過(guò)氧化氫（H2O2）含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

過(guò)氧化氫（H2O2）含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理過(guò)氧化氫（H2O2）是生物體內(nèi)最常見(jiàn)的活性氧分子，是一種活性氧代謝的副產(chǎn)物，主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生，由CAT和POD等催化降解。過(guò)氧化氫不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面，過(guò)氧化氫也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。過(guò)氧化氫可以激活NF-κB等因子，這些過(guò)氧化氫相關(guān)的信號(hào)途徑和哮喘、炎癥性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈硬化以及神經(jīng)退行性疾病等許多疾病相關(guān)。過(guò)氧化氫也和細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等密切相關(guān)。CheKine?過(guò)氧化氫（H2O2）含量檢測(cè)試劑盒（微量法），提供了一種簡(jiǎn)單易用的方法，用于測(cè)量血清、血漿、細(xì)胞、組織和其它生物液體中H2O2含量。試劑盒利用過(guò)氧化氫氧化二價(jià)鐵離子產(chǎn)生三價(jià)鐵離子，然后和xylenolorange（二甲酚橙）在特定的溶液中形成紫色的產(chǎn)物，在580nm的OD值與過(guò)氧化氫濃度成正比，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)過(guò)氧化氫濃度的測(cè)定。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)（能測(cè)580nm處的吸光度）及水浴鍋·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·離心機(jī)·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）·10kDa的超濾管或30%ZnSO4溶液（用來(lái)去除蛋白）試劑準(zhǔn)備ReactionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，避光放置；建議分裝保存在-20℃避光保存。H2O2Standard(1M)：即用型；使用前，平衡到室溫；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，避光放置；建議分裝保存在-20℃避光保存。AssayBuffer(1×):使用前，平衡到室溫；AssayBuffer(10×)用去離子水1:10稀釋后作為工作液。AssayBuffer(1×)可在4℃保存至少2個(gè)月，并用來(lái)稀釋H2O2標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。標(biāo)準(zhǔn)品制備：先配制2mMH2O2Standard：2μL1M的H2O2Standard用998μL的AssayBuffer(1×)稀釋?zhuān)辉倥渲?00μMH2O2Standard：50μL2mM的H2O2Standard用950μL的AssayBuffer(1×)稀釋。配制好的標(biāo)準(zhǔn)品需要在4h之內(nèi)使用。100μMH2O2Standard，按照下表所示，進(jìn)一步稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。序號(hào)100μMStandard（μL）AssayBuffer(1×)（μL）Concentration（μM）Std.12000100Std.210010050Std.34016020Std.42018010Std.5101905Std.641962Std.721981Blank02000注意：每次實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品；配制好的標(biāo)準(zhǔn)品需要在4h之內(nèi)使用；如果樣本是細(xì)胞懸浮液，建議使用培養(yǎng)基配制H2O2標(biāo)準(zhǔn)品。樣本制備動(dòng)物組織：用冷的PBS清洗組織，盡可能去除血液。吸干組織上的水分，稱(chēng)取0.1g，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer(1×)，將樣本冰上進(jìn)行勻漿。10,000g，4℃離心5min，取上清液做進(jìn)一步分析。植物組織：稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer(1×)搗碎，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），10,000g，4℃離心5min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞和細(xì)菌樣本的制備：收集5×106個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌，用冷PBS清洗細(xì)胞或細(xì)菌后，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer(1×)冰上進(jìn)行勻漿或冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次）。10,000g，4℃離心5min，取上清液做進(jìn)一步分析。血清、血漿、尿液（和其它生物學(xué)液體）：去除蛋白后，取上清。去除蛋白的方式：可使用10kDa的超濾管過(guò)濾后取濾液或是將樣本：30%ZnSO4溶液=20:1進(jìn)行混合后渦旋，再10,000g室溫離心5min，取上清。注意：建議使用新鮮樣本。如果不能馬上進(jìn)行該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，建議將樣本儲(chǔ)存在-80℃保存1個(gè)月。當(dāng)準(zhǔn)備好進(jìn)行該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，將樣本從-80℃拿出后，冰上解凍，但是請(qǐng)注意，這可能會(huì)影響樣本的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)低于預(yù)期；如下物質(zhì)會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，樣本中應(yīng)避免存在：Ferricsalts,ironsalts,sucrose,glucose,ascorbicacid,SDS(>0.2%),sodiumazide。該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1500的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到580nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：試劑標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測(cè)定孔（μL）不同濃度Stds.600樣本060ReactionBuffer4040充分混勻，37℃孵育10min，讀取580nm處的吸光值，記為A空、A標(biāo)、A測(cè)，計(jì)算ΔA標(biāo)=A標(biāo)-A空、ΔA測(cè)=A測(cè)-A空。注意：1.Std.Blank即為空白孔。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。2.如果ΔA測(cè)大于濃度為100μM標(biāo)準(zhǔn)品的ΔA標(biāo)，則需要用AssayBuffer(1×)稀釋樣本后，重新檢測(cè)。如果樣本的ΔA測(cè)低于0.005，可提高樣本量。結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣本H2O2濃度計(jì)算將ΔA測(cè)代入公式計(jì)算出y(1μM=1nmol/mL)。按樣本鮮重計(jì)算H2O2含量(nmol/g鮮重)=y×V樣÷(W×V樣÷V樣總)×n=y÷W×n按樣本體積計(jì)算H2O2含量(nmol/mL)=y×V樣÷V樣×n=y×n按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算H2O2含量(nmol/104)=y×V樣÷(細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×V樣÷V樣總)×n=y÷500×nV樣：加入樣本體積，0.025mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入AssayBuffer(1×)體積，1mL；n：樣本稀釋倍數(shù)；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)和曲線(xiàn)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[HydrogenPeroxide][HydrogenPeroxide],μMΔAΔA標(biāo)Figure1.H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相