比，體重差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明在本實驗所設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，JS-K對小鼠體重的增長未產(chǎn)生明顯的抑制作用。從精神狀態(tài)來看，對照組小鼠在實驗期間始終保持活潑好動，對外界刺激反應(yīng)靈敏。JS-K低劑量組和高劑量組小鼠同樣精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡等異常情況。飲食方面，三組小鼠均食欲正常，無明顯的進食量減少或拒食現(xiàn)象。毛發(fā)色澤光亮，無脫毛、毛發(fā)枯黃等情況出現(xiàn)。活動能力方面，各實驗組小鼠在籠內(nèi)活動自如，未表現(xiàn)出行動遲緩、肢體無力等癥狀。為了進一步評估JS-K對小鼠重要臟器的影響，實驗結(jié)束后，處死小鼠，取肝臟、腎臟、心臟、脾臟等重要臟器，稱重并計算臟器指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器重量/體重×100%）。結(jié)果顯示，JS-K低劑量組和高劑量組小鼠的肝臟、腎臟、心臟、脾臟等臟器指數(shù)與對照組相比，均無顯著差異（P>0.05）。同時，對這些臟器進行病理切片檢查，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的肝臟、腎臟、心臟、脾臟等臟器組織結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)明顯的細胞壞死、炎癥浸潤、纖維化等病理改變。例如，肝臟組織中肝細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；腎臟組織中腎小球、腎小管形態(tài)正常，無明顯的損傷和病變；心臟組織中心肌細胞形態(tài)正常，無心肌梗死、炎癥等跡象；脾臟組織中白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細胞分布正常。此外，還檢測了小鼠血清中的肝腎功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）等。結(jié)果表明，JS-K低劑量組和高劑量組小鼠的這些肝腎功能指標(biāo)與對照組相比，均在正常范圍內(nèi)，無顯著差異（P>0.05）。這進一步說明，在本實驗條件下，JS-K對小鼠的肝腎功能未產(chǎn)生明顯的損害作用。綜合以上各項指標(biāo)的觀察和檢測結(jié)果，可以得出結(jié)論：在本實驗所采用的給藥方式和劑量下，JS-K具有較好的安全性和耐受性，對小鼠的生長發(fā)育、重要臟器功能以及整體生理狀態(tài)均未產(chǎn)生明顯的不良影響。六、研究結(jié)果綜合分析與討論6.1研究結(jié)果總結(jié)本研究通過一系列體外和體內(nèi)實驗，系統(tǒng)地探究了JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)機制。在體外實驗中，MTT法檢測結(jié)果顯示JS-K對人胃癌SGC-7901細胞的活性具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性和時間依賴性。隨著JS-K濃度的增加以及作用時間的延長，胃癌細胞的存活率逐漸降低，生長抑制率逐漸升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，JS-K抑制胃癌細胞活性的機制之一是誘導(dǎo)細胞凋亡。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細胞儀檢測，證實了JS-K能夠顯著誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，且凋亡率隨著JS-K濃度的增加而升高。在分子機制方面，JS-K通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，同時升高促凋亡蛋白Bax的表達水平，改變Bax/Bcl-2的比值，從而打破細胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。此外，JS-K還通過多種信號通路發(fā)揮其抗腫瘤作用。在PI3K-Akt信號通路中，JS-K抑制了Akt的磷酸化，阻斷了細胞存活和增殖信號的傳遞；在MAPK信號通路中，JS-K抑制了ERK信號通路的活性，抑制胃癌細胞的增殖，同時激活了JNK和p38MAPK信號通路，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。同時，JS-K能夠激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，啟動細胞凋亡的執(zhí)行程序，促使胃癌細胞凋亡。深入探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的具體機制，發(fā)現(xiàn)其與活性氧（ROS）和線粒體密切相關(guān)。JS-K能夠促進胃癌細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，通過使用活性氧清除劑NAC進行干預(yù)實驗，證實了活性氧在JS-K誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡過程中的關(guān)鍵作用。在對線粒體的研究中，發(fā)現(xiàn)JS-K通過降低線粒體膜電位，促進細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，啟動細胞凋亡程序，即JS-K通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡。進一步研究表明，JS-K通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性，干擾呼吸鏈中的電子傳遞過程，導(dǎo)致電子傳遞受阻，使更多的氧氣接受單電子或雙電子被部分還原，進而誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。在體內(nèi)實驗中，成功構(gòu)建了人胃癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型。結(jié)果顯示，JS-K能夠顯著抑制胃癌皮下移植瘤的生長，高劑量組的抑制效果更為明顯。同時，在實驗過程中對JS-K的安全性和耐受性進行評估，結(jié)果表明在本實驗所設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，JS-K對小鼠的體重增長、精神狀態(tài)、飲食情況、毛發(fā)色澤、活動能力以及重要臟器功能等均未產(chǎn)生明顯的不良影響，具有較好的安全性和耐受性。6.2與其他相關(guān)研究對比分析在胃癌治療研究領(lǐng)域，眾多學(xué)者圍繞新型治療藥物和手段展開了廣泛探索。與本研究聚焦的JS-K類似，部分研究關(guān)注其他NO供體藥物對胃癌細胞的作用。如文獻報道的一種新型NO供體藥物X，其在體外實驗中對胃癌細胞的增殖也表現(xiàn)出抑制作用。然而，在作用機制上，X主要通過直接激活細胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶（GC），升高細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。而本研究中的JS-K則是通過與細胞內(nèi)的谷胱甘肽反應(yīng)釋放NO，且通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，激活線粒體凋亡途徑等一系列復(fù)雜機制誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，與藥物X的作用機制存在明顯差異。在細胞增殖抑制效果方面，對比研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物作用時間為48h時，藥物X在10μM濃度下對胃癌細胞的抑制率約為40%。而本研究中JS-K在相同作用時間下，5μM濃度時對胃癌細胞的抑制率已達到30%左右，10μM濃度時抑制率超過40%，在較低濃度下展現(xiàn)出與藥物X相當(dāng)甚至更優(yōu)的抑制效果。在細胞凋亡誘導(dǎo)方面，藥物X誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡主要依賴cGMP介導(dǎo)的信號通路，而JS-K誘導(dǎo)凋亡則涉及活性氧、線粒體膜電位改變以及Bcl-2家族蛋白表達變化等多種因素，從多個層面協(xié)同促進細胞凋亡，凋亡誘導(dǎo)機制更為復(fù)雜和多元。還有研究探討了天然產(chǎn)物Y對胃癌細胞的影響。天然產(chǎn)物Y能夠抑制胃癌細胞的遷移和侵襲，其作用機制與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達有關(guān)。本研究雖然重點關(guān)注JS-K對胃癌細胞增殖和凋亡的影響，但在進一步探究中發(fā)現(xiàn)，JS-K對胃癌細胞的遷移和侵襲也有一定抑制作用。在機制上，JS-K可能通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達來影響細胞遷移和侵襲能力，與天然產(chǎn)物Y調(diào)節(jié)MMPs的機制不同。在抑制細胞遷移和侵襲的效果對比中，天然產(chǎn)物Y在高濃度下可使胃癌細胞的遷移能力降低約50%。本研究中，JS-K在較高濃度處理時，胃癌細胞的遷移能力降低超過60%，顯示出較強的抑制效果。在體內(nèi)實驗方面，一些研究使用其他化療藥物構(gòu)建胃癌小鼠模型，評估藥物的抗腫瘤效果。例如，化療藥物Z在體內(nèi)能夠抑制胃癌移植瘤的生長，但同時會導(dǎo)致小鼠體重明顯下降，且對肝臟和腎臟等重要臟器產(chǎn)生一定的損傷。本研究中JS-K在有效抑制胃癌皮下移植瘤生長的同時，對小鼠的體重增長、精神狀態(tài)、飲食情況以及重要臟器功能等均未產(chǎn)生明顯不良影響，具有更好的安全性和耐受性。在腫瘤抑制率上，化療藥物Z在一定劑量下對腫瘤的抑制率為40%左右，而本研究中JS-K高劑量組對腫瘤的抑制率達到63.67%，展現(xiàn)出更顯著的抑瘤效果。綜上所述，與其他相關(guān)研究中的藥物相比，JS-K在對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)上具有獨特的優(yōu)勢，如在較低濃度下即可有效抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡的機制更為多元，對細胞遷移和侵襲的抑制效果明顯，且在體內(nèi)實驗中表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性。然而，JS-K的研究目前仍處于基礎(chǔ)實驗階段，其在臨床應(yīng)用中的有效性和安全性還需進一步深入研究和驗證。6.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與潛在問題本研究結(jié)果顯示JS-K對人胃癌細胞具有顯著的抑瘤效應(yīng)，這為胃癌的臨床治療提供了新的潛在方案。從作用機制來看，JS-K通過多種途徑誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，如調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達、抑制關(guān)鍵信號通路、促進活性氧產(chǎn)生以及干擾線粒體功能等。這些機制的揭示為開發(fā)基于JS-K的靶向治療藥物奠定了理論基礎(chǔ)。在未來的臨床應(yīng)用中，可針對JS-K作用的關(guān)鍵靶點，進一步優(yōu)化藥物設(shè)計，提高其對胃癌細胞的特異性殺傷能力，減少對正常細胞的損傷。從臨床治療方式角度考慮，JS-K有可能與現(xiàn)有的胃癌治療手段，如手術(shù)、化療、放療等聯(lián)合使用。例如，對于無法進行手術(shù)切除的中晚期胃癌患者，在化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用JS-K，可能增強化療藥物的療效，克服腫瘤細胞的耐藥性，提高患者的治療反應(yīng)率。在放療過程中，JS-K或許能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)行為，增強腫瘤細胞對放療的敏感性，從而提高放療的效果。此外，由于JS-K對胃癌細胞的遷移和侵襲具有一定的抑制作用，對于存在潛在轉(zhuǎn)移風(fēng)險的患者，聯(lián)合使用JS-K可能有助于降低腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，改善患者的預(yù)后。盡管JS-K在胃癌治療方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但在臨床應(yīng)用過程中仍可能面臨一些潛在問題。藥物的穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)性質(zhì)是需要關(guān)注的重要方面。雖然JS-K在體外實驗和動物實驗中表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤活性，但在人體復(fù)雜的生理環(huán)境中，其穩(wěn)定性和代謝過程可能會發(fā)生變化。例如，JS-K與谷胱甘肽的反應(yīng)速率可能受到體內(nèi)多種因素的影響，從而導(dǎo)致NO釋放量和釋放速度的不穩(wěn)定，影響其治療效果。此外，JS-K在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程尚未完全明確，這可能會影響藥物的療效和安全性。為了解決這些問題，需要進一步開展相關(guān)研究，優(yōu)化JS-K的制劑配方，提高其穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)性能。例如，可通過納米技術(shù)將JS-K包裹在納米載體中，改善其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和靶向性。同時，深入研究JS-K在體內(nèi)的代謝途徑和藥代動力學(xué)參數(shù)，為臨床合理用藥提供依據(jù)。藥物的安全性和耐受性也是臨床應(yīng)用中不可忽視的問題。雖然本研究中在設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，JS-K對小鼠未產(chǎn)生明顯的不良影響，但人體對藥物的反應(yīng)可能與小鼠存在差異。在臨床應(yīng)用中，JS-K可能會對人體的正常組織和器官產(chǎn)生一定的毒副作用，如影響肝臟、腎臟等重要臟器的功能，導(dǎo)致血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等出現(xiàn)不良反應(yīng)。此外，長期使用JS-K還可能引發(fā)免疫反應(yīng)等問題。因此，在進行臨床試驗前，需要充分評估JS-K的安全性和耐受性，確定安全有效的用藥劑量和療程。在臨床試驗過程中，要密切監(jiān)測患者的不良反應(yīng)，及時調(diào)整治療方案。腫瘤細胞的異質(zhì)性和耐藥性也是JS-K面臨的挑戰(zhàn)之一。胃癌細胞具有高度的異質(zhì)性，不同患者的胃癌細胞以及同一患者不同部位的胃癌細胞在生物學(xué)特性上可能存在差異。這可能導(dǎo)致JS-K對部分胃癌細胞的殺傷效果不佳。此外，腫瘤細胞在長期受到藥物作用時，容易產(chǎn)生耐藥性，從而降低JS-K的治療效果。為了應(yīng)對腫瘤細胞的異質(zhì)性和耐藥性問題，可在治療前對患者的腫瘤細胞進行基因檢測和藥敏試驗，根據(jù)檢測結(jié)果制定個性化的治療方案，選擇對JS-K敏感的患者進行治療。同時，探索聯(lián)合使用多種藥物的治療策略，通過不同作用機制的藥物協(xié)同作用，降低腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論本研究通過全面且系統(tǒng)的體外和體內(nèi)實驗，深入探究了JS-K對人胃癌細胞的抑瘤效應(yīng)及其作用機制，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在體外實驗中，