KTA3022-CN-Caspase-3活性分析試劑盒（比色法）

Caspase-3活性分析試劑盒（比色法）Caspase-3活性分析試劑盒（比色法）Cat#:KTA3022 Size:20T/50T/100T Caspase-3活性分析試劑盒（比色法） 貨號：KTA3022 批號：見產(chǎn)品標簽 適用樣本：動物組織、細胞 保質(zhì)期：-20℃保存12個月原理半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已顯示在凋亡中起關(guān)鍵作用。哺乳動物Caspase可分為三個功能組：啟動子半胱天冬酶（Caspase-2、8、9和10），執(zhí)行者半胱天冬酶（Caspase-3、6和7）和炎性半胱天冬酶（Caspase-1、4、5、11和12）。Caspase-3（也稱為Yama，CPP32和Apopain）在天冬氨酸殘基的羧基末端切割其底物。活性Caspase-3由兩組同源二聚體（17和12kDa）組成，它們均來自兩個前體Caspase-3多肽，并具有兩個活性位點。Caspase-3與Caspases-8和9一起位于細胞凋亡途徑的關(guān)鍵連接點。Caspase-3活性分析試劑盒（比色法）基于Caspase-3水解肽底物Ac-DEVD-pNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-對硝基苯胺），產(chǎn)生黃色的對硝基苯胺（pNA），pNA在405nm附近有強吸收,從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase-3的活性。包裝清單試劑盒組分 規(guī)格 儲存條件 20T 50T 100T CellLysisBuffer 5mL 10mL 20mL 4℃ReactionBuffer(2×) 5mL 10mL 20mL 4℃Ac-DEVD-pNA(4mM) 100μL 250μL 500μL -20℃,避光保存pNA(10mM) 100μL 250μL 500μL -20℃,避光保存DTT(100×) 150μL 400μL 750μL -20℃自備耗材·酶標儀（能測405nm處的吸光度）·96孔板·低溫離心機、制冰機·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水、磷酸鹽緩沖液(PBS)·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備WorkingCellLysisBuffer:使用前，立即加入DTT（最終濃度：每1mLCellLysisBuffer加10μLDTT（100×）），置于冰上；4℃保存。WorkingReactionBuffer(1×):使用前，用去離子水稀釋到ReactionBuffer(1×)，再加入DTT（最終濃度：每1mLReactionBuffer(1×)加10μLDTT（100×）），置于冰上；4℃保存。Ac-DEVD-pNA(4mM):即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存，避免反復凍融。pNA(10mM):即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存，避免反復凍融。DTT(100×):即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的試劑-20℃分裝保存，避免反復凍融。Standard設置：用ReactionBuffer(1×，含DTT)將標準品pNA(10mM)稀釋為200、100、50、20、10、0μM的標準溶液。樣本制備注意：我們建議使用新鮮樣品?；虬凑铡皹颖局苽洹睂悠繁４嬖?80℃。使用前，在冰上解凍，這可能會影響樣品的穩(wěn)定性，并且讀數(shù)可能會低于預期。此試劑盒可檢測蛋白水解活性。在樣品制備步驟中請勿使用蛋白酶抑制劑，它可能會干擾測定。1.通過所需方法誘導細胞凋亡。同時，建議對每個Caspase-3比色測定法設置不的對照培養(yǎng)。2.對于貼壁細胞，胰蛋白酶消化收集細胞。600g，4℃離心5min，小心吸去上清液。用1mLPBS洗滌細胞2次。離心后，去除上清液。在50μLWorkingCellLysisBuffer中重懸1-5×106個細胞。3.對于懸浮細胞，600g，4℃離心5min，小心吸去上清液。用1mLPBS洗滌細胞2次。離心后，去除上清液。在50μLWorkingCellLysisBuffer中重懸1-5×106個細胞。4.對于組織，將5-20mg組織切成小塊，用PBS清洗組織，加入0.1mLWorkingCellLysisBuffer，冰浴勻漿。5.裂解物冰上孵育15-20min。6.16,000g，4℃離心15min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新試管中，置冰上待測。7.立即測定Caspase-3的酶活性或-80℃保存樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟1.酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到405nm。2.操作表（下述操作在96孔板中操作）： 空白孔（μL） 標準孔（μL） 測定孔（μL）WorkingReactionBuffer(1×，含DTT) 100 50 50Standard 0 50 0上清 0 0 50Ac-DEVD-pNA(4mM) 5 5 53.混勻，37℃孵育1-2h，檢測405nm處吸光值。空白孔記為A空，標準孔記為A標、測定孔記為A測。計算ΔA測=A測-A空，ΔA標=A標-A空。注意：1.空白孔只需測定1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗；2.在反應體系中，適當混勻，注意避免在混勻時產(chǎn)生氣泡；3.發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定405nm的波長。如果顏色變化不明顯，可以適當延長孵育時間，甚至可以孵育過夜。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖н^程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。1.按標準曲線計算以標準溶液濃度為x軸，ΔA標為y軸，繪制標準曲線y=kx+b。將樣本的ΔA測帶入方程得到x值（μM）。2.按酶活性增加百分比計算Caspase-3活性增加百分比=(實驗處理組A測定-A空白)/(實驗對照組A測定-A空白)×100%該方法簡單可靠，可粗略反應酶活性情況。3.按酶活計算參考Chemicon公司的Caspase酶活力單位的定義：Oneunitistheamountofenzymethatwillcleave1.0nmolofthecolorimetricpNA-substrateperhourat37℃undersaturatedsubstrateconcentrations。即一個酶活力單位定義為當?shù)孜镲柡蜁r,在37℃一個小時內(nèi)可以剪切1nmolpNA底物產(chǎn)生1nmol游離pNA的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的Caspase酶活性。Caspase-3活性(U/mgprot)=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×103=2.1×x÷Cpr÷TV反總：反應體系總體積，0.105mL=1.05×10-4L；V樣：加入的樣本體積，0.05mL；T：反應時間，h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；103：單位換算系數(shù)，1μmol=103nmol。注意：對于樣品中Caspase-3酶活力特別高的情況，須用WorkingCellLysisBuffer適當稀釋樣品后再進行測定。計算時再乘以稀釋的稀釋倍數(shù)n。結(jié)果展示典型標準曲線--以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標