堿性蛋白酶（AKP）活性檢測試劑盒實驗解決方案

堿性蛋白酶（AKP）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理堿性蛋白酶（AKP）是指在堿性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的酶類，屬于絲氨酸蛋白酶。此外，該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵，具有轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一，廣泛應(yīng)用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。在堿性條件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸，酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍；鎢藍在680nm有特征吸收峰，測定680nm吸光度增加速率，從而計算AKP活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計（能測680nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、恒溫箱、制冰機、離心機、磁力攪拌器·去離子水·研缽或勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：ExtractionBuffer有毒且有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進行實驗。ReagentI：臨用前配制；48T加入3mL去離子水，96T加入6mL去離子水，充分溶解，用不完的試劑4℃避光可以保存1周。ReagentII：臨用前配制；48T加入5mLExtractionBuffer，96T加入10mLExtractionBuffer，沸水浴中磁力攪拌溶解（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱15-30min，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用），用不完的試劑4℃避光可以保存1周。ReagentIII：臨用前配制；48T加入14mL去離子水，96T加入28mL去離子水，充分溶解，用不完的試劑4℃可以保存1個月。ReagentIV：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。Stardard：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。動物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待測。細菌和真菌：收集500萬細菌或真菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細菌或真菌，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細菌或真菌3min（功率30%或300W，超聲3s，間隔7s），然后8,000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標(biāo)儀或可見光分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到680nm，可見光分光光度計用去離子水調(diào)零。ReagentI、II、III置于40℃孵育30min。操作表（下述操作在1.5mL離心管中進行）：試劑空白管（μL）標(biāo)準(zhǔn)管（μL）測定管（μL）對照管（μL）粗酶液002020ReagentI040ReagentII400混勻后置于40℃孵育10minReagentI400ReagentII040混勻后8,000g，4℃離心10min，取上清，在新的EP管中加入以下試劑上清液004040Standard04000去離子水40000ReagentIII200200200200ReagentIV40404040混勻后置于40℃孵育20min取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，記錄680nm處吸光值，分別記為A測定、A對照、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白，計算ΔA測定=A測定-A對照、ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：每個測定管需設(shè)一個對照管，標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做1-2次。如果樣本的ΔA測定小于0.01，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間（20-30min），即第一步水浴時間，最后計算酶活時對公式進行修改，如果樣本的ΔA測定大于1.0，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，再進行實驗，乘以最終的稀釋倍數(shù)。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。AKP活性的計算：按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：40℃每mg蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol酪氨酸為1個酶活單位。AKP(U/mgprot)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(Cpr×V反)÷T=0.125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：40℃每g樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1μmol酪氨酸為1個酶活單位。AKP(U/g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(W×V反÷V提)÷T=0.125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W按照細菌或真菌數(shù)量計算酶活單位定義：40℃每104個細菌或真菌每分鐘催化水解產(chǎn)生1μmol酪氨酸為1個酶活單位。AKP(U/104)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(n×V反÷V提)÷T=0.125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷n按樣本體積計算：酶活單位定義：40℃每mL樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1μmol酪氨酸為1個酶活單位。AKP(U/mL)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷V反÷T=0.125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)：0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，0.02mL；V提：加入ExtractionBuffer總體積，1mL；T：催化反應(yīng)時間，10min；W：樣品質(zhì)量，g；n：細菌或真菌數(shù)量，萬。結(jié)果展示Figure