T-CVMA 205-2024 犬呼吸道癥候群六種病原熒光RAA檢測方法

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I本文件主要起草人：金霞、林淦、孫靜、邵春艷、吳芹、曾歡、付玉和、劉怡煒、唐1犬呼吸道癥候群六種病原熒光RAA檢測方法本文件描述了犬呼吸道癥候群六種病原熒光RAA本文件適用于犬呼吸道癥候群（犬瘟熱病毒、犬流感病毒H3N2型、犬副流感病毒、犬支原體、支NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范4縮略語DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）MMLV：莫洛尼氏鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒（moloneymurineRNA：核糖核酸（ribonucleicaRAA：重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴增（recombinase-aidamplificaRT-RAA：反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)鏈替換擴增（2）：Na2EDTA。）：），）：3樣品的采集、保存與運輸按照NY/T5用無菌拭子輕輕擦拭眼分泌物后，置于1mL的PBS緩沖液樣品保存管，4℃保存?zhèn)溆谩⒑锌谇唬ū牵┦米踊蜓鄯置谖锸米訕悠繁４婀茉谛郎u震蕩儀上充分混勻，8.1.1在樣本制備區(qū)進行，核酸提取使用CTAB法提取，也可采用其他等效核4），9結(jié)果判斷與表述9.1質(zhì)量控制）；5如無報告T值（時間）或無熒光對數(shù)增長則判定被檢樣品陰性，表述6分別將裝甲RNA假病毒載體轉(zhuǎn)化至大腸桿瘟熱病毒、犬流感病毒H3N2型、犬副流感病毒熒光RT-RAA檢測的陽性對照母液。將陽性對照母液10A.2犬支原體、支氣管嗜血波氏桿菌、犬腺病毒陽性對照制備至DH5α感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒。提取重組質(zhì)粒進行PCR檢測和測序分析，結(jié)果正確的為陽性重組質(zhì)粒。利用超微量分光光度計測定陽性重組質(zhì)粒濃度，并將濃度換算成拷貝數(shù)（DNA拷貝/μL=[6.02×1023）），和犬腺病毒實時RAA熒光檢測的陽性對照母液。將陽性對照母液10倍系列稀釋之后，選取104拷貝/μL7引物/探針序列（5'→3'）NGCTTCCACAATGTAGTTATCTATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACT[FAM-dT][THF][BHQ犬流感病毒H3N2型熒光RT-RAA引物引物/探針序列（5'→3'）CAGCGATTTAAGTGATCCTCTCACTCATAGACTCAGGCACTCCAGTATCATTGGGATCTTGCACTTGATAT[FAM-dT][THF][BHQ1犬副流感病毒熒光RT-RAA引物探針序引物/探針序列（5'→3'）NGATCTACCTGACACACTAAACCATGCAACACC[FAM-dT][THF]引物/探針序列（5'→3'）AATTCTGTGTGAGGAATAATTGAACtufAGCAGGAGATAACGCTGGATTATTACTTTGGATTATTACTTCGTGGAGTTAACC8引物/探針序列（5'→3'）引物/探針序列（5'→3'）ACTCGAATACCAGGTCGCTGATCGCGGTTTCCAATTTGAAGAAA引物/探針序列（5'→3'）AACTCCGTCGATGCTGCCACAhexonAGGACGCCGCCGAATACTTGTCTCCCGCCC[FAM-dT][THF][BHQ1-d9C.1犬瘟熱病毒陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.PP498905.1）GTCGGGGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGAGACTTATCTTTGAGGCGATTCATGGTGGCACTCATCTTGGACATCAAACGATCCCGCCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTC.2犬流感病毒H3N2型陽性對照參考序列（GenBCAGCGATTTAAGTGATCCTCTCATTATTGCCGCAAGTATCATTGGGATCTTTTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGTATTTATCGTCACCTTAAATACGGTTTGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCTGAC.3犬副流感病毒陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.KU725681.TATGAGCCGTGGAGAGATCAATGCCTATGCTGCACTTGCAGAAGATCTACCTGACAAAACCATGCAACACCTTTCGTTGATTCCGAAGTCGAGGGAACTGCATGGGATGAGATTGAGACTTTCTTAGATATGTGTTACAGTGTCCTAATGCC.4犬支原體陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.LR215010.1）AATTCTGTGTGAGGAATAATTGAACCTGGTTTAGCTAAAACTTGTCCACGTTCAACATCACGGTTAACTCCACGAAGTAATAATCCAGCGTTATCC.5支氣管敗血波氏桿菌陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.LR134480.ACTCGAATACCAGGTCGCTGATCGCAGTGCGGGACAAGGCGGCGATCAACACGCCGAGATAGACATCGAGTGCGATCAACCACTGCAGGATCAATGACTCAGGCTCGAGACGAGCACGCCACCTGCATTTTCTTCAAAC.6犬腺病毒通用型陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.KP840549.1）AACTCCGTCGATGCTGCCACAATGGTCTTACATGCACATTGCTGGCCAGGACGCCGCCGAATACTTGTCTCCCGCCCTGGTTCAGTTTGCCCAAGCAACCAGTTCTTACTTTAAGTTGGACAACAAGTTCAGAAACCCCACTGTGGCCCCCACTCACGATGTAACCACTGAAAGGTC反應(yīng)體系RT-RAA熒光反應(yīng)單元（25μL凍干粉