（高清版）DB37∕T 3085-2017 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的R∕T-PCR鑒別檢測技術(shù)　　

DB37/T3085—2017高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測技術(shù)2017-12-29發(fā)布2018-01-29實施IDB37/T3085—2017本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：杜以軍、齊靜、叢曉燕、陳蕾、孫文博、陳智、郭立輝、于江、吳家強(qiáng)、李俊、時建立。1DB37/T3085—2017高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測技術(shù)的操作要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于高致病性及經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征的實驗室診斷、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等。2實驗室生物安全要求實驗室必須為生物安全Ⅱ級(BSL-2級)及以上實驗室。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫4術(shù)語與定義下列術(shù)語與定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。十二烷基硫酸鈉。5儀器設(shè)備和試劑5.1儀器設(shè)備5.1.1微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭。5.1.220000r/min低溫高速離心機(jī)。5.1.3電熱恒溫水槽。5.1.4穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀。5.1.5水平電泳槽。2DB37/T3085—20175.1.6凝膠成像系統(tǒng)。5.1.9燒杯(1000mL)。5.1.10電子天平精度為：0.001g。5.1.12組織勻漿器或研缽。5.1.142℃~8℃冰箱。5.2試劑除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。5.2.375%乙醇。5.2.6RNA酶抑制劑(40U/μL)。5.2.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。5.2.81.0%瓊脂糖凝膠：見附錄A.1。5.2.950×TAE緩沖液：見附錄A.2.1和A.2.2。5.2.10焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水：見附錄A.3。5.2.12超純水：符合GB/T6682,三級。經(jīng)典毒株擴(kuò)增片段長度大小為766bp,高致病性毒株擴(kuò)增基因片段大小為676bp。6操作程序6.1樣品的采集和處理6.1.1樣品的采集臨床上豬的脾、肺、淋巴結(jié)、血液等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。6.1.2樣品的處理6.1.2.1取豬的脾、肺、淋巴結(jié)等組織約5g于研缽中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS緩沖液，研磨；血液3000r/min離心5min,分離血清。6.1.2.2陽性對照處理：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的疫苗株和經(jīng)典毒株的疫苗株。6.1.2.3陰性對照處理：滅菌雙蒸水。6.2RNA的提取-Trizol法3DB37/T3085—20176.2.1向處理好的300μL組織樣品或血清中加入800μLTrizol,重復(fù)吹打以裂解細(xì)胞(或者劇烈振蕩),冰上放置10min～25min。6.2.2加入氯仿200μL,用力振蕩30s,室溫放置5min。6.2.34℃,12000r/min離心15min,吸取上層液體500μL于1.5mLEP管中。6.2.54℃12000r/min離心10min,棄上清，用75%的乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min,徹底棄去上清，自然條件下干燥沉淀，溶于50μLDEPC處理的滅菌雙蒸水中，-20℃貯存，備用。也6.2.6試驗中同時設(shè)立高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的疫苗株和經(jīng)典毒株的疫苗株作為陽性對照和滅菌雙蒸水作為陰性對照。6.3反轉(zhuǎn)錄序號體系組成體系含量1RNA22.5mmol/L反轉(zhuǎn)錄引物(下游引物)32.5mmol/LdNTPs70℃保溫5min,冰浴2min。繼續(xù)加入。序號體系組成體系含量15×反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液2AMV反轉(zhuǎn)錄酶3RNA酶抑制劑4滅菌DEPC水瞬時離心后，42℃處理45min,95℃滅活10min。取出后直接進(jìn)行PCR,或置于-20℃保存?zhèn)溆?。序號體系組成體系含量1滅菌雙蒸水2反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7TaqDNA聚合酶4DB37/T3085—2017首先加入滅菌雙蒸水，然后按順序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混懸，瞬時離心，使液體都沉降到PCR管底。循環(huán)參數(shù)為95℃5min,94℃30s,54℃45s,72℃1min,循環(huán)30次，72℃延伸10min結(jié)束。也可選擇市售商品化RT-PCR試劑盒，完成反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。6.5.1制備1.0%瓊脂糖凝膠板，見附錄A.1。6.5.4蓋好電泳儀，插好電極，5V/cm電壓電泳，30min～40min。6.5.5用凝膠成像儀觀察、掃描圖片存檔。6.5.6用分子量標(biāo)準(zhǔn)比較判斷PCR片段大小。7.1在陽性對照出現(xiàn)766bp或者676bp擴(kuò)增帶、陰性對照無此擴(kuò)增帶時，實驗結(jié)果成立(參見附錄A.4)。7.2被檢樣品擴(kuò)增片段長度大小為766bp則判定為經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，擴(kuò)增基因片段大小為676bp則判定為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株(參見附錄A.5)。5DB37/T3085—2017(規(guī)范性附錄)試劑的配制A.11.0%瓊脂糖凝膠的配制試劑名稱用量瓊脂糖0.5×TAE電泳緩沖液加至100mL微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃時，加溴化乙錠(EB)溶液5μL,搖勻，倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)試劑名稱用量二水乙二銨四乙酸二鈉滅菌雙蒸水氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.2.2TAE電泳緩沖液(50×)配制表A.3TAE電泳緩沖液(50×)配制試劑名稱用量三羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸57.1mL0.5mol/L