DB31-T 955-2022 豬圓環(huán)病毒3型實時熒光PCR 檢測方法

代替DB31/T955—2015豬圓環(huán)病毒3型實時熒光PCR檢測方法上海市市場監(jiān)督管理局IDB31/T955—2022前言 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4原理 1 2 28樣品采集與處理 2 310實時熒光PCR檢測 附錄A(規(guī)范性)溶液配制 5附錄B(規(guī)范性)引物和探針 7 8本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件代替DB31/T955—2015《豬圓環(huán)病毒2a/2b亞型實時熒光PCR檢測和分型方法》,與——增加了耗材(見第6章);——更改了試劑(見第7章，2015年版的第6章);——增加了糞便樣品采集方法(見第8章);——刪除了注意事項(見2015年版的第9章);——更改了附錄A(見附錄A,2015年版的第6章);—更改了DNA提取方法(見附錄C,2015年版的附錄A);——增加了熒光PCR反應體系(見附錄D)。本文件由上海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出并組織實施。本文件由上海市畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。本文件所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——DB31/T955—2015。H1豬圓環(huán)病毒3型實時熒光PCR檢測方法1范圍本文件規(guī)定了豬圓環(huán)病毒3型實時熒光PCR檢測方法的儀器設備、耗材、試劑、樣品采集與處理、DNA提取和實時熒光PCR檢測等技術要求。本文件適用于豬圓環(huán)病毒3型核酸檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法下列術語和定義適用于本文件。豬圓環(huán)病毒3型porcinecircovirustype3;PCV3屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬新發(fā)豬病毒性傳染病病原，表現(xiàn)為豬皮炎與腎病綜合征的臨床病癥。開放閱讀框openreadingframe;ORF從起始密碼子開始，是DNA序列中具有編碼蛋白質(zhì)潛能的序列，結束于終止密碼子連續(xù)的堿基循環(huán)數(shù)閾值cyclethresholdvalue每個反應管內(nèi)的熒光信號量達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。根據(jù)PCV3ORF1序列，設計相應的引物和探針，建立實時熒光PCR檢測方法。5.1熒光PCR儀。5.2研缽或組織研磨器。5.4高速臺式冷凍離心機：可控溫至4℃,離心力可達12000r/min以上。25.6普通冰箱：2℃~8℃。7.3DNAzol,商品化DNA抽提試劑，于2℃~8℃保存。8.1.2研缽或組織研磨器，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。38.2.1血清樣品：用真空采血管采集受檢豬靜脈血2mL,室溫或者37℃傾斜放置自然凝集20min~30min,2000r/min離心5min,吸取不少于0.5mL上清液至1.5mL無菌離心管內(nèi)備用。8.2.2全血樣品：用EDTA真空抗凝管采集受檢豬靜脈血2mL,吸取1mL全血置于1.5mL無菌離心管內(nèi)備用。8.2.3拭子樣品：用無菌棉拭子反復刮擦呼吸道黏膜5次~10次，蘸取分泌物后將棉拭子放入5mL無菌離心管中，加入2mLPBS,浸泡20min~30min,振蕩、擠干拭子，浸泡液采用4000r/min離心1min,吸取1mL上清液至1.5mL無菌離心管內(nèi)備用。8.2.4精液樣品：取解凍或新鮮精液樣品1mL至1.5mL無菌離心管中，振蕩混勻，5000r/min離心30s,吸取不少于0.5mL上清液至新的1.5mL無菌離心管內(nèi)備用。8.2.6糞便樣品：取豬新鮮糞便1g,裝入15mL無菌離心管中，加入5mLPBS,混勻。8.2.7細胞培養(yǎng)物：細胞培養(yǎng)物反復凍融3次后，將細胞培養(yǎng)物置于1.5mL無菌離心管中，編號備用。8.3樣品保存和運輸依據(jù)8.1,8.2要求采集的樣品可立即用于檢測。不能立即檢測的樣品，在2℃~8℃下保存應不超過24h,-18℃及以下可以穩(wěn)定保存3個月，-70℃及以下可長期保存。樣品運送采用低溫保存進行8.4.2組織樣品：取1g組織樣品，剪碎，加8.4.3糞便樣品：5000r/min離心10min,吸取1mL上清液至1.5mL,無菌離心管內(nèi)備用。8.4.4細胞培養(yǎng)物：4000r/min離心5min,吸取1mL上清液至1.5mL無菌離心管內(nèi)備用。DNA提取方法按附錄C執(zhí)行。在試劑配制區(qū)內(nèi)進行。設實時熒光PCR反應管數(shù)為n,并宜按照n+1個反應進行配制，按照附錄D配制每個反應的體系。配制反應液在冰盒中進行。將10.1中配制的熒光PCR反應液充分混勻，按照每管20μL分裝于0.2mL,PCR光學反應管中，做好標識轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)。4在核酸提取區(qū)進行。在每個反應管內(nèi)加入待檢樣本的核酸5μL,500r/min~1000r/min離心30s。在檢測區(qū)進行。將10.3離心后的PCR管放入熒光PCR檢測儀中，設置報告熒光為HEX,采用其他報告熒光時應按儀器說明設定對應通道；淬滅熒光設定為None,校準熒光設定為None?？筛鶕?jù)不同品牌儀器說明等效設置參數(shù)。檢測分為三個階段：a)第一階段，95℃預變性3min;c)第三階段，25℃冷卻10s。檢測結束后，保存結果，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛超過正常陰性樣品擴增的最高點為準。陽性對照有典型S形擴增曲線，且Ct值≤30;陰性對照沒有擴增曲線，且無Ct值或Ct值>35;兩10.5.3.1陽性判定：被檢樣品檢測結果HEX通道Ct值≤30,且擴增曲線為典型的S形曲線，報告為10.5.3.2陰性判定：被檢樣品檢測結果HEX通道無Ct值或Ct值>35,且無典型的S形擴增曲線，報告為PCV3核酸陰性。10.5.3.3可疑判定：被檢樣品檢測結果30<Ct值≤35,且擴增曲線為典型的S形曲線，判定為可疑，可疑樣品重新檢測，如重復檢測結果仍然Ct值≤35,且擴增曲線為典型的S形曲線，報告為PCV3核酸陽5(規(guī)范性)A.1磷酸鹽緩沖液(0.01m用800mL蒸餾水溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa?HPO?和0.24gKH?PO?。用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加蒸餾水至1L。分裝后經(jīng)121℃、20min高壓滅菌后備用。A.22×PCR酶預混液配制2×PCR酶預混液，使其熱啟動Taq酶終濃度為160U/mL,Tris-HCl(pH8.4)終濃度為40mmol/L,KCl終濃度為100mmol/L,MgCl?終濃度為6mmol/L,dATP、dTTP、dGTP6(規(guī)范性)引物和探針引物、探針的名稱和序列見表B.1。表B.1引物、探針的名稱和序列名稱序列PCV3-F1(上游引物)PCV3-R1(下游引物)PCV3-P1(探針)5'-HEX-TACGATAAACAACTGGACCCC7(規(guī)范性)DNA提取方法C.1在核酸提取區(qū)操作。DNA抽提使用DNAzol試劑提取，也可以使用等效商品化試劑盒提取。C.2取n個1.5mL滅菌離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對照+陰性對照，對每個離心管進行標號。C.3每管先加入800μLDNAzol,再分別加入被檢樣品、陽性對照、陰性對照各200μL,顛倒10次混勻，2℃~8℃10000r/min離心10min。C.4取900μL上清液，置于新的1.5mL滅菌離心管中，加入500μL無水乙醇，混勻，室溫放置3min,2℃~8℃10000r/min離心5min。C.5棄上清液，沿管