DNARNA合成常見(jiàn)問(wèn)題解答

/DNA/RNA合成常見(jiàn)問(wèn)題解答

處理和保存

1.如何保存寡核苷酸?

2.如何重懸寡核苷酸?

3.如果寡核苷酸在室溫中放置超過(guò)一星期，還可以使用嗎?

4.熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸，在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中必須特殊處理嗎?

純化和濃縮

5.如何定量合成的寡核苷酸?

6.如何通過(guò)紫外吸光度值來(lái)定量寡核苷酸?

7.如一個(gè)18個(gè)堿基的寡核苷酸包括3個(gè)dG,4個(gè)dC,5個(gè)dA和6個(gè)dT,OD值是0.7，那

么它的量是多少?

8.如何計(jì)算寡核苷酸的分子量?

9.如何測(cè)定寡核苷酸的質(zhì)量?

10.如何測(cè)定寡核苷酸的質(zhì)量?

11.如何測(cè)定合成的寡核苷酸的Tm值?

12.為什么Bioneer提供的Tm值和我們的Tm值不同?

13.用什么方法調(diào)整寡核苷酸的濃度?

14.單位換算表

合成與訂購(gòu)

15.如何合成寡核苷酸?

16.標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸結(jié)構(gòu)

17.Bioneer能合成的最長(zhǎng)的寡核苷酸是多長(zhǎng)?

18.當(dāng)我預(yù)訂50nmol的寡核苷酸，產(chǎn)品卻缺乏50nmol，為什么?

19.能合成出高百分比“G〞的寡核苷酸嗎?

20.能提供寡核糖核酸(RNA)合成嗎?

21.合成的寡核苷酸在3'或5'位有磷酸基嗎?

22.簡(jiǎn)并引物及通用引物是什么?

純化方法

23.怎樣純化合成的寡核苷酸?

24.用于芯片分析的60mer寡核苷酸如何被純化呢?

修飾寡核苷酸

25.修飾寡核苷酸

26.作為反義脫氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸

實(shí)驗(yàn)

27.怎樣制備雙鏈DNA?Q1.如何保存寡核苷酸？

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通常，寡核苷酸應(yīng)該-20℃保存，該溫度下能穩(wěn)定保存一年以上。寡核苷酸在溶液中較為穩(wěn)定，但易被污染的核酸酶降解，因此我們建議應(yīng)枯燥儲(chǔ)存。若要以溶液形式儲(chǔ)存，最好將其分裝在幾管中分別保存，反復(fù)凍融會(huì)使寡核苷酸降解。另外，酸性條件下，DNA會(huì)因?yàn)槊撪堰首饔枚到猓粔A性條件會(huì)使磷酸二酯鍵水解斷裂。

Q2.如何重懸寡核苷酸？

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為便于長(zhǎng)期保存，我們建議使用TE緩沖液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)，而不用無(wú)菌水來(lái)溶解寡核苷酸。重懸后，寡核苷酸應(yīng)該在-20癈保存以長(zhǎng)期使用。寡核苷酸在無(wú)菌水中很難溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。

Q3.如果寡核苷酸在室溫中放置超過(guò)一星期，還可以使用嗎？

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脫水的寡核苷酸是長(zhǎng)期穩(wěn)定的。即使在溶液狀態(tài)寡核苷酸也相當(dāng)穩(wěn)定，通常情況(沒(méi)有引入使寡核苷酸降解的污染物)即使在室溫中放置超過(guò)一星期也能使用。

Q4.熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸，在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中必須特殊處理嗎？

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如果暴露在光線下，熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸比未標(biāo)記的寡核苷酸更易降解，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸降低。為了保持其熒光效能，熒光染料標(biāo)記的核苷酸應(yīng)避光-20℃保存。由于Cy3和Cy5在pH大于9時(shí)易被降解，所以Cy3和Cy5修飾

Q5.如何定量合成的寡核苷酸?

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合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接稱(chēng)重來(lái)定量。通常通過(guò)測(cè)量紫外吸光度值(OD值)來(lái)定量。

Q6.如何通過(guò)紫外吸光度值來(lái)定量寡核苷酸？

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寡核苷酸的量經(jīng)常用OD值來(lái)描述。1個(gè)OD值是體積1ml寡核苷酸溶液，在內(nèi)徑1cm的比色杯中的吸光度值，約為33mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。因?yàn)樵?60nm處單個(gè)堿基的吸光度值是的，所以序列的寡核苷酸的濃度就可以測(cè)定。dT:8.8ml/μmoldG:11.7ml/μmoldC:7.3ml/μmoldA:15.4ml/μmol

對(duì)于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每個(gè)堿基的數(shù)目乘以它的吸光系數(shù)，然后將4種堿基的結(jié)果加起來(lái)就是整個(gè)寡核苷酸的吸光度。它的濃度可通過(guò)下式來(lái)計(jì)算：O.D.=εC(內(nèi)徑1cm的比色杯)

Q7.如一個(gè)18個(gè)堿基的寡核苷酸包括3個(gè)dG,4個(gè)dC,5個(gè)dA和6個(gè)dT,OD值是0.7，那么它的量是多少？

↑TOP首先，用下面公式計(jì)算18個(gè)堿基的寡核苷酸的吸光度是多少：εmmole然后，通過(guò)下式來(lái)計(jì)算寡核苷酸的濃度：O.D.=εC，C=O.D./εCC=0.7/194.1=0.0036(μmol/ml)=3.6(nmol/ml)最后，OD值為0.7的18個(gè)堿基寡核苷酸的濃度是3.6nmol。

Q8.如何計(jì)算寡核苷酸的分子量?

↑TOP寡核苷酸的分子量可以通過(guò)下式進(jìn)行計(jì)算：M.W.=(NA×249.2)+(NC×225.2)+(NG×265.2)+(NT×240.2)+(寡核苷酸長(zhǎng)度-1)×63.98+2.02NA=總A數(shù)NC=總C數(shù)NG=總G數(shù)NT=總T數(shù)

Q9.如何測(cè)定寡核苷酸的質(zhì)量?

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通常，合成的寡核苷酸的質(zhì)量用摩爾數(shù)來(lái)描述，常用nmol。用寡核苷酸的摩爾數(shù)或寡核苷酸的分子量可以計(jì)算寡核苷酸的量：

寡核苷酸質(zhì)量(ng)=分子量(M.W.)×摩爾數(shù)(nmol)

Q10.如果不知道寡核苷酸的堿基組成，有什么方法來(lái)定量合成的寡核苷酸？

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Q11.如何測(cè)定合成的寡核苷酸的Tm值?

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Tm(解鏈溫度)是指50%雙鏈被解開(kāi)成單鏈時(shí)的溫度。寡核苷酸濃度和鹽濃度會(huì)影響Tm值的大小。來(lái)計(jì)算。用這種方法計(jì)算前，也有多種方法來(lái)估測(cè)。如果是15個(gè)堿基以下，那么有一種好的方法來(lái)估算，對(duì)于A和T，可以乘以2癈，對(duì)于C和G，可以乘以4癈然后相加，這叫做Wallace法則。Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)另一種方法來(lái)估計(jì)長(zhǎng)鏈中GC含量Tm=81.5+0.41(%GC)-500/L+16.6log[M](L:寡核苷酸的長(zhǎng)度；M:1價(jià)陽(yáng)離子的濃度)

但這些方法不能消除堿基堆積的影響，結(jié)果并不準(zhǔn)確，所以近鄰法被廣泛的應(yīng)用。但是，對(duì)于在60-70bp或15bp以下的寡核苷酸的測(cè)定，近鄰法還是有缺點(diǎn)。

Bioneer使用的近鄰法具有新的特點(diǎn)。它考慮到在退火過(guò)程中不同的堿基序列的影響，并且通過(guò)熱力學(xué)來(lái)測(cè)定，可以更有效的測(cè)定Tm值。比方5'-GC-3'和5'-CG-3'的序列用熱力學(xué)方法測(cè)定結(jié)果是不同的。計(jì)算方法如下：

依靠熱力學(xué)方法，焓和熵通過(guò)兩個(gè)堿基來(lái)確定。[salt]是指一價(jià)陽(yáng)離子的濃度，[Oligo]是指反應(yīng)過(guò)程中的寡核苷酸濃度。R是指氣體常數(shù)(1.987cal·K-1mol-1)。Bioneer用近鄰法計(jì)算Tm值時(shí)，使用的是50mM的鹽濃度和1nM的寡核苷酸的濃度。

Bioneer會(huì)給每一個(gè)用戶(hù)提供Tm值，但這只是估計(jì)值，我們不能保證精確性，因此這個(gè)值僅供用戶(hù)參考。如果沒(méi)有擴(kuò)增出產(chǎn)物，你可以把退火溫度降到Tm值以下4～5癈。如果有許多非特異性的產(chǎn)物，你需要改變實(shí)驗(yàn)條件如提高退火溫度以得到正確的產(chǎn)物。

Q12.為什么Bioneer提供的Tm值和我們的Tm值不同?

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Bioneer使用的Tm值的計(jì)算方法和我們通常的計(jì)算方法是不同的。我們通常只是簡(jiǎn)單的乘以A、G、C、T的數(shù)目，但序列不同堿基的Tm值亦會(huì)不同。如Tm值取決于序列中的每一個(gè)堿基，即使堿基數(shù)相同但序列不同時(shí)，Tm值也將不同。

Q13.用什么方法調(diào)整寡核苷酸的濃度？

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首先，在Bioneer提供的數(shù)據(jù)表或報(bào)告單中的100pmol/靗，是用來(lái)參加TE緩沖液或無(wú)菌水，以使管中寡核苷酸的終濃度到達(dá)100pmol/靗。例如,數(shù)據(jù)表或報(bào)告單中是189.0和209.2時(shí)，則應(yīng)向兩個(gè)管中分別參加相應(yīng)量的無(wú)菌水,即可使每個(gè)管中的寡核苷酸濃度到達(dá)100pmol/μl。每一個(gè)管中寡核苷酸含量通過(guò)下式可以計(jì)算如下：189.0μl×100pmol/μl=18,900pmol=18.9nmol,209.2μl×100pmol/μl=20,920pmol=20.92nmol如果所要的終濃度是0.5μM，pmol/μl需要換μM。100pmol/μl=100×106

pmol/106μl=100×106×10-12

mol/L=10-4

mol/L=10-4

×106μmol/L=102μmol/L=100μM終濃度換算為100μM，如果需要的濃度是0.5μM的，參加終體積的1/200的引物量，以使引物終濃度為0.5μM。PCR反應(yīng)的終體積是50μl，所以需要加50/200=0.25μl的引物，以使終濃度到達(dá)0.5μM。Q14.單位換算表

↑TOP科學(xué)系統(tǒng)單位:

10-1=deci[d]

101=deca[da]

10-2=centi[c]

102=hecto[h]

10-3=milli[m]

103=kilo[k]

10-6=micro[m]

106=mega[M]

10-9=nano[n]

109=giga[G]

10-12=pico[p]

1012=tera[T]

10-15=femto[f]

1015=peta[P]

10-18=atto[a]

1018=exa[E]

10-21=zepto[z]

1021=zetta[Z]

10-24=yocto[y]

1024=yotta[Y]寡核苷酸單位換算的例子:1pmol/μl=1×10-12mol/1×10-6L=1×10-6mol/L=1μmol/L=1μM

Q15.如何合成寡核苷酸?

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目前最流行的用于合成寡核苷酸的方法是通過(guò)使用“亞磷酸三3'-5'Koster發(fā)現(xiàn)了β-氰乙基亞磷酰胺并作為構(gòu)建單體，現(xiàn)在普遍的用于寡核苷酸的合成(Nucl.AcidsRes.1984,12,4539;TetrahedronLett.1983,24,5843)。通過(guò)“亞磷酸三脂〞的方法使用β-氰乙基亞磷酰胺，合成效率能夠到達(dá)(98%)而合成時(shí)間比其它寡核苷酸的合成方法更短。而且，由于單體β-氰乙基亞磷酰胺在激活以前很穩(wěn)定，這是對(duì)合成寡核苷酸來(lái)說(shuō)所必需的，他們能儲(chǔ)存更長(zhǎng)的時(shí)間。當(dāng)寡核苷酸共價(jià)的連接在固相載體上就可以使其不被過(guò)量溶解β-氰乙基亞磷酰胺和結(jié)合試劑的作用下，寡核苷酸被合成。在各種各樣的固相載體中，可控孔度玻片已經(jīng)在近年廣泛使用了，這種玻片是由均勻的玻璃基質(zhì)組成，上面有固定尺寸的孔。

整個(gè)寡核苷酸的合成通過(guò)一系列的反應(yīng)完成，其中包括四個(gè)循環(huán)反應(yīng)：脫保護(hù)，連接，氧化，加帽。脫保護(hù)

通過(guò)第一個(gè)循環(huán)—脫保護(hù)，CPG裂解出5'保護(hù)基團(tuán)DMT。酸性條件對(duì)于脫保護(hù)是必需的，通常使用3％三氯乙酸。據(jù)報(bào)道，寡核苷酸在酸性環(huán)境中易脫嘌呤，尤其是對(duì)于腺苷。因?yàn)槿纫宜嵊泻軓?qiáng)的酸性，所以用三氯乙酸脫保護(hù)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間不應(yīng)該太長(zhǎng)。比起三氯乙酸，二氯乙酸酸性較弱，能夠在一些情況下防止脫嘌呤問(wèn)題。脫保護(hù)后產(chǎn)生的DMT陽(yáng)離子呈現(xiàn)出一種深橘色。通過(guò)測(cè)定吸光度，來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)效率。連接

脫保護(hù)后，CPG上的5'-羥基暴露，結(jié)合核苷β-氰乙基亞磷酰胺，三亞磷酸酯氧化變成磷酸三脂，然后按順序連接。對(duì)于核苷β-氰乙基亞磷酰胺，為了防止合成寡核苷酸過(guò)程中負(fù)反應(yīng)的發(fā)生，堿基的環(huán)外氨基被保護(hù)以免形成酰胺結(jié)構(gòu)。苯甲?；糜诒Ｗo(hù)酰苷和胞苷。另一方面，異丁酰基用于鳥(niǎo)苷堿基保護(hù)。胸苷堿基中沒(méi)有環(huán)外的胺基，所以不需要保護(hù)。β-氰乙基亞磷酰胺用于保護(hù)所有核苷的5'-羥基。

因?yàn)楹塑?-氰乙基亞磷酰胺在正常條件下非常穩(wěn)定，不能直接和正在合成鏈上游離的5'-羥基功能基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。所以，它們必須首先通過(guò)一種弱酸性激活劑激活。在各種激活劑中，四唑作為標(biāo)準(zhǔn)激活劑具有很強(qiáng)的激活作用。四唑已經(jīng)被認(rèn)為具有雙重作用：它質(zhì)子化2-氰乙基亞磷酰胺的二異丙氨基，產(chǎn)生親核基團(tuán)，形成具有活性的四唑膦中間產(chǎn)物。用這種被激活的核苷亞磷酰胺試劑耦聯(lián)反應(yīng)快(不到2分鐘)，產(chǎn)量高。氧化

新合成的亞磷酸鹽和核苷酸之間的鍵合不穩(wěn)定，對(duì)酸和堿均很敏感。因此，三價(jià)的亞磷酸三脂被氧化成五價(jià)的磷酸三脂。碘是溫和的氧化劑，在堿性的四氫呋喃溶液中作為氧的供體。此步反應(yīng)非常快，在三十秒內(nèi)就可以完成。加帽

因?yàn)榻Y(jié)合反應(yīng)在特定的時(shí)間內(nèi)不能夠定量，在每一步結(jié)合反應(yīng)中都有一小段提前終止的序列產(chǎn)生。如果這些序列進(jìn)一步參與反應(yīng)，產(chǎn)物將很難從混合序列中別離出來(lái)。通過(guò)加帽，即將自由羥基乙?；鉀Q了這個(gè)問(wèn)題。乙?；捎蓮?qiáng)的乙?；噭┩瓿桑撛噭┦怯傻饶柕拇姿狒蚇-甲基咪唑組成，反應(yīng)可在30秒內(nèi)完成。氧化后，核苷酸參加，循環(huán)完成。寡核苷酸合成后，移去增長(zhǎng)鏈5'-末端的DMT基團(tuán)，下一個(gè)核苷酸的聚合循環(huán)開(kāi)始。整個(gè)寡核苷酸合成后，借助濃氨水的處理，寡核苷酸從固相載體上別離，同時(shí)堿基和磷酸基去保護(hù)。

Q16.標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸結(jié)構(gòu)

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Q17.Bioneer能合成的最長(zhǎng)的寡核苷酸是多長(zhǎng)?

↑TOP合成量0.025μmol:50mer合成量0.05μmol:50mer合成量0.1μmol:100mer合成量0.2μmol:100mer合成量1.0μmol:130mer

Q18.當(dāng)我預(yù)訂50nmol的寡核苷酸，產(chǎn)品卻缺乏50nmol，為什么?

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50nmol的寡核苷酸合成不意味著能得到50nmol的最終產(chǎn)品。50nmol是指在寡核苷酸合成開(kāi)始時(shí)固相載體負(fù)荷的數(shù)量。寡核苷酸通常是反應(yīng)所要求的量而不是最終產(chǎn)率，用戶(hù)得到的核苷酸的數(shù)量自然要比要求的少。終產(chǎn)率受寡核苷酸長(zhǎng)度、堿基組成和連接效率的影響。

Q19.能合成出高百分比“G〞的寡核苷酸嗎?

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眾所周知，含高百分比的“G〞寡核苷酸不容易被合成，特別是序列中包含一行“G〞。有報(bào)道，如果有四個(gè)或更多的“G〞排成一行，寡核苷酸將趨向形成鳥(niǎo)嘌呤四聚體(PoonandMacGregor,Biopolymers,

1998,45,427-434)。通過(guò)次黃嘌呤核苷置換局部G，就能防止四聚體鳥(niǎo)苷的形成。

Q20.能提供寡核糖核酸(RNA)合成嗎？

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是的，我們能合成。我們能提供2'-OH或/和2-O-甲基結(jié)構(gòu)的寡核糖核苷酸，也能合成由DNA和RNA組成的寡核苷酸。Q21.合成的寡核苷酸在3'或5'位有磷酸基嗎？

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如果沒(méi)有殊要求,合成的寡核苷酸在3'或5'端均無(wú)磷酸基。如果你想要3'或5'有磷酸基的寡核苷酸，你應(yīng)該在訂單上標(biāo)注清楚在3'或5'端進(jìn)行磷酸化修飾。Q22.簡(jiǎn)并引物及通用引物是什么？

↑TOPR<-a或gY<-c或tM<-a或cK<-g或tS<-g或cW<-a或tV<-a,c或gH<-a,t或cB<-g,t或cD<-g,a或tN<-a,c,g或tQ23.怎樣純化合成的寡核苷酸？

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為了純化合成的寡核苷酸，Bioneer采取了幾種不同的方法如，脫鹽，BioRP,HPLC及PAGE。脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護(hù)基團(tuán)。通過(guò)濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上別離，2-氰乙氧基--酸二脂鍵的保護(hù)基團(tuán)以及堿基的保護(hù)基團(tuán)基(苯甲?；彤惗』?被去除，從而形成了天然的DNA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護(hù)步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機(jī)化合物。所有非必須有機(jī)化合物被移除的過(guò)程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進(jìn)行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必需有機(jī)雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生的微量的(每個(gè)聯(lián)結(jié)步驟中不超過(guò)2%)提前終止的寡核苷酸雜鏈。不過(guò)，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿(mǎn)足PCR檢測(cè)等基礎(chǔ)生物研究的。BioRP

如果寡核苷酸合成以“三苯甲基〞的形式完成，則N末端包含5'-DMT基團(tuán)，而提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。因?yàn)镈MT基有強(qiáng)親脂性，有5'-DMT基團(tuán)的寡核苷酸與反相樹(shù)脂具有親和性，因此反相親和樹(shù)脂通常被用來(lái)進(jìn)行寡核苷酸的純化。利用反向樹(shù)脂和5'-DMT寡核苷酸間存在強(qiáng)親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團(tuán)這一原理，我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中別離出來(lái)。HPLC

如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于克隆，定向突變或定量的基因檢測(cè)，那么對(duì)其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達(dá)不到要求，而HPLC純化法被廣泛地用于這個(gè)目的。作為一種純化樹(shù)脂，陰離子交換樹(shù)脂或反向樹(shù)脂被用于寡核苷酸的純化。陰離子交換樹(shù)脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，對(duì)于到達(dá)35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹(shù)脂化的HPLC與陰離子交換樹(shù)脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。因?yàn)镠PLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長(zhǎng)度，用HPLC法不能有效純化長(zhǎng)的寡核苷酸(大于35mer)。PAGE

對(duì)于長(zhǎng)的寡核苷酸的純化(50-100mer)，我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠作為純化基質(zhì)。盡管PAGE顯示出高的純化效率(＞98%)，但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比方在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降。Q24.用于芯片分析的60mer寡核苷酸如何被純化呢?

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我們推薦PAGE純化法用于60mer寡核苷酸的純化。通常，長(zhǎng)核苷酸(大于50mer)被推薦使用PAGE純化法。Q25.修飾寡核苷酸

↑TOP5'氨基和3'氨基修飾法：

寡核苷酸末端最初的脂肪族胺基團(tuán)會(huì)在合成過(guò)程中，連接上許多胺反應(yīng)性的分子。氨基修飾的寡核苷酸可被用于固定所需的寡核苷酸，固定在基質(zhì)上形成寡核苷酸為基礎(chǔ)的微陣列。5'磷酸化和3'磷酸化：

5'磷酸化的寡核苷酸通常用于定點(diǎn)突變和接頭插入。5'巰基修飾法：

5'末端巰基修飾的寡核苷酸可以進(jìn)一步衍生出巰基反應(yīng)分子。寡核苷酸的巰基能連接多種熒光基團(tuán)并用于DNA測(cè)序和雜交。5'生物素和內(nèi)部生物素修飾法：

生物素化的寡核苷酸具有多種用途，包括比色法測(cè)定DNA和借助抗生物素蛋白鏈菌素包被的磁珠進(jìn)行固相捕獲，用于限制性?xún)?nèi)切酶圖譜、基因組步移和差異顯示。5'熒光素，3'熒光素和內(nèi)部熒光素修飾法：

熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸已經(jīng)被廣泛用于DNA自動(dòng)測(cè)序，定量PCR和原位雜交反應(yīng)。在各種各樣的熒光染料中,熒光素(激發(fā)/放射最大波長(zhǎng)為494/520nm)是一種使用最廣泛的熒光基團(tuán)，用于標(biāo)記和探測(cè)生物分子。此外，它的吸收率相對(duì)較高，產(chǎn)生的熒光量子數(shù)量多，與氬離子激光器在488nm的激發(fā)光譜相近，使它成為共聚焦激光掃描顯微鏡法中常用的熒光基團(tuán)，并用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。然而，熒光素有幾個(gè)缺陷，包括相對(duì)較高光漂白率，pH敏感性(pKa～6.4)，pH低于7時(shí)，熒光顯著下降。盡管有這些缺陷，熒光素仍因它的優(yōu)點(diǎn)被廣泛的用做熒光染料。5'TAMRA及3'TAMRA修飾法：

Rhodamines與具有光漂白易感性和pH依賴(lài)性的熒光素相比見(jiàn)光更穩(wěn)定。Rhodamines光譜在pH4-10之間不受影響，在許多生物學(xué)應(yīng)用方面，這是優(yōu)于熒光素的一個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)。玫瑰紅中最普遍的基團(tuán)是TAMRA，它是一種用于寡核苷酸標(biāo)記和DNA自動(dòng)測(cè)序的重要的熒光物質(zhì)。TAMRA結(jié)合物的熒光量子產(chǎn)量通常只有熒光素結(jié)合物的四分之一。但是，由于TAMRA很容易被水銀燈形成的546nm光譜激發(fā)，被熒光顯微鏡觀察，而且本質(zhì)上它比熒光素更不易感光。TAMRA結(jié)合物比相應(yīng)的熒光素結(jié)合物更明亮。TAMRA也可被543nm的綠色的He-Ne激光有效的激發(fā)，它很大程度上被用于分析儀器。TAMRA結(jié)合物不能很好的被568nm用于很多共聚焦激光掃描(電子)顯微鏡Ar-Kr混合氣體激光激發(fā)。5'Cy3及5'Cy5修飾法：

Cy3和Cy5的最大吸收/激發(fā)波長(zhǎng)是550/570nm和649/670nm。間隔物(spacer)修飾法：包括了多種在寡核苷酸與后續(xù)連接標(biāo)記之間的間隔序列的亞磷酰胺的合并，在標(biāo)記物與寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交反應(yīng)時(shí)，這種方法可能是很重要的。肌苷修飾法：

脫氧肌苷以這種穩(wěn)定性順序I:C>I:A>I:T=I:G.形成穩(wěn)定的堿基配對(duì)。包含肌苷的寡核苷酸借助PCR或探針雜交可用于檢測(cè)或分析不同的或相似的DNA序列。硫磷酰修飾法：

經(jīng)硫磷?；墓押塑账釋?duì)核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的降解有很好的抵抗作用，這種特性能增加反義寡核苷酸鏈在細(xì)胞內(nèi)的效果。我們可以依據(jù)用戶(hù)的需要，在寡核苷酸局部序列中用硫磷酰基置換核苷酸內(nèi)部的磷酸基(在磷酸基中用一個(gè)硫原子代替一個(gè)氧原子)。雙重修飾法(5'熒光素3'Dabsyl&5'熒光素鈉3'TAMRA修飾)：

雙重標(biāo)記的寡核苷酸可在實(shí)時(shí)PCR中用來(lái)檢測(cè)DNA的擴(kuò)增。他們或者在反應(yīng)中裂開(kāi)(如TaqMan探針)或者在互補(bǔ)目的DNA存在的情況下經(jīng)歷一種構(gòu)型變化(如分子信標(biāo))。許多探針利用寡核苷酸形成反向環(huán)構(gòu)型的特征進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)際上，通過(guò)除去供體熒光基團(tuán)的淬滅作用，探針可指示反應(yīng)的發(fā)生。PCR檢測(cè)的5'核酸酶測(cè)定法(TaqMan探針)：

5'核酸酶測(cè)定法被用來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。這種測(cè)定法利用耐熱性DNA聚合酶的5'核酸外切酶的活性來(lái)檢測(cè)正在進(jìn)行的反應(yīng)。耐熱性DNA聚合酶能夠從鏈狀DNA的5'端水解核苷酸，舊鏈在合成一條新鏈時(shí)被置換。裂解主要發(fā)生在置換的單鏈局部和DNA配對(duì)的雙鏈局部的連接處。這導(dǎo)致單核苷酸和寡核苷酸從置換的DNA鏈的5'末端被釋放。DNA聚合酶的這種特性被用來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。在5'端核酸酶檢測(cè)法中FRETDNA雙重探針是短的寡核苷酸，與擴(kuò)增DNA靶序列和修飾的3'端互補(bǔ)，以至于他們不能在3'端延長(zhǎng)。他們?cè)?'和5'末端用熒光基團(tuán)標(biāo)記。報(bào)告熒光染料被放置在5'末端，粹滅劑被放置在探針的3'末端。在完整的探針中，染料的熒光性被消除，在PCR反應(yīng)中探針與靶序列雜交，借助耐熱性DNA聚合酶的5'核酸酶的活性，淬滅劑與報(bào)告基因別離，從而恢復(fù)報(bào)告基因的熒光性。兩個(gè)探針被使用，一個(gè)用于正常序列，另一個(gè)用于3bp缺失的互補(bǔ)序列。每個(gè)探針在5'末端有不同的報(bào)告熒光，并且一個(gè)相同的粹滅劑染料連接在從5'末端數(shù)的第七個(gè)核苷酸上。靶DNA的鑒定由熒光發(fā)射光譜決定。分子信標(biāo)：

嚴(yán)格的說(shuō)，熒光淬滅在使用DABCYL分子指示標(biāo)中不是FRET相關(guān)的，因?yàn)樗荒軡M(mǎn)足重疊光譜的標(biāo)準(zhǔn)。然而，以FRET為基礎(chǔ)的淬滅也能被使用。分子信標(biāo)被作為雜交探針后不久被應(yīng)用于PCR，利用它們能夠同互補(bǔ)DNA雜交的原理，它們能夠被用來(lái)監(jiān)測(cè)一個(gè)正在進(jìn)行中的反應(yīng)和在實(shí)時(shí)PCR中區(qū)別等位基因。反應(yīng)完成后，反應(yīng)物參加固定有分子信標(biāo)的微量滴定孔中，借助讀取產(chǎn)生的熒光檢測(cè)產(chǎn)物?；蛘哌€可用封閉試管和實(shí)時(shí)程序來(lái)檢測(cè)。在這種情況下，分子信標(biāo)被直接參加到PCR混合物并且與擴(kuò)增反應(yīng)中新合成的DNA雜交。與TaqMan探針相比，分子信標(biāo)優(yōu)勢(shì)在于能夠進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，因?yàn)?，在理論上，他們能同時(shí)測(cè)定更多的產(chǎn)品。Q26.作為反義脫氧寡核苷酸的硫磷?；押塑账?/p>

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隨著我們對(duì)分子生物學(xué)的理解不斷加深，我們慢慢獲得對(duì)分子水平疾病的認(rèn)識(shí)。合理的藥物設(shè)計(jì)變得更加可行。特別是在蛋白質(zhì)水平上分子間的反應(yīng)能夠被完美的設(shè)計(jì)，通過(guò)生物合理的途徑來(lái)提高結(jié)合性，分子間的相互作用成功的被應(yīng)用和被最正確化。合成的脫氧寡核苷酸(ODNs)已經(jīng)被Zamecnik和Stephenson提出作為一種新的潛在的治療方法，這種方法以一種合理的方式與信使RNA疾病關(guān)聯(lián)蛋白相互作用，并且特異的抑制它的合成。

這種被稱(chēng)為反義策略的方法的優(yōu)勢(shì)在于，通過(guò)眾所周知的Watson-Crick堿基配對(duì)法則，即單鏈核酸與互補(bǔ)的寡核苷酸鏈相互作用形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。每個(gè)蛋白分子均遵循分子生物學(xué)的根本機(jī)制合成：一個(gè)基因(雙鏈DNA)攜帶一種特定蛋白質(zhì)的遺傳信息，被轉(zhuǎn)錄成作為信息攜帶者的單鏈mRNA，再以此作為模板在核糖體指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成(翻譯)。因此，反義策略不被限制于特定類(lèi)型的疾病而能夠被廣泛地應(yīng)用。天然的寡核苷酸(DNA和RNA)不能夠到達(dá)作為反義藥物候選物的標(biāo)準(zhǔn)，不同的化學(xué)修飾將克服現(xiàn)存的障礙，它將被細(xì)胞吸收，抵抗核酸酶的降解和提高與mRNA的親和力。首先，脫氧寡核苷酸(ODNs)必須能夠穿越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，ODNs就必須抵抗核酸酶的降解