DB31-T 1377.5-2022 實驗雞和鴨 第5部分：遺傳質(zhì)量控制

實驗雞和鴨第5部分：遺傳質(zhì)量控制Laboratorychickenand上海市市場監(jiān)督管理局IDB31/T1377.5—2022 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14封閉群雞和鴨的引種及繁殖方式 15封閉群的遺傳質(zhì)量監(jiān)測 25.1抽樣 25.2檢測方法 25.3監(jiān)測頻率 2 26.1計算 26.2位點分析 2 2附錄A(規(guī)范性)實驗雞微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法 3附錄B(規(guī)范性)實驗鴨微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法 6參考文獻(xiàn) 8Ⅲ本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB31/T1377《實驗雞和鴨》的第5部分。DB31/T1377已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：微生物學(xué)監(jiān)測；—第2部分：寄生蟲監(jiān)測；——第3部分：配合飼料營養(yǎng)成分；-----第4部分：設(shè)施及環(huán)境；請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由上海市科學(xué)技術(shù)委員會提出并組織實施。本文件由上海市實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：上海實驗動物研究中心、北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司、上海交通大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所、上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化是實驗動物科學(xué)研究高質(zhì)量發(fā)展的基礎(chǔ)工作，只有實現(xiàn)實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化，動物實驗結(jié)果才具有均一性、可重復(fù)性及可比性。標(biāo)準(zhǔn)的研究、制定與發(fā)布實施是開展實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化管理的重要依據(jù)，也是促進(jìn)實驗動物資源整合優(yōu)化、開放共享的基礎(chǔ)保障。禽類實驗動物中最常用的是雞和鴨。DB31/T1377《實驗雞和鴨》是指導(dǎo)上海市禽類實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)性和通用性標(biāo)準(zhǔn)，由5個部分構(gòu)成?！?部分：微生物學(xué)監(jiān)測。規(guī)范了實驗雞和鴨需要監(jiān)測的微生物種類及相應(yīng)微生物的檢測方法。-第2部分：寄生蟲學(xué)監(jiān)測。規(guī)范了實驗雞和鴨的寄生蟲學(xué)監(jiān)測的檢測要求、檢測項目、檢測程序、檢測方法、檢測內(nèi)容和結(jié)果判定?！?部分：配合飼料營養(yǎng)成分。規(guī)范了實驗雞和鴨配合飼料的質(zhì)量要求、衛(wèi)生要求、營養(yǎng)成分、——第4部分：設(shè)施及環(huán)境。規(guī)范了實驗雞和鴨的環(huán)境及設(shè)施條件的建筑、工藝布局、飼養(yǎng)條件、廢物處理、運(yùn)輸及檢測等要求?！?部分：遺傳質(zhì)量控制。規(guī)范了實驗雞和鴨的繁殖方法、遺傳質(zhì)量監(jiān)測和結(jié)果判定。DB31/T1377《實驗雞和鴨》細(xì)化了實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)原有內(nèi)容，補(bǔ)充了關(guān)鍵性技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，為實驗雞和鴨質(zhì)量全面評價提供了基本參數(shù)，推動實驗動物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化和新資源共享服務(wù)，有利于保證動物實驗結(jié)果的可靠性和醫(yī)用生物材料的安全性驗證，并為進(jìn)一步完善我國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)體系等方面發(fā)揮作用。1本文件規(guī)定了實驗雞和鴨的繁殖方法、遺傳質(zhì)量監(jiān)測和結(jié)果判定。本文件適用于上海市封閉群實驗雞和鴨的遺傳質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB14923實驗動物哺乳類實驗動物的遺傳質(zhì)量控制NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義GB14923界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。以非近親交配方式進(jìn)行繁殖生產(chǎn)的，在不從外部引入新個體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代的種群。h某一基因座上的等位基因是雜合體的頻率。特定位點上一種等位基因占該位點全部等位基因的比率。個體的等位基因來自共同的祖先基因的概率。4封閉群雞和鴨的引種及繁殖方式主要生物學(xué)特征。4.2應(yīng)保持基因多態(tài)性，避免近交系數(shù)隨繁殖代數(shù)增加而過快上升。4.3采用最佳避免近交法、循環(huán)交配或隨機(jī)交配法。4.4種群的雄雌個體比例宜為1:8～1:10。2每個世代每個種群至少利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記方法進(jìn)行1次監(jiān)測。3實驗雞微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)又被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeats,STR)或簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,SSR),是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列，由2個~6個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成。重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，常用于群體遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)分析。通常通過PCR擴(kuò)增，利用特定軟件對擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小作為等位基因進(jìn)行檢測。A.2試劑按照NY/T541的規(guī)定，從雞翅靜脈采集被檢實驗雞的抗凝血提取基因組DNA。將聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)推薦的用于雞遺傳多樣性分析的14對微衛(wèi)星標(biāo)記，依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，分成2個組，分別標(biāo)記熒光素HEX和FAM,同組內(nèi)的位點可同時進(jìn)行基因型檢測。位點信息見表A.1。表A.1實驗雞遺傳檢測微衛(wèi)星位點信息及分組引物序列片段大小熒光標(biāo)記退火溫度℃AGATCTCACCAGTATGAGCGATTGCTTCAGCAAGCATG4表A.1實驗雞遺傳檢測微衛(wèi)星位點信息及分組(續(xù))引物序列片段大小熒光標(biāo)記退火溫度℃B反應(yīng)程序：95℃5min;94℃30s,退火30s,72℃30s,30個~35個循環(huán)；72℃再延伸10min;A.4PCR產(chǎn)物的檢測用滅菌去離子水將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物適量稀釋。取稀釋產(chǎn)物2μL和含分子量標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液8μL混合，95℃變性5min,立即置于冰上，5min后電泳。在測序儀上完成PCR產(chǎn)物的電泳檢測，利用軟件收集電泳結(jié)果，進(jìn)行PCR產(chǎn)物分子量分析和基因型的判定。A.5數(shù)據(jù)分析雜合度的計算見公式(A.1):h雜合度；p;某個位點的第i個等位基因的樣本頻率；n檢測樣本中序列的數(shù)量。5A.5.2近交系數(shù)近交系數(shù)的計算見公式(A.2):式中：F,FA——個體x的近交系數(shù)；—-各代遺傳結(jié)構(gòu)的半數(shù)；父親到共同祖先的代數(shù)；——母親到共同祖先的代數(shù)；—共同祖先自身的近交系數(shù)；親本相關(guān)通徑鏈中的個體數(shù)。6(規(guī)范性)實驗鴨微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法B.1基因組DNA提取鴨腿靜脈或蹼靜脈采集被檢實驗鴨的抗凝血，提取基因組DNA。B.2PCR反應(yīng)體系反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,50℃~64℃退火30s,72℃延伸30s,30個~35個循環(huán)；72℃再延伸10min;2℃~8℃保存。B.3PCR產(chǎn)物檢測上樣緩沖液混勻，根據(jù)其產(chǎn)物片段的大小分別用2%～2.5%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。上樣前，根據(jù)檢測結(jié)果用滅菌去離子水將PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋適宜倍數(shù)后，取稀釋產(chǎn)物2μL和含分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的上樣緩沖液8μL混合，95℃變性5min,取出后立即置于冰上。5min后，將變性的PCR產(chǎn)物上樣，電泳，收集熒光信號，形成膠圖，進(jìn)行數(shù)據(jù)提取、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定和PCR產(chǎn)物片段大小的計算，以及基因型的判定。B.4數(shù)據(jù)分析采用生物統(tǒng)計學(xué)軟件計算群體等位基因和基因頻率。其他同A.5。B.5結(jié)果判定結(jié)合飼養(yǎng)管理，在未從外部引入新個體的條件下已連續(xù)繁殖4個世代以上，則判為符合實驗用(見表B.1實驗鴨遺傳檢測微衛(wèi)星位點信息及分組引物序列(5'→3')片段大小/熒光標(biāo)記℃AACAATAGATTCCAGATGCT7表