醫(yī)學免疫學實驗指導- 青海大學醫(yī)學院

醫(yī)學免疫學實驗指導

（供醫(yī)學、藥學各專業(yè)使用）

青海大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室

2008年10月

AZ-、一

刖a

醫(yī)學免疫學是醫(yī)學院校必設的基礎課程之一，按教學大綱要求醫(yī)學免疫學的實驗課時

占總學時的1/3左右,說明該學科具有理論與實踐緊密結合的特點及實驗教學在學科中的重

要性。木課程設置要求學生不僅要掌握基礎理論、基本知識，而且要學習和掌握各項基本技

能。據(jù)此，我們編寫出《醫(yī)學免疫學實驗指導》一書，力求規(guī)范實驗教學，從整體提高教學

水平和教學質量。

本書結合教學工作實際，共編寫14個實驗項目，每個實驗說明實驗目的，實驗原理，

實驗內容方法，實驗要求及注意事項，并附有一定量的思考題。本書依教學進程安排實驗次

序，可幫助學生鞏固基礎理論知識，培養(yǎng)學生基本技能，提高教學效果。

免疫學和免疫學技術的發(fā)展日新月異，醫(yī)學教育的改革不斷向縱深發(fā)展，限于編者的

學術及認識水平，本書難免存在缺點和不足。為此，希望廣大師生對本書提出寶貴意見，以

便及時加以改進。

編者

2008年10月

2

目錄

實驗室規(guī)則...............................................................................4

實驗一顯微鏡的結構與使用.............................................................4

實驗二白細胞的吞噬及溶菌酶試驗.....................................................7

一、小吞噬試驗（中性粒細胞吞噬功能試驗）...............................................8

二、大吞噬試驗........................................................................8

三、溶菌酶測定........................................................................9

實驗三巨噬細胞（白細胞）移動抑制試驗..............................................9

實驗四硝基四氮哇藍（NBT）還原試驗.................................................11

實驗五凝集反應.......................................................................12

一、玻片凝集試驗....................................................................12

二、人類ABO血型鑒定試驗（玻片法）.................................................13

三、試管凝集反應....................................................................14

四、間接凝集試驗....................................................................15

五、間接乳膠凝集抑制試驗.............................................................16

實驗六沉淀反應.......................................................................17

一、瓊脂擴散試驗....................................................................18

二、免疫電泳........................................................................20

三、火箭免疫電泳....................................................................20

四、對流免疫電泳....................................................................22

實驗七補體的溶細胞作用.............................................................23

實驗八補體結合試驗..................................................................24

一、溶血素單位滴定..................................................................24

二、補體單位滴定...................................................................24

實驗九血清補體活性測定.............................................................27

實驗十淋巴細胞轉換試驗.............................................................29

實驗十一玫瑰花環(huán)形成試驗...........................................................31

實驗十二變態(tài)反應試驗................................................................32

、豚鼠過敏試驗....................................................................33

二、皮膚超敏反應....................................................................33

實驗十三免疫濁度試驗................................................................34

實驗十四循環(huán)免疫復合物的檢測......................................................35

實驗十五免疫標記技術................................................................37

一、酶聯(lián)免疫吸附試驗.................................................................37

二、酶免疫組化技術...................................................................38

三、酶標免疫定量測定.................................................................40

四、免疫熒光技術.....................................................................41

五、斑點金免疫滲濾試驗...............................................................43

六、斑點免疫層析試驗.................................................................44

3

實驗室規(guī)則

實驗是映證理論，對學生進行基本技能訓練和培養(yǎng)科學研究能力的手段，為

保證實驗效果，同時避免病原微生物的實驗室內傳染，保障實驗操作者的安全，特制

定如下規(guī)則：

一、學生在實驗課前，應認真預習所要進行實驗的內容，明確實驗目的，了解實驗原

理，熟悉所要使用的儀器、藥品的性質及操作程序，如有疑問，應事先請教指導教師。

二、盡量不帶個人生活、學習用品入實驗室，必須要帶的物品如書本、文具應放在遠

離實驗操作的指定位置。

三、進入實驗室應穿白大衣，離開時將白大衣脫下并反折疊帶走，在實驗室內應保持

安靜，遵守秩序，不得大聲喧嘩，隨便走動或拆卸儀器、搬弄標本。

四、實驗室內禁止吸煙、進食及飲水，嚴禁用嘴吸移液及濕潤標簽，盡量不要用手觸

摸頭面部及身體其他暴露部位。

五、如遇不慎而打破菌種管或使有菌材料污染皮膚、衣物、桌面等情況，應及時報告

指導教師，切勿隱瞞或自行處理。

六、實驗中所被污染過的器材、物品及其他盛過有菌物的容器、應用完后立即投入已

準備的消毒劑（如來蘇爾、氯胺液）中，不可隨意仍放。

七、注意觀察分析實驗結果，獨立思考解決實驗中所遇到的問題，要嚴格按操作程序

進行實驗。

八、要愛護公共財物，節(jié)約水電及試劑材料，不得將實驗物品私自帶出實驗室?如遇

儀器、用品損壞，應報告指導教師并按規(guī)定予以賠償。

九、實驗結束后，應清理實驗用品，實驗廢棄物（包括實驗動物尸體）應收入或倒入

指定的地方和容器內。每一同學均應服從衛(wèi)生值日安排，認真負責地做好清潔衛(wèi)生。

十、離開實驗室前，應用84消毒液將雙手浸泡5—10分鐘，然后用清水洗凈。最后離

開的同學應注意關水、關電、關窗、關門。如有借用的物品和儀器要及時歸還。

實驗一顯微鏡的結構與使用

【實驗目的】

1.熟悉光學顯微鏡的結構和成像原理。

2.掌握普通光鏡的使用方法，尤其是油鏡的正確使用。

3.了解暗視野、相差顯微鏡的原理和使用方法。

【實驗用品】

L器材：普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙。

4

2.標本：細菌革蘭染色玻片標本、普通變形桿菌24h內培養(yǎng)液、啤酒酵母新鮮培養(yǎng)的

活標本。

【內容和方法】

一、普通光學顯微鏡的結構和使用方法

微生物是肉眼看不見而必須借助于光學或電子顯微鏡將其放大數(shù)百乃至數(shù)萬倍才能觀

察到的微小生物，因此顯微鏡是認識和研究微生物最重要和最基本的工具之一。因此，掌握

其使用方法是進行微生物研究的基本技能。

1.普通光鏡的基本結構

普通光鏡無論其外觀形狀如何，它都由兩大部分組成，即機械裝置部分和光學系統(tǒng)部

分。機械部分包括鏡座、鏡臂、載物臺及臺上的標本推進器、鏡筒、物鏡轉換盤以及升降調

節(jié)器等，其主要作用是支撐、固定鏡頭、調節(jié)物象焦距、擱置和移動標本。光學系統(tǒng)包括反

光鏡、聚光器、物鏡和目鏡。它的作用是收集光源并聚集于標本上，然后通過透鏡放大成像

映與眼簾，是肉眼本不能分辨的物體得以清楚觀察（圖1-1）。

圖1-1光學顯微鏡的結構

光學系統(tǒng)是光學顯微鏡的核心部分，而物鏡又是其中最重要的部件。一般的光鏡配有

3-4個物鏡，有10倍的低倍鏡、40倍的高倍鏡和100倍的油浸鏡（有的配有一個4倍的物

鏡頭）。標本的放大主要靠物鏡。為了使用方便，常用紅、黃、藍、白的色圈分別標記物鏡

倍數(shù)。另外，在鏡頭上還刻有一些符號和數(shù)值，低倍鏡上刻有10/0.25、160,10指放大倍

數(shù)，0.25指鏡口率（N.A）,160表示鏡筒長度（mm）。高倍鏡刻有40/0.65和160/0.17,40

為放大倍數(shù)，0.65指鏡口率，160表示鏡筒長度，0.17則表示使用時所要求蓋玻片的厚度。

油鏡上刻有100/1.25和160/0.17,該數(shù)值也表示放大倍數(shù)、鏡口率、鏡筒長度、蓋玻片厚

5

度，除此之外，油鏡頭上還?？逃幸粋€“油”或“oil”字。

2.普通光鏡的使用方法

（1）對光和調焦：首先將顯微鏡平置于實驗臺上，轉動物鏡轉換器使低倍鏡與鏡筒垂

直到位（聽到“咔”聲即可），然后將反光鏡凹面對著光源翻動，側面觀察聚光器明亮或從

目鏡觀察視野明亮即說明對光完成。如果此時雖對光較好卻是也不夠明亮時，應檢查聚光器

的光圈是否打開，聚光器是否升至最高。

對好光后即將標本置于載物臺上的標本夾中（注意標本面向上），先用低倍鏡觀察。用

粗調節(jié)器調出物像后，再用細調節(jié)器調出清晰物像。在換高倍鏡觀察時，由于高倍鏡視野范

圍比低倍鏡小，故須先將觀察內容移至視野中央后再換之。有時顯微鏡存在偏心現(xiàn)象，此時

要記住其偏心的方向和距離。

（2）油鏡的原理、使用、保護

在免疫學中主要使用的是油鏡。油鏡是因為在使用時需用香柏油等作介質而得名。光

學顯微鏡的放大倍數(shù)與玻璃透鏡的大小有關。油鏡的透鏡小，鏡孔也小，觀察時由于聚光器

聚集的光源要通過載玻片、空氣，才能進入物鏡中。玻璃與空氣的折光率不同，會產(chǎn)生折射,

使一部分光線失掉，進入物鏡的光線減少，致使觀察視野暗淡，物像不清。如果使用折射率

與玻璃相近的油介質，即可減少折射，增加視野亮度，提高分辨率。如圖12所示。

加油前加油后

圖『2油鏡頭使用原理

使用油鏡時應先將集光器升至最高，光柵增至最大。轉開物鏡鏡頭，在玻片上加一滴

鏡油，再轉換油鏡頭。眼從側方看，調節(jié)粗調節(jié)器，使鏡頭浸入鏡油中，以輕輕接觸破片為

止（注意勿壓碎玻片）。眼看目鏡，調節(jié)粗調節(jié)器緩慢下降載物臺，看到物像，立即停止，改

用細調節(jié)器調出清晰物像。觀察結束后，應用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭油鏡頭，再用于擦鏡

紙擦去殘存二甲苯。下降集光器，豎起反光鏡，將物鏡鏡頭擺成“八”字型，對號送入鏡盒

內。

二、暗視野顯微鏡和相差顯微鏡簡介

6

觀察暗視野顯微鏡和相差顯微鏡實物或圖片。暗視野顯微鏡是將普通光學顯微鏡換裝

上特制的暗視野聚光器或者在普通光鏡聚光器上加一個中央遮光板改裝而成。使用暗視野聚

光器或光板，光線不能通過聚光器的中心部位透入物鏡；而只能從周邊斜射經(jīng)標本反射進入

物鏡，因此視野背景是暗的，標本成為亮點。使用暗視野顯微鏡可檢查不經(jīng)染色，在普通顯

微鏡下不易看清的活體微生物，如活的細菌、螺旋體等，它的缺點是不能觀察生物體的內部

結結構。

相差顯微鏡也稱相襯顯微鏡。相差顯微鏡具一個特殊的由環(huán)狀光圈和聚光鏡組合的轉

盤聚光鏡和一組特別的相差物鏡（內裝相位板），能使直射光和繞射光產(chǎn)生干涉，改變其光

相與振幅，形成明暗差，增強觀察物體的立體感，并使細胞的內部構造清晰，因而可觀察活

體微生物的形態(tài)及某些內部細微結構。

【注意事項】

1.取送顯微鏡時動作要輕，-只手托鏡座，一只手持鏡臂，防止反光鏡、目鏡、物鏡

等脫落損壞。

2.油鏡用后一定要擦洗，以防止油干影響其使用壽命。注意擦鏡時一定要用專用擦鏡

紙。

3.使用油鏡時，一定要等標本干后才能加香柏油。滴油時應避免氣泡形成。

【實驗報告與思考題】

1.為什么用油鏡要等標本片干后才能滴加香柏油？

2.油鏡有哪些標志？如何使用油鏡？

3.如果視野中光線太強或太弱，應該怎么做？

4.用油鏡觀察革蘭染色細菌標本并繪圖。

實驗二白細胞的吞噬及溶菌酶試驗

【實驗目的】

1.熟悉白細胞的吞噬及溶菌酶試驗的原理和方法。

2.通過本實驗理解機體的非特異性免疫機制。

【實驗原理】

機體內具有吞噬功能的細胞大致分為兩大類，即小吞噬細胞和大吞噬細胞。小吞噬細

胞一般指血液中的中性粒細胞,大吞噬細胞則是存在于組織中的巨噬細胞和血液中的大單核

細胞。它們構成機體天然防御機能。本實驗通過體外或動物體內的細胞吞噬及溶菌酶試驗，

以證實機體的非特異性免疫機制。

【實驗用品】

1.器材.：顯微鏡、載玻片、厚凹玻片、接種環(huán)、采血針、滴管、濕盒、恒溫培養(yǎng)箱、

7

注射器、針頭、打孔器、平皿、酒精燈、火柴。

2.材料、試劑：3.8%枸椽酸鈉、2%碘酒、75%酒精、瑞氏染液、蒸儲水、6%可溶性

淀粉、1%雞紅細胞懸液、溶壁微球菌(100mg/ml)、1/15mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6⑷、

瓊脂、標準溶菌酶(100ug/ml)、新鮮雞蛋清(1:10)、生理鹽水、香柏油。

3.菌種：白色葡萄球菌24小時斜面培養(yǎng)物。

4.動物：小白鼠

【內容和方法】

一、小吞噬試驗(中性粒細胞吞噬功能試驗)

1.方法

(1)取厚凹玻片一片，在凹孔中用滴管加入一滴3.8%枸椽酸鈉溶液。

(2)依次用碘酒、酒精消毒手指或耳垂及采血針后，從消毒部位采取三大滴血加入凹孔

中混勻。

(3)將接種環(huán)燒灼滅菌后，刮取少許白色葡萄球菌置于凹孔血液中攪勻。

(4)將上述凹破片放人濕盒，于37℃溫箱中作用45分鐘，注意每15分鐘混勻一次。

(5)取出凹玻片，用燒灼滅菌的接種環(huán)將凹孔中血液攪勻后取血3—4環(huán)于載玻片上，用

另一載玻片推成薄血片。接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

(6)待血片自干后，用瑞氏染液染色。用吸管取瑞氏染液數(shù)滴滴于上述血片上先染1分

鐘。然后加等量緩沖液，輕輕晃動混勻，繼續(xù)染5分鐘后水洗，用吸水紙吸干后鏡檢。

2.結果分析

油鏡檢查，先尋找白血球，觀察胞漿中有無吞噬的細菌。如結果正確可見染成紫色的細

胞核及被吞噬的細菌，細胞槳則為淡紅色。

隨機計數(shù)100個中性白細胞，記錄發(fā)生吞噬和未發(fā)生吞噬的白細胞數(shù)，計數(shù)吞噬細胞百

分率。

二、大吞噬試驗

1.試劑配制

(1)6%可溶性淀粉肉湯：取肉湯培養(yǎng)基100ml,加入可溶性淀粉6g,混勻后煮沸滅菌，

冷卻后置4℃冰箱保存(只能保存一周)。使用時37℃水浴溶解。

(2)1%雞紅細胞懸液：取肝素抗凝雞血1ml,加生理鹽水99ml混合。

2.方法

(1)試驗前3天，于小白鼠腹腔內注射6%可溶性淀粉肉湯lid(注射時切勿刺傷內臟)。

(2)試驗當天，于每只小白鼠腹腔內注射1%雞紅細胞懸液1ml并輕揉腹部。

(3)注射后30分鐘，用注射器吸取腹腔液少許，置于潔凈載玻片上，推成涂片、晾干。

用瑞氏染液染色。

(4)油鏡觀察小白鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞現(xiàn)象(雞紅細胞為有核紅細胞)，并計算吞噬

8

細胞的百分率。

瑞(Wright)氏染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60nil,先將染粉置研缽內加少量甲醇研磨，

然后加入全部甲醇。配好的染液要裝瓶塞緊，置二周后使用。

三、溶菌酶測定

1.試劑配制

(1)溶壁微球菌菌液的制備：菌種于使用前先在瓊脂斜面上傳代一次，然后接種于瓊脂

斜面培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時后收集菌苔，稱重、用pH6.4磷酸鹽緩沖液配成100mg/

ml菌液。經(jīng)70℃水浴1小時殺菌，放置4℃冰箱備用。

(2)pH6.41/15mol/L磷酸鹽緩沖液(沙倫生PBS)：甲液：無水Na2HP0,9.46g溶于

1000ml蒸儲水。乙液:無水KH2Po9078g溶于1000ml蒸儲水。然后取甲液27ml,ZM73mL

加NaCl0.5g即成。

2.方法及結果

(1)將1%磷酸鹽緩沖液瓊脂lOOrnl加熱溶化，待冷至50—60°C時加入微球菌菌液

1ml(每ml瓊脂內含標準溶壁微球菌Img)混和均勻，注入無菌平皿，每個平皿15ml。

(2)瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂板上打4個孔，孔徑5mm,孔距相等。

(3)用1ml注射器吸取唾液(由實驗者收集自己的唾液于潔凈平皿中取下層清液使用)，

加入瓊脂孔內，以注滿為度。同時以標準溶菌酶、雞蛋清作為陽性對照，生理鹽水作為陰性

對照，分別作好標記。

(4)將平皿置于實驗臺上于室溫中過夜，第二天觀察瓊脂孔周圍的溶菌環(huán)。根據(jù)溶菌環(huán)

直徑的大小比較唾液及二個陽性對照的實驗結果，分析試劑中溶菌酶的含量。

【注意事項】

1.小吞噬實驗中要掌握好抗凝劑與血液的比例，否則會使紅細胞及白細胞破壞，影響

結果的觀察。

2.大吞噬實驗時使用小白鼠處于直立姿勢有利于腹腔滲出液的抽取。

3.溶菌酶實驗中應注意無菌操作，否則雜菌生長會影響溶菌環(huán)的觀察。

【實驗報告與思考題】

1.在吞噬細胞中發(fā)現(xiàn)細菌時，如何區(qū)別吞噬的細菌和粘附在吞噬細胞表面的細菌？

2.簡述機體非特異性免疫的概念及特點？

實驗三巨噬細胞(白細胞)移動抑制試驗

【實驗目的】

1.熟悉巨噬細胞或白細胞的移動抑制試驗的原理方法及意義。

2.通過本實驗了解細胞免疫的特異性。

9

【實驗原理】

根據(jù)白細胞可以游走的特點，將事先用布氏桿菌致敏的小鼠腹腔滲出細胞置毛細玻璃

管中37℃培養(yǎng)，24小時候白細胞可從管口向外移動擴散成扇狀。若再次遇到相應的抗原時,

由于致敏淋巴細胞能釋放出巨噬細胞移動抑制因子（MIF）或中性粒細胞移動抑制因子（NIF）,

抑制巨噬細胞、中性粒細胞的移動，故白細胞游出毛細管口面積減少。根據(jù)此情況計算的移

動指數(shù)（MI）,可反映機體的細胞免疫水平。因此本實驗是檢測細胞免疫功能的方法。

【實驗用品】

1.材料藥品：布氏桿菌致敏的小鼠、布氏桿菌抗原、Hanks液、RPMI1640培養(yǎng)液、凡

士林、8%淀粉肉湯。

2.器具：水平離心機、解剖顯微鏡（或低倍顯微透射儀）、恒溫箱、毛細玻璃管（內徑

1mm,兩端粗細一致，長7~8cm）、平底凹孔玻璃板（凹孔直徑2cm）、蓋玻片、注射器、砂

輪、帶蓋瓷盤。

【內容和方法】

一、動物細胞制備

布氏桿菌致敏的小鼠腹腔注射8%淀粉肉湯0.5ml,3?4天后將動物處死，向腹腔內注

射2mlHanks液,無菌取出腹腔滲出細胞。配成10%的細胞懸液（或用Hanks液洗滌2次后，

配成8x個/mi的白細胞懸液）。

二、操作方法

1.用長針頭注射器吸取10%的細胞懸液，裝入預先封好一端的毛細玻璃管內（約3/4體

積），每份標本實驗組和對照組各裝4支，裝入各管的細胞懸液應相等。

2.將毛細管置于離心管中，于水平離心機內，2000r/min離心5分鐘后，用小砂輪沿毛

細管的細胞-液血之間劃痕，小心折斷。

3.將含有細胞的毛細管端沾少量凡士林，置平底凹玻片中固定，加入RPMI1640細胞培

養(yǎng)液，實驗組培養(yǎng)液中加入相應的抗原，即2xl（）6/ml布氏桿菌，對照組使含細胞培養(yǎng)液，

加蓋玻片，將凹玻片水平置于帶濕紗布的瓷盤中，37℃孵育24小時后觀察結果。

三、結果分析

取出凹玻片，用解剖顯微鏡或低倍顯微透射儀測出各毛細管的巨噬細胞或白細胞移動

的扇面長短直徑，按以下公式計算出移動指數(shù)（皿）。

實驗組（加抗原）移動直徑平均值

MI=

對照組（不加抗原）移動直徑平均值

MIV0.8為陽性，0.8VMIC1.2為正常值

【注意事項】

1.在實驗中，一批試驗用的毛細管口徑要相同。

10

2.試驗中需嚴格按無菌操作方法進行，不能接觸洗滌劑、消毒劑等，以免影響結果。

【實驗報告與思考題】

1.記錄結果，計算出MI,并作解釋。

2.白細胞移動抑制試驗有何實際意義？

實驗四硝基四氮唾藍（NBT）還原試驗

細胞生化功能的改變也可以間接地反映有關細胞的非特異免疫功能，本次實驗進行中

性粒細胞的硝基四氮哇藍（NBT）還原試驗。

【實驗原理】

細菌感染時給你正常的中性粒細胞能量消耗劇增，耗氧量增加，糖代謝活躍。有氧化

還原反應，糖氧化過程中所脫的氫可被吞噬的或滲透到中性粒細胞胞質內的NBT染料接受，

使淡黃色的NBT還原成藍黑色的甲膻，以折光性強的點狀或斑塊狀顆粒沉積于細胞內。鏡下

檢查NBT陽性細胞數(shù)量，便可推知中性粒細胞的殺菌功能。

【實驗用品】

1.NBT染液：取0.28gNBT加入100ml生理鹽水，用超細玻璃濾器過濾，分裝，4℃保存。

2.0.77%沙黃O染液。

3.肝素：用無菌生理鹽水配制25U/ml肝素溶液。

4.培養(yǎng)液：取0.5ml正常人血清加入0.3ml無菌生理鹽水和0.6mlNBT染液。

5.甲醇、無菌生理鹽水等。

6.碘酒與酒精棉球、溫箱、凹玻片、濕盒、注射器、吸管等。

【操作方法】

1.取肝素抗凝外周靜脈血0.1ml和培養(yǎng)液0.1ml加于凹玻片孔中混勻，置濕盒37℃

20min,中間搖動一次，再置室溫15mino

2.取一滴混懸液于載玻片一端推成薄片，空氣中快速干燥。

3.甲醇固定1-2分鐘。

4.用0.77%沙黃O染液5min,水洗,干后油鏡下檢查。

【結果判斷】

凡中性粒細胞胞質內含有斑點狀或塊狀的甲腹顆粒沉積者為NBT陽性細胞，計數(shù)100?

200個中性粒細胞，計數(shù)NBT陽性百分率。

【實驗討論】

1.注意事項①NBT染液應過濾，不要殘留顆粒。②所用器皿應潔凈，避免玻璃表面因

素參加NBT的還原作用。③單核細胞還原NBT的能力很強，在計算NBT陽性細胞時應除外。

2.方法評價該實驗簡便、快速、便于重復，但特異性差，易出現(xiàn)假陽性和假陰性結

果。

11

3.臨床意義正常人參考值應在10%以下;全身細菌感染病人NBT陽性細胞在10%以

上；病毒感染、無菌血癥的局部感染或循環(huán)中無細菌產(chǎn)物（如內毒素）時，NBT值正常。慢

性肉芽腫等吞噬細胞功能缺陷病無NBT陽性細胞，故可作為診斷該病的指標。

實驗五凝集反應

【實驗目的】

1.了解凝集反應的原理、基本類型及其用途。

2.熟悉玻片凝集試驗、試管凝集試驗、間接凝集試驗的實驗方法和結果分析。

【實驗用品】

1.材料試劑：傷寒桿菌、大腸桿菌18?24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物、傷寒桿菌H血清、

傷寒桿菌H菌液、待測孕婦尿液、HCG陽性孕婦尿液、1:10稀釋傷寒桿菌診斷血清、AB0

血型標準血清、類風濕免疫診斷試驗（用變性IgG致敏的乳膠顆粒）、HCG致敏乳膠試劑、

兔抗HCG診斷血清、待測血清、生理鹽水。

2.器材：潔凈載玻片、巴氏吸管、乳膠皮頭、接種環(huán)、酒精燈、特種鉛筆（或記號筆）、

小試管、牙簽、采血針、75%酒精棉球、無菌干棉球、試管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃

恒溫箱（或37℃/56c水浴箱）、顯微鏡。

【內容和方法】

一、玻片凝集試驗（slideagglutination）

1.原理

玻片凝集試驗（slideagglutination）是將已知的抗體直接與未知的顆粒性抗原物質（如細

菌、立克次體、鉤端螺旋體等）混合，在有適當電解質存在的條件下，如兩者對應便發(fā)生特

異性結合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對應便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性。

此法屬定性試驗，主要用于檢測抗原，如AB0血型鑒定、細菌鑒定和分型等。

2.方法

（1）取載玻片一張（平置實驗臺上），用特種鉛筆或記號筆劃分為3格，并標明1、2、

3o

（2）取巴氏吸管一支，套上乳膠皮頭后，吸取1:10稀釋的傷寒桿菌診斷血清1?2滴

于第1、2格內，另取巴氏吸管一支，吸取生理鹽水1?2滴于第3格內。

（3）將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌，冷卻后取少許傷寒桿菌菌培養(yǎng)物與第1、3

格內的診斷血清、生理鹽水混合并涂抹成均勻懸液。然后用同樣方法取少許大腸桿菌培養(yǎng)物

與第2格內的的診斷血清混合并涂抹成均勻懸液。靜置數(shù)分鐘后觀察結果。

3.結果觀察與判定

如上述混合懸液由均勻混濁狀變?yōu)槌吻逋该?，并出現(xiàn)大小不等的乳白色凝集塊者即為陽

12

性（+）;如混合物仍呈均勻混濁狀則為陰性（一）。如肉眼觀察不夠清楚，可將玻片置于顯

微鏡下用低倍鏡觀察。

本次實驗結果第1格內應出現(xiàn)大小不等的乳白色凝集物（陽性），第2、3格內無凝集

物，混合液仍呈均勻混濁狀（陰性）。

【注意事項】

（1）傷寒桿菌為腸道致病菌，在實驗中務必嚴格無菌操作，遵守實驗規(guī)則，用后的載

玻片應立即投入指定的容器中，接種環(huán)必須做滅菌處理。

（2）取細菌培養(yǎng)物時，不宜過多，與抗血清混合涂抹時，必須將細菌涂散，涂均勻，

但不宜涂得太寬，以免很快干涸而影響結果觀察。

二、人類ABO血型鑒定試驗（玻片法）

1.原理

人類ABO血型抗原有A和B兩種。A型紅細胞膜上有A抗原，B型紅細胞上有B抗

原，AB型有A和B兩種抗原，而0型則不含有A和B抗原。據(jù)此，如分別將抗A和抗B

血清與待測紅細胞混合，抗A和/或抗B血清與紅細胞表面上的相應抗原結合而引起紅細

胞凝集，根據(jù)其凝集狀況便可判定受試者的血型（見表5-1）。

表5-1血型鑒定試驗結果與判定

您血清

抗A抗B

血型

A+-

B-+

AB4-+

O--

“+”表示凝集，表示無凝集。

2.方法

（1）用酒精棉球消毒無名指指端皮膚或耳垂，待酒精干后用無菌采血針刺破表皮，用

毛細吸管取血1?2滴，放入含1ml生理鹽水的小試管中，混勻，即成待檢紅細胞懸液（約

2%）。取血后，應立即用無菌干棉球壓迫針眼止血。

（2）取凹玻片或載玻片一張，用記號筆分為兩格，并注明A、B字樣。

（3）用巴氏吸管吸取抗A血清、抗B血清各一滴分別滴于A、B格內（也可用2nli的

一次性注射器代替巴氏吸管）。

（4）另用巴氏吸管取待測5%紅細胞懸液，于A格和B格內各加滴。然后分別用牙簽

13

將抗血清與紅細胞攪拌均勻(也可輕輕晃動載玻片以促其充分混勻)，以加速其反應。將玻片

放置于實驗臺上靜置數(shù)分鐘后，在白色背景下觀察凝集情況。

3.結果觀察與判定

如混合液由均勻紅色混濁狀逐漸變?yōu)槌吻?，并出現(xiàn)大小不等的紅色凝集塊者即為紅細

胞凝集；若混合液仍呈均勻混濁狀，則表明紅細胞未發(fā)生凝集。

如肉眼觀察不夠清楚，可將玻片置于顯微鏡下用低倍鏡觀察。

(1)試驗用凹玻片或載玻片要清潔，注明A和B字佯。

(2)所用抗A、抗B血清必須在有效期內(注意試劑包裝說明的有效期限)使用。

(3)待檢紅細胞懸液不宜過稀或過濃。

(4)要及時觀察結果，以防時間過長使標本干涸而影響結果觀察和判定。

三、試管凝集反應

1.原理

試管凝集反應是?種定量試驗，常用已知顆粒性抗原來檢測未知抗體及其含量。方法

是用生理鹽水將待測血清在試管中進行連續(xù)倍比稀釋，然后于各管中加入等量已知抗原懸

液，37℃過夜或56℃水浴2小時后，觀察有無凝集并根據(jù)凝集程度，判定待檢血清抗體的

效價。

本法主要用于某些傳染病的輔助診斷及流行病學調查，如傷寒、副傷寒及布氏桿菌病

的診斷等。

2.方法

(1)取潔凈小試管8只并依次排列于試管架上，用特種鉛筆或記號筆按順序注明號碼。

(2)將1ml刻度吸管套上乳膠皮頭，吸取生理鹽水0.9ml加至1號試管，余下每管中

分別加入0.5ml生理鹽水。

(3)用1ml刻度吸管取0.1ml抗傷寒桿菌“H”血清于第1管中。

(4)用1ml吸管在1號管內連續(xù)吸吹三次，使血清與生理鹽水充分混勻，然后吸取0.5ml

加至2號試管，隨后按上法進行倍比稀釋直至7號試管，最后從7號管中吸出0.5ml混合液

棄去。至此，1?7號試管的血清稀釋度依次為1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,

1:640,而8號管中只有0.5ml生理鹽水，此管系陰性對照管(見圖5T)。

14

（5）取5nli吸管吸取傷寒桿菌H菌液，加于1?8號試管中，各加0.5ml。此時，每支

試管中的液體量均為lml,1?7號試管的血清最終稀釋度分別為1:20、1:40、1:80、1:160、

1:320、1:640、1:1280,

（6）持試管架輕輕振蕩搖勻，以使血清與菌液混合均勻。然后置37℃恒溫箱過夜或

56℃水浴箱2h,再觀察結果。

圖5-1血清等倍稀釋法圖示

3.結果與判定

（1）對照管（第8管）：上清液混濁，管底有沉淀的物，如斜置試管可見其流動，若

輕輕振蕩便分散呈混濁狀。

（2）試驗管：按1-7號管依次觀察。如有凝集（此為陽性），可見管底有凝集塊，平

鋪于試管底部，邊緣向上卷曲或出現(xiàn)凝結顆粒，輕搖即升起，“H”菌液的凝集塊呈絮狀，液

體上部澄清。陰性者則與對照管（第8管）相同。

（3）凝集強弱的判定與記錄。

++++：表示細菌全部凝集。試管底部有大量凝集塊，上清液澄清透明.

+++：表示絕大部分細菌凝集，凝集物較多或與++++相當，上清液澄清。

++：表示部分（約50%）細菌發(fā)生凝集，凝集物較少，呈顆粒狀，上清液基本澄清。

+：凝集物很少，需仔細觀察才能發(fā)現(xiàn)，上清液基本渾濁。

-：表示不凝集。與陰性對照管相同。

（4）判定凝集效價（滴度）：以凝集物明顯可見，且血清稀釋度又最高的那一號試管的

血清最終稀釋度為血清效價。

4.注意事項

（1）實驗操作應認真仔細，如向試管內插放吸管宜輕，以免戳穿試管底；取貨加樣應

準確；稀釋血清時應仔細地逐管進行，以防跳管。

（2）觀察結果時，最好不要振搖試管，以免凝集物搖散振碎而影響他人觀察。

四、間接凝集試驗

15

1.原理

本實驗是將已知的可溶性抗原吸附或偶聯(lián)在與免疫無關，有一定大小的顆粒性物質（載

體顆粒）表面上，然后再與相應抗體混合，并在有適當電解質存在的條件下，由抗原抗體的

特異性結合而發(fā)生肉眼可見的載體顆粒凝集。該實驗可用于細菌、病毒、鉤體、梅毒螺旋體

抗體，以及某些自身抗體（如抗核抗體、抗腎抗體、抗甲狀腺抗體等0的檢測。

可用作載體的物質有紅細胞（如Rh-0型血紅細胞、綿羊紅細胞、兔紅細胞等）、聚苯

乙烯乳膠顆粒，活性炭以及硅酸鋁顆粒等。若所用載體為紅細胞，即稱間接血凝實驗，如載

體為乳膠顆粒，則叫間接乳膠凝集試驗（見后述）。

2.方法（類風濕因子測定）

（1）用生理鹽水將待測血清稀釋1:20。

（2）用巴氏吸管吸取1:20待測病人血清一滴于載玻片上，然后加一滴類風濕免疫診

斷試劑。

（3）持玻片輕輕晃動使之充分混勻。5分鐘內出現(xiàn)均勻的乳白色凝集顆粒者為陽性，

無凝集者為陰性。

3.注意事項

應在5分鐘內觀察結果。因放置過久可出現(xiàn)假陽性。

五、間接乳膠凝集抑制試驗

1.原理

將待測樣品與已知抗體混合作用一定時間后，再將其與相應抗原致敏的乳膠顆粒混合。

如待測樣品中含有相應抗原，便可與加入的抗體結合，當再加入致敏乳膠顆粒后，就沒有相

應的抗體與乳膠顆粒表血的抗原結合而發(fā)生凝集，這就是乳膠凝集抑制試驗（如圖5-2）。

所以，不發(fā)生凝集者為陽性，表明待測樣品中含有相應抗原；發(fā)生凝集者為陰性，提示待測

樣品中無相應抗原。

圖5-2間接凝集抑制試驗

本法主要用于檢測抗原。如乳膠妊娠試驗，就是先將待測孕婦尿液（含有人絨毛膜促

性腺激素，HCG）與已知抗HCG抗體作用，從而抑制了抗HCG與致敏乳膠顆粒表面上的HCG

結合，于是乳膠凝集被抑制。

16

2.方法（見表5-2）

（1）取凹玻片一張置實驗臺上，用標記筆劃線分為三格，并注明甲、乙、丙。

（2）用巴氏吸管取生理鹽水一滴加入乙格中，然后取待測孕婦尿一滴加在甲格中，另

用巴氏吸管取HCG陽性孕婦尿一滴加在丙格中。

（3）于甲、乙、丙格中各加入一滴兔抗HCG血清。分別用牙簽將反應液充分攪拌均勻,

靜置30秒至1分鐘。

（4）于甲、乙、丙格中各加入一滴HCG致敏乳膠試劑，分別攪拌均勻。靜置10分鐘

左右后觀察結果。

表5-2乳膠妊娠試驗程序

甲乙丙

待測尿生理鹽水HCG陽性尿

抗HCG抗HCG抗HCG

致敏乳膠致敏乳膠致敏乳膠

結果+或-

3.注意事項

（1）所用診斷試劑必須是有效期內。用前應充分搖勻。

（2）拌攪用的牙簽不能共用。

（3）加樣不宜過多，玻片應平置，以防兩格之間反應液溢流相混。

（4）如肉眼觀察不夠清楚，可借助放大鏡觀察。

【實驗報告與思考】

1.記錄玻片凝集實驗的材料、方法、結果（最好用文字加圖示），并討論。

2.記錄血型鑒定試驗的材料、方法與結果。

3.記錄試管凝集試驗的材料、方法、結果及測定效價（可用表格方式表示）。

4.記錄類風濕因子乳膠凝集試驗的材料、方法與結果。試對結果作討論分析。

5.記錄乳膠妊娠試驗的材料、方法、結果及判定。試驗結果予以分析討論。

6.玻片凝集試驗與試管凝集試驗有何區(qū)別？直接凝集試驗與間接凝集試驗有何不同？

實驗六沉淀反應

【實驗目的】

1.掌握瓊脂單向擴散、雙向擴散的基本原理、方法、結果分析及臨床用途。

2.熟悉免疫電泳的基本原理、方法。

3.了解火箭免疫電泳的基本原理和方法。

【實驗用品】

17

1.材料試劑：1.5%鹽水瓊脂、人IgG、IgA、IgM抗血清、標準參考血清；待測血清或

唾液、AFP免疫血清、臍帶血清、兔抗人血清、1%瓊脂糖、0.5mol/LpH8.6巴比妥緩沖液。

2.器材：恒溫水浴鍋、溫箱、三角燒杯、吸管、瓊脂板（塑料）、微量加樣器、打孔器

（直徑3mm）、坐標紙、標尺、鉛筆、電泳儀、聚苯乙烯塑料條、注射器及針頭等。

【內容和方法】

一、瓊脂擴散試驗

1.單向擴散

（1）原理

單向擴散系定量試驗，通常以已知抗體測定未知抗原。試驗中首先將一定的抗血清（抗

體）混合于瓊脂內，制成含抗體的瓊脂板，再于瓊脂板上打孔，將一定量的抗原加入孔中，

抗原向孔四周擴散，與相應抗體結合，在抗原抗體比例合適處形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的直

徑大小與抗原的濃度呈正比。以不同濃度的標準抗原與固定濃度的抗血清反應測得沉淀環(huán)的

直徑作為縱坐標，以抗原濃度為橫坐標，繪制標準曲線，量取待檢抗原的沉淀環(huán)直徑，即可

從標準曲線中求得其含量。該實驗主要用于檢測標本中的各種Ig含量和血清中補體成分的

含量。

（2）方法

①參考血清的稀釋：取凍干Ig參考血清支，加入0.5ml蒸儲水溶解，用0.01mol/L

pH7.2?7.4PBS倍比稀釋成1:10?1:160五種濃度。

②免疫瓊脂板制備:將適宜濃度的人Ig抗血清與預先融化好的L5%瓊脂在56℃水浴中

混勻，每板內灌注3.3ml,制成瓊脂板（IgG、IgA、IgM）,并做好標記。然后用3mm的打孔

器在瓊脂板上打孔，孔距1?1.5cm?？變拳傊米⑸淦麽橆^挑出。

③加樣：用微量移液器取10u1各種不同濃度的參考血清準確加入免疫板的孔內，每一

濃度均加兩個孔，然后用上述加樣方法，取10口1適宜稀釋度的待測血清，加入免疫反應板

的孔內。

④反應：將加樣的瓊脂板置水平濕盤內，于37℃溫箱反應24?48小時后，取出反應板,

用標尺測其沉淀環(huán)直徑并記錄。

⑤標準曲線的繪制：以各濃度標準抗原的沉淀環(huán)直徑為縱坐標，相應孔中抗原Ig濃度

含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線（見圖6-1）。

⑥待測標本Ig（IgG、IgA、IgM）含量的計算：以待測標本的沉淀環(huán)直徑查標準曲線，

將查得的Ig含量乘其稀釋倍數(shù)，即得該標本的Ig含量。

⑦幾種試劑的配制：

A.1.5%瓊脂的配制:秤取1.5g瓊脂,用含0.01%柳硫汞的生理鹽水100ml溶解，加熱

使之呈液體狀。

B.0.01mol/LpH7.2PBS的配制：先配制0.2mol/LNazHPCU及NaH2Po4溶液，取72ml

18

0.2mol/LNa2HPO428ml0.2mol/LNaH2PO4混合，然后用0.85%NaCl溶液稀釋20倍即成。

30

(25

U

I

U

I20

)

空15

回

氐10

墟

這5

100500100015002000

抗原濃度（mg/100ml）

圖6T瓊脂單向擴散試驗的標準曲線圖

（3）注意事項

①制備瓊脂板時溫度不宜過高使抗體變性失活，亦不宜太低，以免使瓊脂凝固不勻。

②沉淀環(huán)的直徑均已mm為測量單位。

2.雙向擴散

（1）原理

雙向擴散為定性試驗。將可溶性抗原與相應抗體分別加入瓊脂板上相對應的孔內，兩者

相互擴散，在比例適宜處形成沉淀線。如抗原與抗體無關則不形成沉淀線。此實驗用來檢測

抗原或抗體的純度，亦可用已知的抗原（抗體）來測未知的抗體（抗原）。臨床上常用于檢

測甲胎蛋白（AFP）,作為原發(fā)性肝癌等的輔助診斷。

（2）方法

①瓊脂反應板的制備：取融化好的1%鹽水瓊脂3.3ml,置瓊脂板內，待冷即制成瓊脂反

應板。

②打孔：用打孔器在瓊脂板上打孔，孔距6mm，呈梅花形排列，即中間一孔，周圍六孔,

將孔內瓊脂用注射器針頭挑出。

③加樣：用微量移液器取lOu1AFP免疫血清準確加入中央孔內，上下孔各加10u1臍

帶血清作為陽性對照。其余孔加等量的待測血清。

④反應：將加好樣的瓊脂板置水平濕盤內，于37℃溫箱反應24小時。

⑤結果分析：待測標本如出現(xiàn)沉淀線，且與陽性對照的沉淀線吻合，則為陽性反應。如

無沉淀線出現(xiàn)或是與陽性對照沉淀線交叉的沉淀線則為陰性（見圖6-2）。

o￡oO

OoO

0^0°KK°

圖6-2雙向擴散結果示意圖(梅花孔法)

(3)注意事項

①加樣時，注意不要將瓊脂劃破，以免影響沉淀線的形狀。

②反應時間要適宜。時間過長，沉淀線可解離至假陰性；時間過短，則沉淀線不出現(xiàn)。

③就愛樣時抗體、陽性血清及待測標本應各用一支加樣器，以免混淆，影響實驗結果。

二、免疫電泳

1.原理

免疫電泳是免疫擴散與電泳相結合的免疫學分析技術，具有極高的分辨力。主要用于抗

原組成的定性分析。免疫電泳實際上分為兩個步驟：①電泳，待測抗原在瓊脂中進行區(qū)帶電

泳。由于不同蛋白質組份的大小、質量及所帶的電荷不同，在電場的作用下，可將不同組份

區(qū)分開。②瓊脂擴散，電泳后，在瓊脂槽內加入相應的抗血清，進行免疫擴散，根據(jù)出現(xiàn)沉

淀線的數(shù)量及位置即可分析抗原的組份機器性質。

2.方法

(1)瓊脂反應板的制備：將載玻片置水平臺面，并將塑料條置于玻片上面，然后取4ml

融化好的1%瓊脂糖與玻片上，待自然冷凝后取出塑料條，即成瓊脂槽。最后根據(jù)需要在瓊

脂板上打孔，挑去孔內瓊脂。

(2)加樣：用微量移液器取10U1待測血清準確加入孔內。

(3)電泳：用電泳儀(一般生化檢驗分析蛋白的電泳儀即可)電泳，選擇電壓一般為

3?4V/cm,電泳時間為1.5小時。

(4)擴散：取兔抗人血清加入瓊脂槽。置濕盒內，37C24小時后觀察結果。

(5)結果觀察：在瓊脂槽的兩邊出現(xiàn)相對應的沉淀線。

3.注意事項

(1)有時抗原抗體形成的沉淀線很弱，肉眼不易觀察，可以染色。

(2)染色標本應在白色背景下觀察，不染色標本需在斜射光的暗色背景下觀察。

(3)瓊脂板兩端需用濾紙等物作橋，與橋內緩沖液接通。搭橋要完全緊密接觸。以防

電流不均發(fā)生沉淀線偏斜。

三、火箭免疫電泳

1.原理

火箭免疫電泳是將電泳與單向擴散結合的一種免疫技術。將抗體溶入瓊脂后制板，在

瓊脂板的一側打孔，加入待檢樣品及不同濃度的標準抗原。電泳時抗原在含定量抗體的瓊脂

20

中向正極移動，并形成濃度梯度，在適宜的部位形成火箭狀的沉淀峰。沉淀峰的高度與抗原

的含量成正比，故可定量測定抗原。

2.方法

（1）制板：將抗體血清按一定比例與溶化好的1.5%瓊脂在56℃水浴中混勻，迅速澆

注成2mm厚的瓊脂板。

（2）打孔：待瓊脂凝固后，于距玻板一長邊10mm處，以3mm孔徑打孔器打孔一排,

孔距5mm。

（3）加樣：取不同濃度的標準抗原及待測抗原各10川加入孔中。

（4）電泳：將抗原孔置于負極端，進行電泳（3V/cm）,時間6-8小時。

3.結果

（1）標準曲線的繪制：以沉淀峰高為縱坐標，抗原濃度為橫坐標，在半對數(shù)紙上繪圖。

（2）待測抗原含量的測定：量出待測孔沉淀峰高，查標準曲線可查得抗原的相應濃度,

乘其稀釋倍數(shù)即得抗原的含量（圖6-3）。

+