T-GRM 100-2024 深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物生產(chǎn)工藝規(guī)范

ICS13.020.01CCSD00/09GRMProductionProcessSpecificationsforExtracellularPolymericSubstancesofDarkIT/GRM100—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 3.1菌種選擇 3.2培養(yǎng)基的配制 3.3培養(yǎng)基優(yōu)化配制 3.4培養(yǎng)條件 3.5提取與純化 23.6凍干粉胞外聚合物制備方式 23.7液態(tài)胞外聚合物制備方式 23.8膠囊胞外聚合物的制備方式 23.9產(chǎn)品形式與儲存 24檢驗與質(zhì)量控制 24.1深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物產(chǎn)量 24.2深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物成分組成 24.3深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物外觀質(zhì)量測定 25安全與環(huán)保要求 36產(chǎn)品包裝、運輸標(biāo)識 36.1產(chǎn)品包裝 36.2運輸標(biāo)識要求 3附錄A（規(guī)范性）胞外聚合物官能團的測定 4A.1方法提要 4A.2儀器 4A.3分析步驟 4A.4結(jié)果計算 4A.5允許差 4T/GRM100—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本標(biāo)準(zhǔn)適用于深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物的生產(chǎn)過程，旨在規(guī)范生產(chǎn)工藝，確保產(chǎn)品質(zhì)量，滿足礦山生態(tài)修復(fù)、農(nóng)田土壤改良和環(huán)境治理工程等領(lǐng)域的實際需求。通過對培養(yǎng)條件、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質(zhì)量控制及安全管理的系統(tǒng)規(guī)范，為胞外聚合物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了技術(shù)指導(dǎo)。本文件由中關(guān)村綠色礦山產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟提出并歸口。本文件起草單位：西安科技大學(xué)西部礦山生態(tài)環(huán)境修復(fù)研究院、中國礦業(yè)大學(xué)（北京）礦山生態(tài)修復(fù)研究院、天山實驗室、北京合生元生態(tài)環(huán)境工程技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：畢銀麗、彭蘇萍、譚海、張士雙、解琳琳、趙靜、白雪蕊、武超、肖禮、張延旭、柯增鳴、王坤、全文智1T/GRM100—2024深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物生產(chǎn)工藝規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了由深色有隔內(nèi)生菌合成胞外聚合物的技術(shù)要求，包括菌種選擇、培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件、生產(chǎn)過程控制、產(chǎn)品收集與純化、質(zhì)量檢測、產(chǎn)品包裝標(biāo)識、運輸標(biāo)識等要求。本文件適用于以微生物為生產(chǎn)主體的胞外聚合物工業(yè)化生產(chǎn)工藝流程。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。HJ/T415-2008環(huán)保用微生物菌劑環(huán)境安全評價導(dǎo)則GB4789.2-2022食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定GB19489-2008實驗室生物安全通用要求GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB4789系列標(biāo)準(zhǔn)檢測產(chǎn)品微生物安全性3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1菌種選擇生產(chǎn)菌種為深色有隔內(nèi)生菌Alternariasp.17463，為安全、可控的微生物。在礦區(qū)生態(tài)修復(fù)領(lǐng)域已取得較好的生態(tài)修復(fù)效應(yīng)。該菌種經(jīng)過于中國西北內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林浩特市勝利露天礦土壤中分離、鑒定和篩選，并符合相關(guān)生物安全要求。3.2培養(yǎng)基的配制活化培養(yǎng)基主要成分包括：將土豆切成小塊放入鍋中，加水1000mL加熱至沸騰，維持20-30min，經(jīng)8層紗布過濾，保留上清。加入葡萄糖20g，瓊脂18g，121℃滅菌20min。種子培養(yǎng)基主要成分包括：蔗糖10g/L、麥芽提取物10g/L、磷酸氫二鉀2g/L、磷酸二氫鉀1g/L、硫酸鎂0.45g/L及維生素B10.02g/L，pH7.0，121℃滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分包括：蔗糖30g/L、麥芽提取物25g/L、磷酸氫二鉀2g/L、磷酸二氫鉀1g/L、硫酸鎂0.45g/L及維生素B10.02g/L，pH7.0，121℃滅菌20min。3.3培養(yǎng)基優(yōu)化配制葡萄糖替換為蔗糖，濃度從10g/L提高至30g/L，麥芽提取物濃度從10g/L提高至25g/L，硫酸鎂濃度從0.25g/L提高至0.45g/L，磷酸氫二鉀濃度從0.5g/L提高至2g/L，磷酸二氫鉀濃度從0.5g/L提高至1g/L，pH從6.0提高至7.0。該配比條件下，確保了深色有隔內(nèi)生菌的生物量和胞外聚合物的產(chǎn)量和質(zhì)量。3.4培養(yǎng)條件3.4.1活化培養(yǎng)條件取約5mm的菌餅于活化培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7-10天。確保菌餅底部為黑色，頂部菌絲為白色。菌株傳代次數(shù)應(yīng)控制在20代以內(nèi)。3.4.2種子培養(yǎng)條件2T/GRM100—2024取約5mm的菌餅接種于裝有200mL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，28℃,180r/min培養(yǎng)2天，使該菌株生長至對數(shù)生長期。3.4.3發(fā)酵培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子接種于裝有7L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，接種量為10%，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min（提高發(fā)酵液溶氧，便于菌體的快速增長），6h-120h攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為300r/min（降低轉(zhuǎn)速減少攪拌槳對菌體的損傷），罐體壓力為0.05MPa，共培養(yǎng)5天，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液較為粘稠，菌絲量較大，發(fā)酵液與菌絲較難分開?？刹捎梅峙l(fā)酵、流加發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵工藝，具體選擇視規(guī)模和生產(chǎn)需求而定。3.5提取與純化發(fā)酵液通過離心、沉淀（如酒精沉淀法）或膜分離技術(shù)進行粗提。進一步純化可采用超濾、柱層析等方法，根據(jù)應(yīng)用需求確定純化程度。3.6凍干粉胞外聚合物制備方式烘干法應(yīng)嚴格控制溫度。烘干法和凍干法兩種制備方法得到胞外聚合物結(jié)構(gòu)組成一致。3.6.1烘干法將提純后的胞外聚合物絮狀沉淀放置于烘箱中，45℃烘干至恒重，并通過破碎機破碎為粉末狀，便于溶解使用。3.6.2凍干法將提純后的胞外聚合物放置于冷凍干燥機中，冷凝器設(shè)置溫度為-80℃,真空度小于10Pa，脫水24h后使用破碎機破碎為粉末。3.7液態(tài)胞外聚合物制備方式將胞外聚合物溶于水后振蕩，使胞外聚合物完全溶于水中。制備濃度和體積可根據(jù)實際施用需求、方式和地點而定。3.8膠囊胞外聚合物的制備方式將烘干或凍干研磨后的胞外聚合物粉末使用膠囊機制成胞外聚合物膠囊，膠囊遇水可以降解，緩釋出胞外聚合物，每個膠囊胞外聚合物含量約0.2g，密封防潮吸水。3.9產(chǎn)品形式與儲存最終產(chǎn)品可為胞外聚合物凍干粉、膠囊或液態(tài)（溶于水儲存條件應(yīng)避免高溫、高濕等條件。推薦儲存溫度：液態(tài)胞外聚合物2–8°C，胞外聚合物凍干粉或膠囊產(chǎn)品可室溫保存，需配制干燥劑。避免胞外聚合物保存在45℃以上和0℃以下，空氣濕度超過40%的條件中。4檢驗與質(zhì)量控制4.1深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物產(chǎn)量采用干重法計量。4.2深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物成分組成功能基團：采用紅外光譜分析，參照附錄A。4.3深色有隔內(nèi)生菌胞外聚合物外觀質(zhì)量測定采用目視檢測法和掃描電鏡觀測法執(zhí)行。研磨后的胞外聚合物為粉末狀，掃描電鏡200倍下為絮狀結(jié)構(gòu)。3T/GRM100—20245安全與環(huán)保要求生產(chǎn)過程中應(yīng)嚴格設(shè)置尾氣處理裝置，使用1mol/L氫氧化鈉收集尾氣，確保符合環(huán)境保護相關(guān)法規(guī)要求。6產(chǎn)品包裝、運輸標(biāo)識6.1產(chǎn)品包裝6.1.1粉劑和膠囊產(chǎn)品粉劑產(chǎn)品使用清潔的50mL閉口離心管包裝，每管產(chǎn)品的凈重30g，離心管內(nèi)添加干燥劑。膠囊產(chǎn)品使用密閉溶劑包裝，容器內(nèi)需配制干燥劑，周圍溫度切勿超過45℃。6.1.2液態(tài)胞外聚合物產(chǎn)品胞外聚合物液體應(yīng)盛裝于密封性能良好的耐壓容器中（如塑料桶、玻璃瓶或?qū)Ｓ盟芰洗⒂蟹罎B漏措施。容器外層應(yīng)使用防護包裝（如泡沫箱或瓦楞紙箱），以防止運輸過程中容器損壞或泄漏。周圍溫度切勿超過45℃。6.2運輸標(biāo)識要求產(chǎn)品應(yīng)避免雨淋、受潮、曝曬以及與有毒、有害或易污染的物品混裝運輸。包裝上應(yīng)清晰標(biāo)注“防潮”、“防曬”等警示標(biāo)志以及產(chǎn)品名稱、批次號、凈重、儲存條件等信息。4T/GRM100—2024（規(guī)范性）胞外聚合物官能團的測定A.1方法