生物技術(shù)概論

一、生物技術(shù)的定義

生物技術(shù)(biotechnology),有時也稱生物工程(bioengineering),是指人

們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，采用先進的工程技術(shù)

手段，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達

到某種目的。因此，生物技術(shù)是一門新興的、綜合性的學(xué)科。

先進的工程技術(shù)手段是指基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程和蛋白質(zhì)工程

等新技術(shù)。改造生物體是指獲得優(yōu)良品質(zhì)的動物、植物或微生物品系。生物原料

則指生物體的某一部分或生物生長過程所能利用的物質(zhì)，如淀粉、糖蜜、纖維素

等有機物，也包括一些無機化學(xué)品，甚至某些礦石。為人類生產(chǎn)出所需的產(chǎn)品包

括糧食、醫(yī)藥、食品、化工原料、能源、金屬等各種產(chǎn)品。達到某種目的則包括

疾病的預(yù)防、診斷與治療、環(huán)境污染的檢測和治理等。

二、生物技術(shù)的研究內(nèi)容

根據(jù)生物技術(shù)操作的對象及操作技術(shù)的不同，生物技術(shù)主要包括以下5項技術(shù)

(工程)。

(1)基因工程

基因工程(geneengineering)是應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)(DNA)分離

出來，在體外進行切割、拼接和重組。然后將重組了的DNA導(dǎo)入某種宿主細胞

或個體，從而改變它們的遺傳品性；有時還使新的遺傳信息(基因)在新的宿主

細胞或個體中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物(多肽或蛋白質(zhì))。這種創(chuàng)造新生物并

給予新生物以特殊功能的過程就稱為基因工程，也稱為DNA重組技術(shù)。

(2)細胞工程

細胞工程(cellengineering)是指以細胞為基本單位，在體外條件下進行培養(yǎng)、

繁殖，或人為地使細胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達到改良生

物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁育動、植物個體，或獲得某種

有用的物質(zhì)的過程。細胞工程應(yīng)包括動、植物細胞的體外培養(yǎng)技術(shù)、細胞融合技

術(shù)(也稱細胞雜交技術(shù))、細胞器移植技術(shù)等。

(3)發(fā)酵工程

發(fā)酵工程(fermentationengineering)是利用微生物生長速度快、生長條件簡

單以及代謝過程特殊等特點，在合適條件下通過現(xiàn)代化工程技術(shù)手段，由微生物

的某種特定功能生產(chǎn)出人類所需的產(chǎn)品稱為發(fā)酵工程，有時也稱微生物工程。

(4)酶工程

酶工程(enzymeengineering)是利用酶、細胞器或細胞所具有的特異催化功能，

或?qū)γ高M行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項

技術(shù)。它包括酶的固定化技術(shù)、細胞的固定化技

術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計等技術(shù)。

(5)蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)

晶學(xué)、計算機輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識，通過對基因的人工定

向改造等手段，從而達到對蛋白質(zhì)進行修飾、改造、拼接以產(chǎn)生能滿足人類需要

的新型蛋白質(zhì)。

一、改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、解決食品短缺

(1)提高農(nóng)作物產(chǎn)量及其品質(zhì)

1、培育抗逆的作物優(yōu)良品系

通過基因工程技術(shù)對生物進行基因轉(zhuǎn)移，使生物體獲得新的優(yōu)良品性，稱之為轉(zhuǎn)

基因技術(shù)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以培育出具有抗寒、抗旱、抗鹽、抗病蟲害等抗逆

特性及品質(zhì)優(yōu)良的作物新品系，如轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,

Bt)毒蛋白基因的抗蟲棉花。

2、植物種苗的工廠化生產(chǎn)

利用細胞工程技術(shù)對優(yōu)良品種進行大量的快速無性繁殖，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，即植

物微繁殖技術(shù)，又稱植物微繁殖技術(shù)。利用這種無性繁殖技術(shù)，可在短時間內(nèi)得

到遺傳穩(wěn)定的、大量的小苗(試管苗)，并可實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。利用植物微繁殖

技術(shù)還可培育出不帶病毒的脫毒苗。

植物的微繁殖技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于花卉、果樹、蔬菜、藥用植物和農(nóng)作物的快速

繁殖。

3、提高糧食品質(zhì)

生物技術(shù)除了可培育高產(chǎn)、抗逆、抗病蟲害的新品系外，還可培育品質(zhì)好、營養(yǎng)

價值高的作物新品系。例如，科學(xué)家將水仙花和玉米合成B-胡蘿卜素的基因?qū)?/p>

入水稻培育出高胡蘿卜素含量的水稻(GoldenRice,黃金稻)(圖1-1)o

圖1T黃金稻

a：普通水稻；b：轉(zhuǎn)水仙花B-胡蘿卜素合成基因水稻；c：轉(zhuǎn)玉米B-胡蘿卜素

合成基因水稻

4、生物固氮，減少化肥使用量

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)均以化學(xué)肥料，如尿素、硫酸鏤作為氮肥的主要來源?；实氖褂貌豢?/p>

避免地帶來了土地的板結(jié)，肥力的下降；化肥的生產(chǎn)又將導(dǎo)致環(huán)境的污染?？茖W(xué)

家們正努力將具有固氮能力的細菌的固氮基因轉(zhuǎn)移到作物根際周圍的微生物體

內(nèi)，希望由這些微生物進行生物固氮，減少化肥的使用量。

5、生物農(nóng)藥，生產(chǎn)綠色食品

近年來，人們越來越注意農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展及人與環(huán)境的協(xié)調(diào)，特別是由于

化學(xué)農(nóng)藥的毒性作用及篩選新農(nóng)藥的艱難，企業(yè)和研究人員開始把注意力轉(zhuǎn)向生

物農(nóng)藥的研究開發(fā)與使用。因其不污染環(huán)境，對人和動植物安全，不傷害天敵,

所以發(fā)展生物農(nóng)藥已成為保障人類健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要趨勢。

（2）發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)

1、動物的大量快速無性繁殖

1997年2月英國Roslin研究所的Wilmut等在《Nature》雜志上刊登了用綿羊

乳腺細胞培育出“多莉”（圖12）。證明動物體細胞也具有全能性，同樣有可

能進行動物的大量、快速無性繁殖。

圖1-2“多莉”及其代孕母親（蘇格蘭黑面綿羊）

二、培育動物的優(yōu)良品系

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將與動物優(yōu)良品質(zhì)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，使動物獲得新

的品質(zhì)。1983年美國學(xué)者將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈螳@得轉(zhuǎn)基因小鼠。除

了小鼠外，科學(xué)家們已成功地培育了轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因魚

等多種動物新品系。

2、提高生命質(zhì)量，延長人類壽命

（1）開發(fā)制造奇特而又貴重的新型藥品

1977年，美國首先采用大腸桿菌生產(chǎn)了人類第一個基因工程藥物一人生長激素

釋放抑制激素。利用基因工程生產(chǎn)的藥物，除了人生長激素釋放抑制激素外，還

有人胰島素、人生長激素、人干擾素等。

（2）疾病的預(yù)防和診斷

傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法對某些疫苗的生產(chǎn)和使用，存在著免疫效果不夠理想、被免

疫者有被感染的風(fēng)險等不足。利用基因工程生產(chǎn)重組疫苗可以達到安全、高效的

目的。如已經(jīng)上市或已進入臨床試驗的病毒性肝炎疫苗；腸道傳染病疫苗（包括

霍亂、痢疾等）等。

利用細胞工程技術(shù)可以生產(chǎn)單克隆抗體。單克隆抗體既可用于疾病治療，又可用

于疾病的診斷。利用基因工程技術(shù)還可生產(chǎn)診斷用的DNA試劑。

（3）基因治療

導(dǎo)入正常的基因來治療由于基因缺陷而引起的疾病，一直是人們長期以來追求的

目標。1990年，美國FDA批準了用ADA（腺甘脫氨酶基因）基因治療嚴重聯(lián)合型免

疫缺陷病，并取得了較滿意的結(jié)果。

三、解決能源危機、治理環(huán)境污染

（1）解決能源危機

生物能源將是最有希望的新能源之一，而其中又以乙醇最有希望成為新的替代能

源?？茖W(xué)家們希望找到一種可以利用大量的農(nóng)業(yè)廢棄物如雜草、木

屑、植物的秸桿等纖維素或木質(zhì)素類物質(zhì)或其他工業(yè)廢棄物作的微生物。通過微

生物發(fā)酵或固定化酶技術(shù)，將農(nóng)業(yè)或工業(yè)的廢棄物變成沼氣或氫氣。

（2）環(huán)境保護

傳統(tǒng)的化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)過程大多在高溫高壓下進行，是一個典型的耗能過程并帶來

環(huán)境的嚴重惡化。如果改用生物技術(shù)方法來生產(chǎn)，不僅可以節(jié)約能源還可以避免

環(huán)境污染。例如用化學(xué)方法生產(chǎn)農(nóng)藥，不僅耗能而且嚴重污染環(huán)境，如改用蘇云

金桿菌生產(chǎn)毒性蛋白，即可節(jié)約能源而且該蛋白質(zhì)對人體無毒。

四、制造工業(yè)原料、生產(chǎn)貴重金屬

（1）制造工業(yè)原料

利用微生物在生長過程中積累的代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)食品工業(yè)原料，種類繁多。概括

起來，主要有以下幾個大類：①氨基酸類，主要有谷氨酸（即味精）、賴氨酸、異

亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、級氨酸等；②酸味劑，主要有檸檬酸、乳酸、蘋果

酸、維生素C等；③甜味劑，主要有高果糖漿、天冬甜精、氯化砂糖。

發(fā)酵技術(shù)還可用來生產(chǎn)化學(xué)工業(yè)原料。主要有傳統(tǒng)的通用型化工原料如乙醇、丙

酮、丁醇等產(chǎn)品。

（2）生產(chǎn)貴重金屬一、基因工程的定義

在漫長的生物進化過程中，基因重組從來沒有停止過。在自然力量及人類干擾下,

通過基因重組、基因突變和基因轉(zhuǎn)移等途徑，生物界無止境地進化，，不斷使物

種趨向完善，出現(xiàn)了今天各具特性的繁多物種。有的能忍耐高溫，有的不怕嚴寒，

有的能適應(yīng)干旱的沙漠，有的可在高鹽度的海灘上或海水中生繁，有的能固定大

氣中的氮素…種種生物的特殊性狀成為今天定向改造生物、創(chuàng)造新物種的豐富遺

傳資源。但是沒有一種生物是完美無缺的，因此，有待科技工作者有目的地去進

一步改造。按照人們的愿望，進行嚴密的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，

有目的地改造生物特性，在較短的時間內(nèi)使現(xiàn)有物種的性能得到改善，創(chuàng)造出更

符合人們需要的新的生物類型，或者利用這種技術(shù)對人類疾病進行基因治療，這

就是基因工程。

基因工程最突出的優(yōu)點是打破常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限，可以使原核

生物與真核生物之間，動物與植物之間，甚至人與其他生物之間的遺傳信息進行

相互重組和轉(zhuǎn)移。

在冶金工業(yè)方面，面對數(shù)量龐大的廢渣礦、貧礦、尾礦、廢礦，采用一般的采礦

技術(shù)已無能為力，惟有利用細菌的浸礦技術(shù)才能對這類礦石進行提煉?？山岬?/p>

金屬包括金、銀、銅、鈾、鎰、銅、鋅、鉆、銀、鋼、錠等10多種貴重金屬和

稀有金屬。

1、基因工程研究的理論依據(jù)

(1)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)

地球上幾乎所有的生物，從細菌到高等動物和植物直至人類，它們的基因都是一

個具有遺傳信息的DNA片段。所有生物的DNA的組成和基本結(jié)構(gòu)都是一樣的。因

此，不同生物的基因(DNA片段)原則上是可以重組互換的。雖然有些病毒的基

因是RNA,但這些病毒的RNA仍可以通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA(comp1ementaryDNA,

互補DNA),并不影響不同基因之間的重組。

(2)基因是可以切割的

基因直線排列在DNA上。除少數(shù)基因重疊排列外，大多數(shù)基因彼此之間存在著間

隔序列。因此，作為DNA分子上一個特定核甘酸序列的基因，允許從DNA分子上

一個一個完整地切割下來。

(3)基因是可以轉(zhuǎn)移的

基因不僅是可以切割下來的，而且攜帶基因的DNA分子可以在不同生物之間轉(zhuǎn)移,

或者在生物體內(nèi)的染色體上遷移，甚至可以在不同染色體間跳躍，插入到靶DNA

分子中。由此表明，基因是可以轉(zhuǎn)移的，而且是可以重組的。轉(zhuǎn)移后的基因一般

仍有功能。

(4)多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系

普遍認為，一種多肽就有一個相對應(yīng)的基因。因此，基因的轉(zhuǎn)移或重組最終可以

根據(jù)其表達產(chǎn)物多肽的性質(zhì)來考察。

(5)遺傳密碼是通用的

所有生物從低等的病毒直至人類，蛋白質(zhì)合成都使用同一套遺傳密碼，只有少數(shù)

例外，也就是說遺傳密碼是通用的。重組的DNA分子不管導(dǎo)入什么樣的生物細胞

中，只要具備轉(zhuǎn)錄翻譯的條件，其上面的遺傳密碼均能轉(zhuǎn)錄翻譯出相應(yīng)的氨基酸。

即使人工合成的DNA分子（基因），其上面的遺傳密碼同樣可以轉(zhuǎn)錄翻譯出相應(yīng)

的氨基酸。

（6）基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳給下一代

經(jīng)重組的基因在合適條件下是能傳代的，可以獲得相對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因生物。

3、基因工程操作的基本技術(shù)路線

基因工程是一項比較復(fù)雜的技術(shù)，如果拋開細節(jié)問題，基因工程操作的基本技術(shù)

路線如圖2T所示。

圖2T基因工程的基本技術(shù)路線

以上技術(shù)路線概括為4個步驟：①獲得目的基因；②構(gòu)建克隆載體；③目的基因

與克隆載體重組后導(dǎo)入受體細胞；③獲得克隆子；④對克隆子中目的基因進行檢

測和鑒定。

一、DNA的組成與結(jié)構(gòu)

（1）DNA的組成

DNA是一類由4種脫氧核甘酸按照一定的順序聚合而成的大分子。脫氧核甘酸分

子由脫氧核糖、磷酸和堿基組成。脫氧核糖的第一位碳原子（1'）上連接一個堿

基，第5位碳原子（5'）上連接一個磷酸基團，組成一個脫氧核甘酸。一個脫氧

核甘酸的脫氧核糖的5'磷酸基團和另一個脫氧核甘酸的脫氧核糖的3'羥基結(jié)合

形成磷酸二酯鍵，把兩個脫氧核甘酸連接在一起。多個脫氧核甘酸按此方式連接

成多聚脫氧核甘酸，其一端為游離的5'磷酸基團（5'-P）,稱為5'端，而另一

端為游離的3'羥基（3'-0H）,稱為3'端（圖2-1）。如果連接成的多聚脫氧核

甘酸是環(huán)狀的，則無游離的‘端和3'端。

圖2-1DNA的一段多聚脫氧核昔酸鏈

組成DNA的堿基有腺喋吟（A）、鳥喋吟（G）、胞喀咤（C）、胸腺暗咤（T）4

種，分別含有這4種堿基的脫氧核甘酸依次稱為腺口票嶺脫氧核甘酸、鳥口票嶺脫氧

核甘酸、胞喀陡脫氧核甘酸和胸腺喀咤脫氧核甘酸。多聚脫氧核甘酸鏈中，各種

脫氧核甘酸的脫氧和糖和磷酸的結(jié)構(gòu)和位置是一致的，

不同的只是堿基，因此多聚脫氧核甘酸鏈（DNA鏈）中的脫氧核甘酸可以用堿基

來表示。例如5'端開始依次由脫氧鳥甘酸、脫氧胞甘酸、脫氧胞甘酸、脫氧腺

甘酸、脫氧胸甘酸連接成的多聚脫氧核甘酸片段可用堿基5'-GCCAT-3'表示。

（2）DNA的結(jié)構(gòu)

DNA通常以雙鏈形式存在。兩條脫氧核甘酸鏈總是按堿基A與T、G與C互補配

對，通過氫鍵形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為雙鏈DNA（圖2-2）。絕大部分生物細

胞中的DNA都是雙鏈，只有少數(shù)病毒（噬菌體）中的DNA以單鏈形式存在。

圖2-2DNA雙鏈示意圖

二、DNA的功能

（1）DNA分子能在細胞內(nèi)復(fù)制

DNA的功能之一是在細胞內(nèi)能夠進行半保留復(fù)制。復(fù)制后，新產(chǎn)生的雙鏈DNA分

子中含有一條舊鏈和一條新鏈，使DNA攜帶的信息可以精確傳遞。

（2）攜帶遺傳信息

DNA是生物界遺傳信息的主要攜帶者，DNA上的部分核甘酸序列決定著RNA的核

昔酸序列。通過轉(zhuǎn)錄，這些核甘酸序列分別指令轉(zhuǎn)錄出核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)

移RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA）。rRNA是核糖體的一部分；tRNA在蛋白質(zhì)合

成過程中轉(zhuǎn)運氨基酸；mRNA上的核甘酸序列編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，經(jīng)過翻

譯把遺傳信息進一步傳遞給蛋白質(zhì)（多肽）。

基因應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄啟動子的序列和轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列。在轉(zhuǎn)錄過程中，構(gòu)成啟動子的序

列不轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA序列，只有轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列才轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA序列。

一個基因或一個操縱子能否有效轉(zhuǎn)錄，首先取決于其上游是否存在有效的啟動子。

啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點。轉(zhuǎn)錄區(qū)從轉(zhuǎn)錄的起始位點開始，包括基

因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。

基因編碼區(qū)指轉(zhuǎn)錄mRNA上起始密碼AUG（少數(shù)為GUG）至終止密碼UAG（UAA、

UGA）的各種遺傳密碼的核甘酸序列。原核生物的轉(zhuǎn)錄區(qū)有的是由2個或2個以

上基因組成的操縱子。組成同一操縱子的所有基因共用一個啟動子，但是每個基

因的編碼區(qū)都含有起始密碼序列和終止子序列，兩個基因編碼區(qū)之間往往含有非

編碼的間隔序列。真核生物的轉(zhuǎn)錄區(qū)，一個啟動子只控制轉(zhuǎn)錄一個基因的編碼區(qū)，

但編碼區(qū)內(nèi)除了各種編碼序列以外，往往含有一個或幾個長度不同的非編碼間隔

序列區(qū)，稱為內(nèi)含子（intron）?被內(nèi)含子分隔的編碼序列，稱為外顯子（exon）。

在基因編碼區(qū)下游有一段使轉(zhuǎn)錄終止的核甘酸序列，稱為轉(zhuǎn)錄終止子

（terminator）□一個操縱子雖然由多個基因組成，但與啟動子一樣也只需要一

個終止子。

一、限制性核內(nèi)切酸酶和DNA片段化

（1）限制性核內(nèi)切酸酶

限制性內(nèi)切核酸酶（restrictionendo-endonuclease）能識別雙鏈DNA中特定核

甘酸序列，并在合適的反應(yīng)條件下使每條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生

具5'-磷酸基(-P)基和3'-羥基(-0H)的DNA片段的內(nèi)切脫氧核甘酸酶

(endo-deoxyribonuclease)0至今發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶有I型酶、II型酶和

m型酶?；蚬こ滩僮髦姓嬲杏玫氖莕型酶。如果沒有專門說明，通常所說的

限制性內(nèi)切酶就是II型酶。

(2)限制性核內(nèi)切酸酶的識別序列

限制性內(nèi)切核酸酶在雙鏈DNA分子上能識別的特定核甘酸序列

稱之識別序列。各種限制性內(nèi)切核酸酶都有相應(yīng)的識別序列。如，限制性內(nèi)切核

酸酶EcoRI的識別序列為GAATTC。

有一些限制性內(nèi)切核酸酶雖來源不同，但有相同的識別序列，這樣的限制性內(nèi)切

核酸酶稱為之同裂酶，如BamHI和BstI具有相同的識別序列GGATCCo

(3)限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點

DNA在限制性內(nèi)切核酸酶的作用下，使多聚核甘酸鏈上磷酸二脂鍵斷開的位置被

稱為酶切位點，用I表示。限制性內(nèi)切核酸酶在DNA上的酶切位點一般是在識別

序列內(nèi)部，如GIGATCC。

DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的末端因所用的酶不同而不同。兩條多聚

核甘酸鏈上磷酸二酯鍵端開的位置如果是交錯的，產(chǎn)生的DNA片段末端的一條鏈

多出1至幾個核甘酸，這樣的末端稱為粘性末端。DNA片段末端5'端比3'端

長的稱為5'粘性末端,3'端比5'端長的稱為3'粘性末端。如果兩條多聚核

甘酸鏈上磷酸二酯鍵斷裂后產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的,稱為平末端。不管是

粘性末端還是平末端,5'端一定是-P基團，3'端一定是0H基團。

有些限制性內(nèi)切核酸酶雖然識別序列不同，但酶切DNA分子產(chǎn)生的DNA片段具有

相同的粘性末端，這樣的一組限制性內(nèi)切核酸酶稱為同尾酶。

二、特異性DNA片段的PCR擴增

1983年體外擴增DNA片段的方法產(chǎn)生，即聚合酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreaction,PCR)o采用這種方法，在反應(yīng)系統(tǒng)中只要有一個待

擴增的DNA拷貝，在短時間內(nèi)就能擴增出大量拷貝數(shù)的待擴增DNA片段，可滿足

用于常規(guī)方法的DNA檢測和DNA重組。

(1)PCR基本原理

PCR是模仿細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程進行的，以DNA互補鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ),

通過靶DNA變性、引物與模板DNA(待擴增DNA)一側(cè)的互補序列復(fù)性、耐熱性DNA

聚合酶催化引物延伸等過程的多次循環(huán)，產(chǎn)生待擴增的特異性DNA片段。一般反

應(yīng)過程是:①反應(yīng)系統(tǒng)加熱至90-95C,雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA(變性)，

作為互補鏈聚合反應(yīng)的模板；②降溫至37-60℃,使兩種引物分別與模板DNA鏈

鏈的3'一側(cè)的互補序列雜交(復(fù)性或退火)；③升溫至70-75C,耐熱性DNA聚

合酶催化引物按5'-3'方向延伸合成模板DNA鏈的互補鏈(延伸)。重復(fù)以上

過程，經(jīng)過25-30次循環(huán)，就可以出現(xiàn)隨待擴增的特異性DNA片段(圖2-3)。

圖2-3PCR擴增特異性PCR片段過程

(2)耐熱性DNA聚合酶

耐熱性DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，使PCR擴增特異性DNA片段成為可能。由于這種酶在

靶DNA變性的高溫下仍保持活性，因此在PCR擴增特異性DNA片段的全過程中，

只需一次加入反應(yīng)系統(tǒng)中，不必在每次高溫變性處理后再添加酶。目前用于PCR

的耐熱性DNA聚合酶主要有：TaqDNA聚合、Pwo酶等。

(3)PCR引物

PCR引物是PCR過程中與模板DNA部分序列互補，并能引導(dǎo)模板DNA互補鏈合成

的一種脫氧核甘酸寡聚體，其3'端必須具有游離的-0H。引物按預(yù)先設(shè)計用化

學(xué)方法合成，其長短與PCR過程的特異性高低密切相關(guān)。一般來說，引物越長,

特異性越高。為擴增特異性高的DNA片段，一般設(shè)計的引物由20-30核甘酸組成。

三、DNA片段的化學(xué)合成

(1)合成引物

除上述的PCR引物外，常用的還有核昔酸序列測序引物及合城cDNA的引物等。

(2)合成DNA寡聚核甘酸連桿

寡聚核甘酸連桿(linker)是一種按預(yù)先設(shè)計，化學(xué)合成的寡核甘酸片段。寡聚核

甘酸連桿一般由8T2個核甘酸組成，以中線為軸兩側(cè)互補對稱。其上有一種或

幾種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，使連接了寡聚核甘酸連桿的DNA片段經(jīng)過這

些限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，可以產(chǎn)生一定的粘性末端，便于與具有相同粘性末

端的另一DNA片段連接。如果連桿的兩端已具有一種或兩種限制性內(nèi)切核酸酶酶

切產(chǎn)生的粘性末端，可直接使兩DNA片段連接,也稱為銜接頭或接頭(adaptor)。

(3)合成基因片段

根據(jù)某基因測定的核甘酸序列，或者根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推導(dǎo)的核甘酸序列，

可以用DNA自動合成議化學(xué)合成相應(yīng)的基因片段。

一、DNA連接酶

DNA連接酶(DNAligase)能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3'-0H與5,-P之

間形成磷酸二酯鍵(圖2-4)。DNA連接酶主要有大腸桿菌(E.coli)DNA連接

酶和T4噬菌體DNA連接酶。E.coliDNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補粘性

末端之間的鏈接；T4DNA連接酶既可以用于雙鏈DNA片段互補粘性末端之間的鏈

接，也可催化雙鏈DNA片段平末端之間的鏈接,但平末端之間鏈接的效率比較低。

圖2-4DNA連接反應(yīng)示意圖

二、DNA片段之間的鏈接

（1）互補粘性末端片段之間的鏈接

鏈接反應(yīng)一般可用E.coliDNA連接酶，也可以用T4DNA連接酶（圖2-5）。待連

接的兩個DNA片段如果是同一限制性內(nèi)切核酸酶酶切的，連接后仍保留原限制性

內(nèi)切核酸酶的識別序列。如果用兩種同尾酶酶切的，雖然產(chǎn)生相同的互補粘性末

端，可以進行有效的連接，但獲得的重組DNA分子往往缺少了原來用于酶切的那

兩種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。

圖2-5互補粘性末端片段之間的鏈接

（2）平末端DNA片段之間的鏈接

鏈接反應(yīng)需用T4DNA連接酶。只要兩個DNA片段是平齊的，不管是用限制性內(nèi)切

核酸酶酶切產(chǎn)生的，還是其他方法產(chǎn)生的，都可以進行連接（圖2-6）。如果在

兩種不同限制性內(nèi)切核酸酶酶切后產(chǎn)生的平齊末端DNA片段之間進行連接，連接

后的DNA分子失去了那兩種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。如果兩個DNA片段的

末端是用同一限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的，

連接后的DNA分子仍保留那種酶的識別序列，有的還出現(xiàn)另一種新的限制性內(nèi)切

酶的識別序列。

圖2-5平齊末端片段之間的鏈接

三、DNA片段修飾后的鏈接

待連接的兩個DNA片段經(jīng)過不同限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，產(chǎn)生的末端不是互補

的粘性末端，或者一個是粘性末端另一個是平末端。在這種情況下，鏈接之前必

須對兩個末端或一個末端進行修飾。修飾的方式主要是采用外切核酸酶將粘性末

端修飾成平末端；采用末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）將平末端修飾

成互補粘性末端；采用DNA聚合酶將粘性末端修飾成平末端。有時為了避免待連

接的兩個DNA片段自行連接成環(huán)形DNA,或自行連接成二聚體，可采用堿性磷酸

酶使其中一個DNA片段5'端-P修飾成-0H,即去磷酸化。

4、DNA片段加連桿或接頭后連接

如果要連接既不具互補粘性末端又不具平末端的兩種DNA片段，除了用修飾一種

或兩種DNA片段末端后進行連接的方法外，還可以采用人工合成連桿或接頭。先

將連桿連接到待連接的一種或兩種DNA片段末端，然后用合適的限制性內(nèi)切酶酶

切連桿，使待連接的兩種DNA片段具互補粘性末端，最后在DNA連接酶崔化下使

兩種DNA片段連接，產(chǎn)生重組DNA分子。若在DNA片段末端加的是接頭，不需利

用限制性內(nèi)切酶酶切。

一、克隆載體

在轉(zhuǎn)基因研究中，單獨一個包括啟動子、編碼區(qū)和終止子的基因，或者組成基因

的某個元件，一般不容易進入受體細胞，即使采用理化方法進入細胞后，也不容

易在受體內(nèi)穩(wěn)定維持。把能夠承載外源基因，并將其帶入受體細胞得以穩(wěn)定維持

的DNA分子稱為基因克隆載體(genecloningvector)。

作為基因克隆載體一般應(yīng)該具備以下條件:①在克隆載體合適的位置必須含有外

源DNA片段組入的多克隆位點(multiplecloningsite),對于某種克隆位點來

說，在載體上一般只有一個。②一般能在攜帶外源DNA(基因)進入受體細胞后，

或停留在細胞質(zhì)中進行自我復(fù)制；或整合到染色體DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA,

隨這些DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；或自成染色體同其他染色體一樣自行復(fù)制。③必

須含有供選擇轉(zhuǎn)化子的標記基因或報告基因。④必須是安全的，不含有對受體細

胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除選定的受體細胞以外的其他生物細胞，尤其

是人的細胞。

基因克隆載體示意圖

二、基因工程常用質(zhì)粒載體

質(zhì)粒(plasmid)是一種存在于宿主細胞中染色體外的裸露DNA分子，一個質(zhì)粒

就是一個DNA分子。質(zhì)粒含有復(fù)制起始位點，能在宿主細胞內(nèi)進行自主復(fù)制，但

不會像某些病毒那樣進行無限制的復(fù)制，導(dǎo)致宿主細胞的崩潰。每個質(zhì)粒在相應(yīng)

的宿主細胞內(nèi)保持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)，少數(shù)幾個，多者

上百。質(zhì)粒DNA分子小的不足2kb,大的可達lOOkb以上，多數(shù)10個kb左右。

(1)大腸桿菌質(zhì)粒載體

大腸桿菌質(zhì)粒載體是一類應(yīng)用廣泛的克隆載體，含有大腸桿菌源質(zhì)粒的復(fù)制起始

位點，能夠在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中進行復(fù)制。

1)pBR322質(zhì)粒載體

PBR322是一種典型的常用質(zhì)粒載體。pBR322由大腸桿菌源質(zhì)粒ColEl衍生的質(zhì)

粒pMBl為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，含有ColEl的復(fù)制起始位點(Col-ori)，能在大腸桿

菌細胞中進行高拷貝復(fù)制。含有選擇標記基因Ampr和Tetr°Ampr基因區(qū)的PstI

和PvuI的識別位點,Tetr基因區(qū)的ClaI、HindULBamHI和SalI等的識別

位點是常用的克隆位點。PBR322分子大小為4363bp,可以克隆10kb以下的外源

DNA片段。

質(zhì)粒載體PBR322

2）pUC18/19質(zhì)粒載體

PUC18/19質(zhì)粒載體具有pBR322的復(fù)制起始位點，含有選擇標記基因Ampr和

lacZ',并在lacZ'區(qū)組裝了多克隆位點（MCS）連桿，外源DNA片段插入MCS的任

一克隆位點后，導(dǎo)致lacZ'基因失活，可提供菌落藍/白選擇標

記，并且插入MCS的外源基因可以在lac啟動子調(diào)控下進行表達。pUC18與pUC19

的差別只是MCS連桿上的克隆位點以相反的方向排列。

PUC18/19質(zhì)粒載體

（2）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體

根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠

瘦瘤），因次稱此質(zhì)粒為此質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）。

根癌農(nóng)桿菌引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤

Ti質(zhì)粒是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，其大小為200kb,但是能進入植物細胞的只是

一小部分，約25kb,稱為T-DNA（transferDNA）?！篋NA左

右兩邊界（LB,RB）各有一個選擇標記基因25bp的正向重復(fù)序列（LTS和RTS）,對

T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是不可缺少的，并且己證實T-DNA只要保留兩端邊界序列，

即使中間的序列不同程度被任何一個外源DNA片段所替換，進入植物細胞后仍可

整合到植物基因組中。根據(jù)Ti質(zhì)粒的這個性質(zhì)，近年來構(gòu)建成含LB和RB的質(zhì)

粒載體，已被廣泛地用于植物的基因轉(zhuǎn)移。

Ti質(zhì)?？寺≥d體示意圖

（3）T克隆載體

很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3'端加上一

個突出的堿基A。T克隆載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的T端帶

有一個突出的T°T克隆載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進行正確的AT配對,

在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到T克隆載體中，形成含有目的片斷

的重組載體。

PBM19-T克隆載體示意圖

病毒主要由DNA（或RNA）和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。通過感染，

病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的DNA（或RNA）復(fù)制系統(tǒng)和蛋白質(zhì)合成系

統(tǒng)進行DNA（或RNA）的復(fù)制和外殼蛋白的合，實現(xiàn)病毒顆粒的增殖。

一、噬菌體載體

（1）X噬菌體載體

X噬菌體由DNA(入DNA)和外殼蛋白組成(圖a),對大腸桿菌具有很高的感染

能力。ADNA在噬菌體中以線狀雙鏈DNA分子存在，全長48502bp。其左右兩端

各有12個核甘酸組成的5'突出粘性末端(cohesiveend)(圖b),而且兩者核昔

酸序列互補，進入宿主細胞后，粘性末端連接成為環(huán)狀DNA分子，將此末端稱為

cos位點(cohesiveendsite)。入噬菌體能包裝入DNA原長75%T05%的DNA片段,

36.4-51kb,并且ADNA上約有20kb時區(qū)域?qū)θ耸删w的生長不是絕對需要的，

可以缺失或被外源DNA片段取代。

入噬菌體示意圖

構(gòu)建入噬菌體克隆載體的策略是:①用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切去入DNA上的

部分或全部非必需區(qū)，相應(yīng)保留這種酶的1個或2個識別序列和切割位點作為克

隆位點，并用點突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的這

種酶的識別序列失效，避免外源DNA片段插入必需區(qū)。②若有必要可在非必需區(qū)

組入選擇標記基因。③構(gòu)建的入DNA載體不應(yīng)小于36.4kb。由此構(gòu)建成X噬菌

體載體。

構(gòu)建X噬菌體載體的示意圖

(2)cosmid載體

由于X噬菌體載體本身必須大于36.4kb,限制了允許克隆的外源DNA片段。研

究發(fā)現(xiàn)只要保留XDNA兩端各不少于280bp的片段，并且該片段內(nèi)含有cos位點

及與包裝相關(guān)的核甘酸序列；當插入外DNA片段后總長大于36.4kb,小于51kb；

這樣的重組XDNA分子就能進行有效包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細胞。根據(jù)這一性質(zhì)構(gòu)建了

cosmid載體。cosmd載體是一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，由質(zhì)粒DNA和部分入DNA

組成。

cosmid載體示意圖

質(zhì)粒部分含有大腸桿菌源質(zhì)粒復(fù)制起始位點、克隆位點和選擇標記基因等基本構(gòu)

件，可以像質(zhì)粒載體一樣承載外源DNA片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細胞，并在其中

自行復(fù)制和增殖。入DNA部分允許重組ADNA分子進行有效包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細胞。

但是由于cosmid載體不具X噬菌體溶菌生長途徑，因此不產(chǎn)生子代噬菌體。

cosmid載體一般在10kb以下，能承載比較大(40kb左右)的外源DNA片段，被

廣泛地用于構(gòu)建基因組文庫。

二、植物病毒克隆載體

植物病毒種類繁多，已用于構(gòu)建植物載體的有雙鏈DNA病毒花椰菜花斑病毒

(CaMV),單鏈DNA病毒番茄金黃花葉病毒(TGMV)、非洲木木薯花葉病毒(ACMV)、

玉米線條病毒(MSV)、小麥矮縮病毒(WDV),以及大麥條紋花葉病毒(BSMV)、番茄

叢矮病毒(TBSV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草花葉病毒(TMV)等。

構(gòu)建植物病毒克隆載體的基本策略是對病毒DNA(包括RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA)進行加

工，消除其對植物的致病性，保留其通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染能迸入植物細胞的特性，使

其攜帶的目的基因能導(dǎo)入植物細胞。由于植物病毒克隆載體的應(yīng)用局限性比較大,

因此植物病毒載體應(yīng)用并不普遍。

利用CaMV感染植物后能啟動35SRNA轉(zhuǎn)錄的強啟動子，構(gòu)建含35S啟動子的高效

表達載體(圖2T6),能啟動目的基因在植物細胞中進行高效的表達。

35s啟動子示意圖

三、動物病毒克隆載體

由于動物轉(zhuǎn)基因不能應(yīng)用質(zhì)?？寺≥d體，因此動物病毒克隆載體在動物轉(zhuǎn)基因研

究中起著更重要的作用。目前，用于構(gòu)建克隆載體的動物病毒有痘苗病毒

(poxvirus),腺病毒(adenovirus),桿狀病毒(bacuovrus)>猿猴空泡病毒

(simianvacuolatingvirus)和反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)等。

一、人工染色體載體

質(zhì)粒載體、病毒(噬菌體)克隆載體各具優(yōu)點，但它們能承載的外源DNA片段大

小一般不超過50kbo顯然這些載體限制了對具有龐大和復(fù)雜功能的人和高等動

植物基因組的研究。因此，伴隨結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究的發(fā)展，以及

實施人類基因組計劃和動植物基因組計劃的需要，能承載大片段DNA的人工染色

體載體應(yīng)運而生，并且發(fā)展迅速。人工染色體是指能在宿主細胞中穩(wěn)定地復(fù)制并

準確傳遞給子細胞的人工構(gòu)建的染色體。由于人工染色體能承載lOOkb以上的

DNA大片段，因此又稱為大DNA片段克隆載體。目前已構(gòu)建的人工染色體從其結(jié)

構(gòu)來分可分為兩類，即線形的人工染色體和環(huán)形的人工染色體。

線形的人工染色體如同真核生物的染色體一樣，必須含有染色體的結(jié)構(gòu)元件端粒

(telomere)>著絲粒(centromere)和復(fù)制起始區(qū)(originofreplication)。端

粒對染色體DNA兩個末端起封口和保護作用。著絲粒負責(zé)染色體向子細胞的傳遞。

復(fù)制起始區(qū)的功能是負責(zé)啟動染色體的復(fù)制，使構(gòu)建的人工染色體能在宿主細胞

中穩(wěn)定地復(fù)制并準確傳遞給子細胞。屬于這一類的人工染色體有酵母菌人工染色

體(yeastartificialchromosome,YAC)、植物人工染色體(plantartificial

chromosome,PAC)、人類人工染色體(humanartificialchromosome,HAC)和

哺乳動物人工染色體(mammalartificialchromosome,MAC)等。

環(huán)形的人工染色體則不需要端粒和著絲粒，但必須含有合適的復(fù)制起始區(qū)，使構(gòu)

建的環(huán)形人工染色體能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定地復(fù)制，并在細胞分裂過程中分配到子

細胞中。屬于這一類的人工染色體有細菌人工染色體(bacterialartificial

chromosome,BAC)>源于噬菌體Pl的人工染色體(Plderivedartificial

chromosome,PAC)、雙元細菌人工染色體(binaryBAC,BbBAC)、可轉(zhuǎn)化人工

染色體(transformationcompetentartificialchromosome,TAC)。

不管是哪一類人工染色體，作為DNA片段克隆載體，還必須具備合適的克隆位點

和選擇標記基因等克隆載體必備的元件。

2、基因表達載體

作為基因表達載體，在構(gòu)建的載體中除了一般克隆載體必備的構(gòu)件外，在插入目

的基因的克隆位點上、下游，還應(yīng)有供目的基因轉(zhuǎn)錄mRNA必備的啟動子和終止

子，與目的基因在受體細胞內(nèi)的表達強弱密切相關(guān)。其中啟動子尤為重要，在構(gòu)

建表達載體時常用的啟動子有誘導(dǎo)啟動子和組織特異性啟動子，構(gòu)建的載體相應(yīng)

稱為誘導(dǎo)型表達載體和組織特異性表達載體。

（1）誘導(dǎo)型表達載體

誘導(dǎo)型表達載體指載體中的啟動子必須在特殊的誘導(dǎo)條件下才有轉(zhuǎn)錄活性或較

高轉(zhuǎn)錄活性的表達載體。外源基因處于這樣的啟動子下，必須在合適的誘導(dǎo)條件

下才能表達。采用這種表達載體獲得的轉(zhuǎn)基因生物便于人工控制，即使進入自然

環(huán)境中，由于不存在合適的誘導(dǎo)條件，不能表達外源基因產(chǎn)物，因此不易導(dǎo)致環(huán)

境污染和影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡?？梢哉J為這是一類較安全酌基因表達載體。并且

鑒于誘導(dǎo)表達載體能人為地控制基因時空的表達，將為基因治療的臨床應(yīng)用及基

礎(chǔ)研究提供良好的手段。目前用作誘導(dǎo)型的啟動子有二價金屬離子誘導(dǎo)啟動子、

紅光誘導(dǎo)啟動子、熱誘導(dǎo)啟動子和干旱誘導(dǎo)啟動子，等等。

（2）組織特異性表達載體

在較高等的真核生物中，有一類特殊的啟動子只有在一定的組織中才能調(diào)控其下

游的基因進行有效的表達。選用這樣的啟動子可以構(gòu)建一系列組織特異性表達載

體，為研究動植物發(fā)育和人類基因治療等提供有效的手段。目前，已構(gòu)建的組織

特異性表達載體有乳腺組織特異性表達載體、腫瘤細胞特異性表達載體、花藥特

異性表達載體和種子特異性表達載體。

在基因工程設(shè)計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預(yù)期表達

產(chǎn)物的基因稱為目的基因。目的基因一般是結(jié)構(gòu)基因，也就是能轉(zhuǎn)錄和翻譯出多

肽（蛋白質(zhì)）的基因。

一、目的基因的來源

目的基因主要來源于各種生物。真核生物染色體基因組，是獲得目的基因的主要

來源。原核生物的染色體基因組也是目的基因來源的候選者。線粒體基因組、葉

綠體基因組，以及質(zhì)?；蚪M和病毒（噬菌體）基因組也可從中獲得有特殊需要

的目的基因。此外，化學(xué)合成的DNA也是目的基因的來源之一。

二、分離目的基因的途徑

根據(jù)實驗需要，待分離的目的基因可能是一個基因編碼區(qū)，或者包含啟動子和終

止子的功能基因；可能是一個完整的操縱子或由幾個功能基因、幾個操縱子聚集

在一起的基因簇；也可能只是一個基因的編碼序列，甚至是啟動子或終止子等元

件。常采用的方法主要有酶切直接分離法、PCR擴增法、構(gòu)建基因組文庫或cDNA

文庫分離法、化學(xué)合成法等。

（1）利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切法直接分離月的基因

為了獲得己克隆在載體中的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制性內(nèi)切核酸

酶識別序列，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶酶切，一次就可獲得目的基因，如圖

2T7所示，用BamHI和EcoRI酶切此質(zhì)粒，就可獲得目的基因。

圖2T7用限制性內(nèi)切核酸酶法獲得目的基因示意圖

（2）利用PCR直接擴增目的基因

PCR擴增技術(shù)己廣泛地用于分離目的基因。如果知道目的基因的全序列或其兩側(cè)

序列，可以通過合成一對與模板DNA互補的引物，十分有效地擴增出含目的基因

的DNA片段（圖2-18）。

圖2T8PCR擴增目的基因示意圖

（3）通過構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫分離目的基因

1）基因組文庫

把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存在一個受體菌克隆子群體

中，這個群體即為這種生物的基因組文庫（圖2-19）。若這個群體中只儲存某種

生物基因組的部分遺傳信息，則稱為部分基因組文庫。

用于構(gòu)建基因組文庫的克隆載體有、噬菌體克隆載體、cosmid克隆載體、BAC

克隆載體、BIBAC克隆載體、PAC克隆載體和YAC克隆載體等。

圖2T9基因組文庫構(gòu)建意圖

2）cDNA文庫

某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體

重組,儲存在一種受體菌克隆子群體之中，這樣的群體稱為cDNA文庫（圖2-20）o

如果此群體中只儲存該基因組的部分cDNA,則稱為部分cDNA文庫。cDNA文庫的

一個克隆子包含一個基因的全部編碼序列，不含內(nèi)含子，也不含轉(zhuǎn)錄啟動子和終

止子的核甘酸序列。因此從cDNA文庫中獲得的目的基因在其兩側(cè)必須組裝上轉(zhuǎn)

錄啟動子和終止子等元件。用于構(gòu)建cDNA文庫的載體有質(zhì)粒載體和噬菌體克隆

載體。

圖2-20cDNA文庫構(gòu)建意義圖

3）從基因組文庫或cDNA文庫中獲得目的基因

構(gòu)建了某生物的基因組文庫或cDNA文庫，但是并不等于完成了目的基因的分離，

因為文庫中究竟哪一個克隆子含有需要的目的基因尚不得而知。因此必須用合適

的方法從文庫中篩選分離出含有目的基因的特定克隆子。

根據(jù)目的基因已知核甘酸序列進行篩選分離

這是分離目的基因最直接的方法，根據(jù)目的基因已知的核甘酸序列制備核酸探針,

對基因組文庫或cDNA文庫的一系列克隆子的DNA分子進行雜交，能雜交的克隆

子就含有目的基因（陽性克隆子）（圖2-21）。進一步對陽性克隆子重組DNA進

行測序，與已知基因的核甘酸序列進行比較和鑒定，

確定是否是待分離的目的基因。應(yīng)用這種方法可以比較方便地獲得目的基因，但

是獲得的基因一般不是新的基因。

圖2-21利用核酸雜交鑒定目的基因

根據(jù)目的基因特異性表達進行分離

有的基因只有在某生物的一定的生長發(fā)育階段或一定的器官中才能表達，這樣的

基因可用此方法獲得。例如，待分離的目的基因只有在植物的根中才能有效表達，

而在其他器官中（如植物的葉）不能表達，因此用根構(gòu)建的cDNA文庫中含有攜

帶目的基因cDNA的克隆子。根據(jù)這一性質(zhì)以根和

葉的總mRNA（或它們的cDNA）為探針,分別對根構(gòu)建的cDNA文庫進行雜交比較。

用根的總mRNA（或它們的cDNA）制備的探針對cDNA文庫進行雜交時，所有克隆

子都呈陽性反應(yīng)；而用葉的總mRNA（或它們的cDNA）制備的探針進行雜交時，

根cDNA文庫中的某些克隆子呈陰性反應(yīng)。最后比較2份雜交結(jié)果，便可以在根

cDNA文庫轉(zhuǎn)膜的大量菌落中挑選出含目的基因的菌落（圖2-22）。將這種分離

目的基因的方法稱為差別雜交篩選法，這種方法也可用于分離受生長因子調(diào)節(jié)的

基因及特殊處理誘導(dǎo)表達的基因。

圖2-22差別雜交篩選示意圖

細胞。無論是原核生物細胞還是真核生物細胞都可作為受體細胞，但不是所有的

細胞都可以作為受體細胞。選用受體細胞時應(yīng)考慮以下幾點：①便于外源DNA

分子的導(dǎo)入，并在其內(nèi)能穩(wěn)定維持。②便于克隆子（轉(zhuǎn)化子）的篩選。③遺傳性

穩(wěn)定，對遺傳密碼的應(yīng)用上沒有明顯對遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯偏倚性，適于外

源基因的高效表達、表達產(chǎn)物的分泌或積累；對于真核生物目的基因的高效表達，

還應(yīng)具有較好的翻譯后加工機制。④易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長，具有較高的生產(chǎn)

應(yīng)用價值和理論研究價值。⑤安全性高，不會對外界環(huán)境造成生物污染。

一、原核生物細胞

原核生物細胞是較為理想的受體細胞（圖2-5T）,其原因是：①大部分原核生

物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的導(dǎo)入。②沒有核膜，染色

體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，便于外源DNA與裸露的染色體DNA重組。③基因

組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外源基因

進行遺傳分析。④原核生物多數(shù)為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并

且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復(fù)實驗快。因此原核生物細胞普遍作為

受體細胞用來構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫，或者作為克隆載體的宿主菌，或者

用來建立生產(chǎn)某種目的基因產(chǎn)物的工程菌。但是，以原核生物細胞來表達真核生

物基因也存在一定的缺陷，很多未經(jīng)修飾的真核生物基因往往不能在原核生物細

胞內(nèi)表達出具有生物活性的功能蛋白。但是通過對真核生物基因進行適當?shù)男揎?

或者采用cDNA克隆等措施，原核生物細胞仍可用作表達真核生物基因的受體細

胞。至今被用作受體細胞的原核生物主要是大腸桿菌(Escherichiacoli)。此

外，乳酸菌(lacticacidbacterium)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、棒狀桿

菌(corynebacterium)和藍細菌(cyanobacterium)等也被用作受體細胞。

圖2-5-1原核生物細胞模式圖

二、真核生物細胞

真核生物細胞具備真核生物基因表達調(diào)控和表達產(chǎn)物加工的機制，因此作為受體

細胞表達真核生物基因優(yōu)于原核生物細胞。真菌、植物和動物的細胞都被用作基

因工程的受體細胞。

酵母菌屬于單細胞真菌，是外源真核生物基因理想的表達系統(tǒng)。酵母菌作為基因

工程受體細胞，除了真核生物細胞共有的特性外，還具有以下優(yōu)點：①基因結(jié)構(gòu)

相對比較簡單，對其基因表達調(diào)控機制研究得比較清楚，便于基因工程操作。②

培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。③外源基因表達產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)

基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。④不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細胞。

植物細胞作為基因工程受體細胞(圖2-5-2),除了真核生物細胞共有的特性外，

最突出的優(yōu)點就是其全能性，即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，比較容

易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的

植株。不足之處是植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組

DNA分子。但是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或用基因槍、電

激儀處理等方法，同樣可使外源DNA進入植物細胞?，F(xiàn)在用作基因工程受體的植

物有水稻、小麥、玉米、大豆、馬鈴薯、棉花、煙草和擬南芥等。

圖2-5-2植物細胞模式圖

動物細胞作為受體細胞(圖2-5-3)，同樣便于表達具有生物活性的外源真核生

物基因產(chǎn)物。不過早期由于對動物的體細胞全能性的研究不夠深入，因此多采用

生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞作為基因工程的受體細胞，獲得了一些轉(zhuǎn)基因動

物。近年來，由于對干細胞的深入研究和多種克隆動物的獲得，表明動物的體細

胞同樣可以用作轉(zhuǎn)基因的受體細胞。目前用作基因工程受體的動物有豬、羊、牛、

魚、鼠、猴等。

圖2-5-3動物細胞模式圖

目前用于重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞的方法很多，具體采用那一種方法，應(yīng)根據(jù)

選用的載體系統(tǒng)和受體細胞類型而定。

一、外源DNA轉(zhuǎn)化方法

通過生物學(xué)、物理學(xué)和化學(xué)等方法使外源裸露DNA分子引入受體細胞，并在受體

細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。如果引入受體細胞的

是經(jīng)包裝處理帶有外源DNA分子的病毒或噬菌體顆粒，此過程稱為轉(zhuǎn)染

(transfection)□下面介紹幾種比較常用的轉(zhuǎn)化方法。

(1)化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

用二價陽離子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)處理某些受體細胞.可以使其成為感受

態(tài)細胞，即處于能攝取外源DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。當外源DNA分子溶液同

感受態(tài)細胞混合時，DNA分子便可進入細胞，達到轉(zhuǎn)化的目的。

有的動物細胞能捕獲粘附在細胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。

根據(jù)這一特性，先將待轉(zhuǎn)化的外源DNA同CaC12混合制成CaC12-DNA溶液，在強

烈振蕩下緩慢加入緩沖液，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復(fù)合物，然后用吸管將沉淀

復(fù)合物加入到哺乳動物單層培養(yǎng)細胞的表面上，保溫幾小時后，可使外源DNA

進入細胞。

外源DNA與某些多聚物和二價陽離子混合，再與受體細胞或原生質(zhì)體混合，也可

使外源DNA進入細胞。常用的多聚物有聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨

酸等，尤以PEG應(yīng)用最廣，可用于原核生物細胞、動物細胞和植物原生質(zhì)體的基

因轉(zhuǎn)化。

(2)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法

含有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌與一些植物的細胞接觸后，Ti質(zhì)粒的一部分(T-DNA)

導(dǎo)入植物細胞，整合到植物基因組DNA,隨基因組DNA的復(fù)制而復(fù)制(圖2-5-4)0

根據(jù)這一特性構(gòu)建了一系列Ti質(zhì)粒載體，與含目的基因的DNA片段重組，導(dǎo)人

根癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體共墻

養(yǎng)法和懸浮細胞共培養(yǎng)法，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進入植物細胞。用根癌農(nóng)桿菌介

導(dǎo)法己獲得了一些轉(zhuǎn)基因植物，但是通過此方法轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因單子葉植物比較

困難。

圖2-5-4根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化

(3)微彈轟擊轉(zhuǎn)化法

微彈轟擊轉(zhuǎn)化法又稱基因槍轉(zhuǎn)化法，這是通過高速運行的金屬顆粒轟擊細胞，將

包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨金屬顆粒導(dǎo)入細胞的轉(zhuǎn)化方法（圖2-5-5）0

基因槍法簡單快速，可直接處理植物組織，接觸面積大，并有較高的轉(zhuǎn)化率。

圖2-5-5基因槍法轉(zhuǎn)移外源基因

（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)法

脂質(zhì)體（liposome）是由磷脂雙分子層組成的人工膜狀結(jié)構(gòu)，將DNA分子包在其

內(nèi)，通過脂質(zhì)體與與原生質(zhì)體的吞噬過程，將外源DNA導(dǎo)入受體細胞內(nèi)（圖

2-5-6）o此方法的優(yōu)點是在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可以避免細胞內(nèi)核酸酶的降解，因

此可直接轉(zhuǎn)化外源DNAo

圖2-5-6脂質(zhì)體介轉(zhuǎn)化

（5）花粉管通道轉(zhuǎn)化法

此方法只用于植物。植物授粉過程中，將外源DNA涂在柱頭上，使DNA沿花粉管

通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細胞壁的卵、合子及早期的

胚胎細胞。由于這一方法技術(shù)簡單，易于掌握，能避免體細胞變異等優(yōu)點，具有

一定的應(yīng)用前景。

圖2-5-7花粉管通道法導(dǎo)入外源基因

（6）精子介導(dǎo)法

此方法只用于動物，是指精子同外源DNA共浴后再給卵子受精，使外源DNA通過

受精過程進入受精卵并整合于受體的基因組中。近年來還采用了電穿孔、脂質(zhì)體

包埋等輔助手段，提高了精子介導(dǎo)法的可靠性和可行性。

二、病毒（噬菌體）顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法

用病毒（噬菌體）的DNA（或RT-DNA）構(gòu)建的克隆載體（或攜帶目的基因），在

體外包裝成病毒（噬菌體）顆粒后，感染受體細胞，使其攜帶的重組DNA進入受

體細胞，將此過程稱為病毒（噬菌體）顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）法。該方法主要

用于動物的轉(zhuǎn)基因，早期也用于植物的轉(zhuǎn)基因。

病毒（噬菌體）顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法主要是用經(jīng)包裝處理帶有目的基因的病毒（噬菌體）

顆粒直接感染受體細胞，使目的基因隨同病毒（噬菌體）DNA分子整合到受體細

胞染色體DNA上，這樣以后不必再包裝成病毒（噬菌體）顆粒。如果帶有目的基

因的病毒（噬菌體）是缺陷型的，則需同另一輔助病毒（噬菌體）一起感染受體

細胞，在受體細胞內(nèi)包裝成新的病毒（噬菌體）顆粒。但是，如果受體細胞的基

因組中早已整合有病毒（噬菌體）缺陷的DNA片段，則沒有必要用輔助病毒做混

合感染。

通常將攝取外源DNA分子并在其中穩(wěn)定維持的受體細胞稱為克隆子。重組DNA

分子在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過程中，一般僅有少數(shù)受體細胞成為轉(zhuǎn)化子。因此，必須采用

合適的方法從大量的受體細胞背景中篩選出期待的轉(zhuǎn)化子。

一、根據(jù)載體標記基因篩選轉(zhuǎn)化子

在構(gòu)建基因工程載體時，通常在載體DNA分子中組裝一種或兩種選擇標記基因，

在受體細胞內(nèi)表達后，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)性狀,作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。

一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的受體細胞接種在含適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在適

宜的生長條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)受體細胞生長的情況挑選出轉(zhuǎn)化子。

（1）根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應(yīng)的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子

這是篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子最常用的方法。相關(guān)的基因和選擇藥物見表2-1o

表2-1篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的部分抗生素抗性基因和相應(yīng)的選擇藥物

此外，有些抗生素抗性基因可用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子。攜帶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基

因（nptH）的轉(zhuǎn)化子抗新霉素、卡那霉素和慶大霉素等抗生素，成為篩選動植物

轉(zhuǎn)化子的選擇標記基因。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）賦予轉(zhuǎn)化子能抗潮霉素，

作為選擇標記基因主要用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)慎

重。氯霉素?；D(zhuǎn)移酶基因（cm）也被用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子的標記基因。

（2）根據(jù)載體除草劑抗性基因和相應(yīng)的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子

由于植物細胞對多數(shù)抗生素不敏感，因此常用抗除草劑的基因作為選擇標記基因

（圖2-5-8）。pat基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）,使轉(zhuǎn)化子對含有磷化麥黃酮

（PPT）成分的除草劑具有抗性。epsps基因表達產(chǎn)物是5-烯醇丙酮酸莽草酸-3磷

酸合成酶（EPSPS）突變體，使轉(zhuǎn)化子能抗草甘瞬。

圖2-5-8利用除草劑篩選轉(zhuǎn)基因水稻

（3）根據(jù)lacZ'基因互補顯色試劑篩選轉(zhuǎn)化子

此方法主要用于原核生物。lacZ'是B-半乳糖甘酶基因部分缺失的DNA片段，

含lacZ'的重組載體轉(zhuǎn)化lacZ'互補型菌株,可翻譯B-半乳糖甘酶,在含有X-gal

（5-澳-4-氯-3-口引噪-B-D-半乳糖甘）和IPTG（異丙基-B-D-硫代半乳糖甘）

的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化子成為藍色菌落（圖2-5-9）,而lacZ'互補型菌株本身為白

色菌落。當載體的lacZ'區(qū)插入外源基因后，再轉(zhuǎn)化lacZ'互補型菌株，由于不

能翻譯半乳糖甘酶，轉(zhuǎn)化子即使在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基上也只能長

成白色菌落。這樣可以區(qū)分含外源基因和不含外源基因的轉(zhuǎn)化子。

圖2-5-9利用lacZ'重組載體轉(zhuǎn)化藍白篩選

二、根據(jù)報道基因篩選轉(zhuǎn)化子

報道基因多數(shù)是酶的基因，或者組裝在載體中，或者作為外源DNA的一部分。由

于受體細胞內(nèi)報道基因的表達，出現(xiàn)新的遺傳性狀，以此識別被轉(zhuǎn)化的細胞與未

被轉(zhuǎn)化的細胞。作為報道基因，其表達產(chǎn)物應(yīng)是便于檢測和定量分析，并且靈敏

度很高。

（1）葡萄糖酸甘酶基因（gus）

gus基因表達產(chǎn)物B-葡萄糖酸甘酶（GUS）能夠催化4-甲基傘形花酮-B-D-葡萄

糖昔酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形花酮，以此篩選含gus基因的轉(zhuǎn)化子（圖

2-5-10）o由于植物細胞GUS本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。

尤其是gus基因的3'端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達，產(chǎn)

生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。

圖2-5-10轉(zhuǎn)gus基因棉花胚狀體

（2）螢火蟲熒光素酶基因（luc）

luc基因表達產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以與熒光素和ATP

底物發(fā)生反應(yīng)，形成與酶結(jié)合的腺甘酸熒光素?；瘡?fù)合物，經(jīng)過氧化脫竣作用后，

該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測定儀快速靈敏地檢

測出產(chǎn)生的熒光（圖2-5T1）,是目前作為研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報

道基因。

圖2-5-11轉(zhuǎn)熒光素酶基因煙草

（3）綠色熒光蛋白基因（gfp）

當綠色熒光蛋白暴露于395nm波長的燈光下，便會被激發(fā)出綠色熒光（圖2-5-12）。

此基因已廣泛地作為篩選動植物轉(zhuǎn)化子的報道基因。

圖2-5-12轉(zhuǎn)gfp基因小鼠

三、根據(jù)形成噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子

對于ADNA載體系統(tǒng)而言，外源DNA插入X噬菌體載體后，重組DNA分子大小

必須在野生型入DNA長度的752105%內(nèi)，才可以在體外包裝成具有感染活性的

噬菌體顆粒。構(gòu)建的入DNA載體本身的大小一般都小于野生型入DNA長度的75%,

不能在體外包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒。因此，外源DNA與入DNA載體重

組處理后，只有重組DNA分子才能體外包裝和轉(zhuǎn)染受體菌，在培養(yǎng)基上形成噬菌

斑，并且未轉(zhuǎn)染的受體菌繼續(xù)正常生長（圖2-5T3）。

圖2-5-13利用噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子

經(jīng)篩選獲得的轉(zhuǎn)化子常伴隨著一些假陽性細胞或個體，為了確定獲得的轉(zhuǎn)化子是

預(yù)期的轉(zhuǎn)化子，還需檢測轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子、目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA和翻

譯的多肽。一般將真正含有預(yù)期重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子稱為重組子。

一、根據(jù)重組DNA分子檢測結(jié)果來鑒定重組子

為鑒定轉(zhuǎn)化子是真正預(yù)期的轉(zhuǎn)化子，即重組子，首先必須檢測獲得的轉(zhuǎn)化子中是

否存在預(yù)期的重組DNA分子。檢測方法有如下5種。

（1）檢測重組DNA分子的大小和限制性內(nèi)切核酸酶酶切圖譜

根據(jù)插入外源DNA片段的載體與原載體DNA分子之間有大小之別。分別提取獲得

的不同轉(zhuǎn)化子的DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，由于載體DNA中插入了外源DNA片段，

其分子質(zhì)量大于原載體DNA分子，在瓊脂糖凝膠板上的DNA條帶中，若出現(xiàn)落后

的條帶，則表明原載體DNA分子中插入了外源DNA片段,是重組DNA分子的條帶。

在此基礎(chǔ)上，從初步鑒定為重組子的轉(zhuǎn)化子中提取DNA,用合適的限制性內(nèi)切核

酸酶酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得酶切圖譜，如果酶切片段的數(shù)量和大小同預(yù)

期的一致，則可進一步確定被檢測的轉(zhuǎn)化子是預(yù)期的重組子。

（2）PCR方法擴增外源DNA片段

由于在載體DNA分子中，外源DNA插入位點的兩側(cè)序列多數(shù)是已知的，可以設(shè)計

合成相應(yīng)的PCR引物，并且分別從獲得的不同轉(zhuǎn)化子提取DNA,以此作為模板進

行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（圖2-5T）,若出現(xiàn)特異性擴增DNA

帶，并且其DNA片段大小同預(yù)先插入的外源DNA-致，則可確定待鑒定的轉(zhuǎn)化子

是預(yù)期的重組子。

圖2-5T4PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

（3）采用DNA雜交法鑒定重組子

當兩個不同來源的單鏈DNA分子（DNA片段）的核甘酸序列互補時，在復(fù)性條件

下可以通過堿基互補配對成為雙鏈“雜種”