TNAIA 0311-2024 支原體中西藥MIC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

ICS65.020.30CCSA031T/NAIA團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/NAIA0311—2024MICStandardOperatingProceduresforMICDetectionofMycoplasmainTraditionalChineseandWesternMedicine2024-10-02發(fā)布 2024-10-20實(shí)施寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì) 發(fā)布II前??言GB/T1.1—20201草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)提出并歸口。業(yè)農(nóng)村局。本文件主要起草人：郭亞男、王小龍、曹曉真、王建東、梁小軍、邵喜成、伏耀明、馬科、謝文青、擺世林、于有利、張久盤(pán)、張奎舉、謝建亮、李毓華、岳康、王鑫、牛曉昊。T/NAIA0311—2024T/NAIA0311—2024PAGEPAGE10支原體中西藥MIC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程范圍本文件規(guī)定了支原體中藥和西藥最小抑菌濃度檢測(cè)技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、原理、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、結(jié)果判斷依據(jù)和操作注意事項(xiàng)。本文件適用于雞、牛和羊支原體。規(guī)范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB18597危險(xiǎn)廢物貯存污染控制標(biāo)準(zhǔn)CLSIM100-S22抗生素敏感性檢測(cè)操作標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1支原體mycoplasma柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬中的成員，結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，無(wú)細(xì)胞壁，沒(méi)有細(xì)胞核，僅有核糖體。3.2最小抑菌濃度minimuminhibitoryconcentration(MIC)一種在特定環(huán)境下孵育24小時(shí)，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)的最低藥物濃度即最小抑菌濃度，用于定量測(cè)定體外抗菌活性。3.3顏色變化單位colorchangeunit(CCU)以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)，來(lái)計(jì)數(shù)微生物的相對(duì)含量的計(jì)數(shù)單位。3.4胸膜肺炎樣微生物培養(yǎng)基pleuropnenmonia-likeorganismmediumPPLO即支原體培養(yǎng)基，主要用于多種支原體的分離和培養(yǎng)。原理PPLO將藥物進(jìn)行倍比稀釋1mL（MIC），亦即被測(cè)支原體對(duì)該藥的敏感度。操作程序儀器與耗材0.2mL122mLEP冰箱，天平，高壓消毒鍋，移液器及槍頭，0.22μm操作步驟藥液的制備西藥配置1mg/mL保存。使用前將儲(chǔ)存液使用去離子水稀釋至所需工作液濃度，0.22μm，4℃保存?zhèn)溆谩２煌幬顲LSIM100-S22中藥配置100.5h，40min，830min，1g/mL，-80℃使用前將儲(chǔ)存液使用去離子水稀釋至所需工作液濃度，0.22μm，4℃保存?zhèn)溆谩CU將保存于-8030100μLPPLO37℃48h～72h100μLPPLOCCU。1×101～1×1011（1112377d，以培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌赛S色時(shí)的最高稀釋度作為顏色改變單位CCU，菌液濃度以CCU/mL最小抑菌濃度的測(cè)定菌液配置103～105CCU/mL驗(yàn)操作誤差及錯(cuò)誤判斷。藥物配置及操作CLSI（MIC）122管～12100μLPPLO1100μL1210100μL，1～10100μL11100L1231237℃48h，在不同時(shí)間觀察每個(gè)孔內(nèi)顏色的變化并記錄，MIC（μg/mL）。結(jié)果測(cè)定對(duì)受試細(xì)菌按測(cè)得的MIC值水平從低往高計(jì)算累積分布頻數(shù)，然后計(jì)算累積分布率，最終測(cè)到MIC50和MIC90。數(shù)據(jù)處理采用SPASS軟件對(duì)支原體菌株耐藥性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果判定根據(jù)西藥和中藥的MIC值，將支原體對(duì)藥物的敏感性分為敏感(Susceptible,S)、中度敏感(Intermediate,I)（Resistant,CC.2MIC實(shí)驗(yàn)廢棄物的處理121C30minGB18597附錄A（規(guī)范性）試劑配制均為分析純?？咕幣渲谱⒁馐马?xiàng)鑒于多種抗菌藥均為復(fù)合鹽類(lèi)，并有純度標(biāo)識(shí)，配制時(shí)，應(yīng)扣除雜質(zhì)部分和輔助基團(tuán)質(zhì)量，只考慮純198%582.58g/mol；而卡那霉素基484.50g/mol484.50/582.58(98%=0.815)5mg1個(gè)水的鹽酸卡那霉4.075mg（5mg*0.815=4.075mg）5mg4.075mL1mg/mL的貯存液；不同抗菌藥需要不同的溶劑溶解。操作時(shí)，先用少量合適溶劑溶解，再用去離子水稀釋成貯存濃度為1mg/mL；pH7.8，以避免導(dǎo)致支原體培養(yǎng)物出現(xiàn)非特異性顏色變化；0.22μm～80℃4℃?zhèn)溆谩Ｎ魉幦軇┖拖♂屢旱呐渲茀⒄誄LSIM100-S22配制，具體見(jiàn)表A.1.1。表A.1.1抗菌藥貯存液與工作液配制所選擇的溶劑和光敏感性藥物類(lèi)別藥物名稱溶劑稀釋液貯存液濃度mg/mL工作液濃度μg/mL光敏感性喹諾酮類(lèi)環(huán)丙沙星Ciprofloxacin水水132是達(dá)氟沙星Danofloxacin水水116是恩諾沙星Enrofloxacin0.1M氫氧化鈉水132是馬波沙星Marbofloxacin水水164是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)泰樂(lè)菌素水水132否tylosin托拉菌素tulathromycin0.015M檸檬酸水51024否阿奇霉素azithromycin0.1M乙酸水164否紅霉素Erythromycin95%乙醇水164是地紅霉素Dirithromycin0.1M乙酸水1128否羅紅霉素Roxithromycin95%乙醇水164否替米考星Tilmicosin0.01M鹽酸水1512是螺旋霉素Spiramycin95%乙醇水1512否氨基糖苷類(lèi)妥布霉素Tobramycin水水164否慶大霉素Gentamicin水水1256否壯觀霉素Spectinomycin水水1256否卡那霉素Kanamycin水水132是苯丙醇氟苯尼考Florfenicol95%乙醇水132否甲砜霉素Thiamphenicol95%乙醇水3512是四環(huán)素類(lèi)四環(huán)素Tetracycline水水116是多西環(huán)素Doxycycline水水132是金霉素Chlortetracycline0.01M鹽酸水164是林可胺酰胺類(lèi)林可霉素Lincomycin水水132否甘氨酰環(huán)素替加環(huán)素Tigecycline水水1128否雙萜烯類(lèi)泰妙菌素Tiamulin95%乙醇水1128是氟奎諾酮類(lèi)恩諾沙星Enrofloxacin0.01M鹽酸水1128否中藥溶劑和稀釋液的配制表A.1.2中藥貯存液與工作液配制所選擇的溶劑藥物名稱溶劑稀釋液貯存液濃度g/mL工作液濃度μg/mL光敏感性知母水水1125否桔梗水水162.5否甘草水水1250否川芎水水1500否當(dāng)歸水水11000否冬花水水1125否枳殼水水1500否浙貝水水1500否蘇籽水水1500否厚樸水水162.5否生姜水水11000否柴胡水水1250否杏仁水水11000否紫蘇水水1250否黃連水水131.5否茯苓水水11000否穿心蓮水水1125否黃芩水水132.5否魚(yú)腥草水水17.81否麻黃水水162.5否板藍(lán)根水水1500否黨參水水11000否黃柏水水115.63否苦參水水115.63否百部水水1250否金銀花水水1500否紅花水水1500否大青葉水水11000否支原體液體培養(yǎng)基PPLO21g，2.5g，1g，0.2g800mL，12120min后，添加馬血清200mL，8萬(wàn)單位青霉素0.1g，0.05%酚紅1mL，4℃保存。支原體固體培養(yǎng)基PPLO30g，2.5g，1g，0.2g800mL，12120min后，添加馬血清200mL，8萬(wàn)單位青霉素0.1g，0.05%酚紅1mL，4℃保存。附錄B（資料性）支原體顏色變化單位測(cè)定方法支原體顏色變化單位的測(cè)定121.5mLEP900μLPPLO1100μL100μL2100μL3137℃48h～725105CCU/mL。牛津杯法體外藥敏試驗(yàn)1:1000100μL37℃48h，測(cè)定抑菌圈大小并判定敏感性。附錄C（規(guī)范性）藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)MICMIC96100μL1237℃48h，內(nèi)顏色的變化并記錄，不改變顏色的藥物最高稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)管的抗菌藥濃度（μg/mL）MIC。藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)MIC(Susceptible,S)、中度敏感(Intermediate,I)耐藥（Resistant,R）C.1，C.2.表C.1支原體對(duì)各種西藥敏感性判斷值藥物類(lèi)別藥物名稱藥物濃度（μg/mL）敏感中介耐藥喹諾酮類(lèi)環(huán)丙沙星Ciprofloxacin≤12≥4a達(dá)氟沙星Danofloxacin≤12-4＞8a恩諾沙星Enrofloxacin≤12-4＞8a大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)泰樂(lè)菌素tylosin≤0.51-4≥8托拉菌素tulathromycin≤1632≥64阿奇霉素azithromycin≤24≥8紅霉素Erythromycin≤24≥8地紅霉素Dirithromycin≤24≥8羅紅霉素Roxithromycin≤24≥8替米考星Tilmicosin≤24≥8螺旋霉素Spiramycin≤24≥8氨基糖苷類(lèi)妥布霉素Tobramycin≤48≥16a慶大霉素Gentamicin≤48≥16氨基糖苷類(lèi)壯觀霉素≤48≥16Spectinomycin卡那霉素Kanamycin≤48≥16苯丙醇氟苯尼考Florfenicol≤24≥8甲砜霉素Thiamphenicol≤816≥32四環(huán)素類(lèi)四環(huán)素Tetracycline≤48≥16a多西環(huán)素Doxycycline≤48≥16a金霉素Chlortetracycline≤48≥16林可胺類(lèi)林可霉素Lincomycin≤2-≥4甘氨酰環(huán)素替加環(huán)素Tigecycline≤2-≥4雙萜烯類(lèi)泰妙菌素Tiamulin≤0.51-4≥8氟奎諾酮類(lèi)恩諾沙星Enrofloxacin≤48≥16表C.2支原體對(duì)各種中藥敏感性判斷值藥物名稱藥物濃度（μg/mL）敏感中介耐藥知母≤64-≥128桔?！?4-≥128甘草≤64-≥128川芎≤64-≥128當(dāng)歸≤64-≥128冬花≤64-≥128枳