分子生物學(xué)實驗(完整課件)

分子生物學(xué)實驗課件作者：蔣華云jianghuayun@2015年3月課件作者:蔣華云2課程介紹實驗課名稱：分子生物學(xué)實驗36學(xué)時2學(xué)分參考教材：《分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)》魏群主編，高等教育出版社參考資料：《分子克隆實驗指南》【美】J.薩姆布魯克E.F.弗里奇T.曼尼阿蒂斯著科學(xué)出版社《精編分子生物學(xué)實驗指南》F.奧斯伯等科學(xué)出版社成績評定：平時成績+操作考試成績+筆試成績2015年3月課件作者:蔣華云32015年3月課件作者:蔣華云4實驗一、實驗準(zhǔn)備與試劑配置2015年3月課件作者:蔣華云5具體的實驗準(zhǔn)備工作清洗玻璃器皿等并烘干燒杯量筒試劑瓶錐形瓶10mL移液管玻璃涂棒培養(yǎng)皿玻璃棒容量瓶整理和打掃實驗室清洗烘干包扎、滅菌烘干備用潔凈保存2015年3月課件作者:蔣華云6具體的實驗準(zhǔn)備工作包扎需要滅菌的器具和耗材1.5mL小離心管、100mL離心管、吸頭、10mL移液管、玻璃涂棒、培養(yǎng)皿使用TOMY全自動滅菌鍋，121℃高溫濕熱滅菌20min1.5mL小離心管、100mL離心管、吸頭、10mL移液管、玻璃涂棒、培養(yǎng)皿取出滅菌完畢的物品置烘箱中烘干備用制作與錐形瓶配套使用的棉塞制備酒精棉球（75%酒精）2015年3月課件作者:蔣華云7TOMY全自動滅菌鍋的使用（1）檢查排放蒸汽的水壺，腔體內(nèi)的水位與托板齊平。（2）SET鍵設(shè)置溫度和時間（121℃，20min）（3）關(guān)閉排氣閥，Start機器開始運行，CheckHeat檢查設(shè)置的溫度，Stop鍵終止機器運行。（4）程序運行結(jié)束，旋開排氣閥或機器自行排氣至壓力為0。溫度降至80℃以下壓力為0時方可開蓋。運行過程中勿接觸蓋子。（5）腔體內(nèi)經(jīng)常清潔。2015年3月課件作者:蔣華云8LB液體/固體培養(yǎng)基的配制及質(zhì)粒提取試劑的配制2015年3月課件作者:蔣華云9實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗，掌握常用LB液體/固體培養(yǎng)基和質(zhì)粒提取試劑的配制方法和技術(shù)，為接下來的實驗作準(zhǔn)備。2015年3月課件作者:蔣華云10實驗儀器電子天平臺式天平分析天平磁力攪拌器TOMYSS-325自動蒸汽消毒柜pH酸度計2015年3月課件作者:蔣華云11磁力攪拌器2015年3月課件作者:蔣華云12試劑配制LB液體培養(yǎng)基（1000mL）將胰蛋白胨（bacto-typtone）10g，酵母提取物（bacto-yeastextract）5g，氯化鈉10g完全溶解在950mL去離子水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1000mL，121℃濕熱滅菌20min。冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩缇?，分裝LB液體培養(yǎng)基50mL/瓶分裝8瓶，剩余的600mL制備固體LB培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基分裝成200mL/瓶分裝3瓶，每瓶加入3g瓊脂粉，沸水浴溶解，包扎滅菌。注意2015年3月課件作者:蔣華云13試劑配制固體LB培養(yǎng)基：每升LB培養(yǎng)基中加15g瓊脂。LB液體培養(yǎng)基200mL/瓶中加瓊脂3g，包扎滅菌。滅菌結(jié)束后，要趁熱將融化的固體LB培養(yǎng)基搖勻，冷卻后4℃保存?zhèn)溆?。注?015年3月課件作者:蔣華云14試劑配制溶液Ⅰ(pH8.0)(100mL）50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)稱量→溶解→調(diào)節(jié)pH值→定容→滅菌溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH(50mL)2%SDS(50mL)用前等體積混合。注意：兩種試劑分開配制。稱量→溶解→定容溶液Ⅲ(100mL)5mol/L乙酸鉀60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL2015年3月課件作者:蔣華云15試劑配制70%乙醇（200mL,100mL/瓶分裝）放置于－20℃冰箱保存，用后即放回。0.5mol/LEDTA(pH8.0)（200mL）50×TAE（500mL）121gTris堿28.55mL冰乙酸50mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)注意：0.5mol/LEDTA(pH8.0)已經(jīng)配好。2015年3月課件作者:蔣華云16試劑瓶標(biāo)簽示意圖試劑名稱試劑濃度配制日期個性標(biāo)簽例：周二413晚上2015年3月課件作者:蔣華云17試劑配制分工LB液體/固體培養(yǎng)基溶液Ⅰ(100mL)溶液Ⅱ溶液Ⅲ(pH4.8)(100mL)70%乙醇0.5mol/LEDTA(pH8.0)（200mL）50×TAE（500mL）2015年3月課件作者:蔣華云18高壓滅菌LB液體/固體培養(yǎng)基溶液Ⅰ溶液Ⅱ2015年3月課件作者:蔣華云19思考題為什么在實驗前要做詳細(xì)的準(zhǔn)備工作?TOMY全自動滅菌鍋的正確使用步驟是什么?分子實驗準(zhǔn)備中，為什么要對器具和耗材等進行清洗和高溫濕熱滅菌?如果不滅菌，可能會對實驗產(chǎn)生什么樣的影響?結(jié)合堿裂解法提取質(zhì)粒的原理，思考在配制溶液Ⅰ時，為什么要使用pH酸度計調(diào)節(jié)溶液的pH值？怎樣配制LB液體/固體培養(yǎng)基？2015年3月課件作者:蔣華云20板書實驗?zāi)康牧私夥肿由飳W(xué)實驗中使用的儀器、耗材、試劑等準(zhǔn)備工學(xué)習(xí)質(zhì)粒DNA提取試劑的配制方法。實驗原理無菌概念酶（DNA酶、RNA酶）的影響質(zhì)粒DNA實驗步驟耗材：清洗——烘干——包扎——滅菌——烘干（備用）試劑：稱量——溶解——定容——分裝——滅菌調(diào)pH2015年3月課件作者:蔣華云21準(zhǔn)備清單直徑9cm培養(yǎng)皿（50塊/班）100mL藍(lán)蓋螺口試劑瓶（10只/班）250mL錐形瓶（5只/班）100mL錐形瓶（8只/班）槍頭（藍(lán)、黃、白）1.5mL小指管（1鋁飯盒）75%酒精棉球（2瓶）錐形瓶棉塞LB培養(yǎng)基（液體：50mL/瓶×8，固體：200mL/瓶×3）溶液Ⅰ實驗二、質(zhì)粒DNA的提取2015年4月課件作者：蔣華云溫故而知新試劑耗材的準(zhǔn)備溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、酚：氯仿、無水乙醇、70%乙醇、無菌水實驗流程質(zhì)粒DNA的提取→鑒定→雙酶切PCR→鑒定并純化產(chǎn)物純化產(chǎn)物（重組與測序）感受態(tài)制備→DNA重組轉(zhuǎn)化2012-3課件作者：蔣華云232015年4月課件作者：蔣華云質(zhì)粒(載體)質(zhì)粒是基因工程中常用的載體之一。質(zhì)粒是染色體外小型雙鏈環(huán)狀的DNA，大小在1～200kb之間?；蚬こ讨?，攜帶目的基因進入宿主細(xì)胞進行擴增和表達(dá)的工具稱為載體，主要有大腸桿菌中的質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒等。載體的結(jié)構(gòu)包括抗性基因、起始復(fù)制子、多克隆位點和標(biāo)記基因。作為基因工程用的載體必須具備以下條件：復(fù)制子有一個或多個利于檢測的遺傳表型有一到幾個限制性內(nèi)切酶的單一識別位點適當(dāng)?shù)目截悢?shù)2015年4月課件作者：蔣華云2015年4月課件作者：蔣華云2015年4月課件作者：蔣華云堿裂解法提取質(zhì)粒的原理重懸（溶液Ⅰ，pH8.0）變性（溶液Ⅱ）→pH12.0復(fù)性（溶液Ⅲ,pH4.8）→中性離心——沉淀（取上清）——去雜——留沉淀2012-3課件作者：蔣華云272015年4月課件作者：蔣華云提取質(zhì)粒的操作步驟取1.5mL菌液，4000r/min，2min，收集細(xì)菌沉淀溶液Ⅰ：溶液Ⅱ：溶液Ⅲ＝100uL：200uL：150uL1：2:1.5(體積比)Tris飽和酚：氯仿=1:1（估計上清液體積）等體積，去蛋白質(zhì)和脂質(zhì)兩倍體積無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA，空氣干燥。無菌水（ddH2O）(含RNaseA)溶解質(zhì)粒DNA-20℃低溫保存2015年4月課件作者：蔣華云操作注意事項操作要點“輕輕搖勻”“新鮮配制”“冰上預(yù)冷”“沉淀”與“上清”儀器的正確使用移液器離心機2012-3課件作者：蔣華云292015年4月課件作者：蔣華云保存-20℃低溫冰箱保存（每實驗小班一個凍存盒，做好詳細(xì)標(biāo)記）保存于411準(zhǔn)備間低溫冰箱2012-3課件作者：蔣華云302015年4月課件作者：蔣華云思考題堿裂解法提取質(zhì)粒的原理是什么？本實驗中酚：氯仿的作用是什么？溶解質(zhì)粒DNA時加入胰RNA酶的作用是什么？正確使用移液槍的要點有哪些？？2015年4月課件作者：蔣華云溶液Ⅰ葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力作用而降解EDTA：螯合Mg2+、Ca2+

等金屬離子，抑制DNase對DNA的降解作用。另外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4-糖苷鍵，因而具有溶菌作用

2015年4月課件作者：蔣華云溶液ⅡNaOH：DNA在pH大于5、小于9的溶液中是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH﹥12或pH﹤3時，就會引起雙鏈之間的氫鍵解離而變性。溶液II中的NaOH濃度為400mmol/L，加到提取液中時，該系統(tǒng)的pH>12，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性SDS：SDS是離子型表面活性劑。其主要功能是溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白，因而溶解膜蛋白破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白；SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來2015年4月課件作者：蔣華云溶液Ⅲ該溶液實際上是KAc-HAc的緩沖液用pH4.8的KAc是為了把強堿性的提取液調(diào)回至pH中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并穩(wěn)定存在高鹽的5mol/LKAc可以中和核酸上的電荷，減少相斥力，有利于變性的大分子染色體DNA、RNA互相聚合而沉淀下來，同時鉀鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全2015年4月課件作者：蔣華云乙醇乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的DNA沉淀劑DNA溶液中DNA是以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在的，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失去水而易于聚合

2015年4月課件作者：蔣華云移液器2015年4月課件作者：蔣華云MiniSpin臺式離心機2015年4月課件作者：蔣華云

板書實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒原理和操作技術(shù)。實驗原理堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟2015年4月課件作者：蔣華云操作步驟（板書）

將25mL含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基加入100mL錐形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1質(zhì)粒的大腸桿菌，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。收菌，吸取1.5mL培養(yǎng)物加入1.5mL離心管中，4000r/min室溫離心2min。吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。將細(xì)菌沉淀懸浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10min。加入200μL溶液Ⅱ(新鮮配制)，蓋緊蓋子，混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5min。加入150μL溶液Ⅲ(冰上預(yù)冷)，蓋緊蓋子，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置15min。12000r/min離心15min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。向上清中加入等體積酚:氯仿（1:1）（去蛋白），反復(fù)混勻，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。向上清中加入2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置5～10min。12000r/min離心5min，倒去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。用1mL70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩，12000r/min離心5min，倒去上清液，空氣干燥。加20μL純水(含20μg/mL胰RNA酶)，使質(zhì)粒DNA完全溶解，－20℃保存。注：1mL純水中加2μL10mg/mL的胰RNA酶配制成溶解質(zhì)粒的純水。在下次實驗中觀察實驗結(jié)果，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA。每班1個凍存盒，標(biāo)記如：周二413下午，質(zhì)粒樣品編號：學(xué)號201504課件作者:蔣華云40實驗三、瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA201504課件作者:蔣華云41你提取的質(zhì)粒DNA怎么樣？準(zhǔn)備→配試劑→提取質(zhì)粒DNA是否提取到質(zhì)粒DNA？質(zhì)粒DNA質(zhì)量怎么樣？實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA確定后續(xù)實驗材料2012-3-13課件作者：蔣華云41201504課件作者:蔣華云42電泳原理帶電物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳。凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為蛋白質(zhì)、核酸研究的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。泳動率是帶電顆粒在一定的電場強度下，單位時間內(nèi)在介質(zhì)中的遷移距離。樣品的物理性狀（分子大小、電荷多少、顆粒形狀和空間構(gòu)型）支持物介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）電場強度緩沖液離子強度（最適離子強度一般在0.02～0.2之間）2012-3-13課件作者：蔣華云42201504課件作者:蔣華云43DNA分子在瓊脂糖凝膠中DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子2012-3-13課件作者：蔣華云43201504課件作者:蔣華云44不同構(gòu)型的質(zhì)粒DNA超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA，簡稱CCCDNA）開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA一條鏈斷裂（opencircularDNA，簡稱OCDNA）線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA二條鏈斷裂（linearDNA，簡稱LDNA）2012-3-13課件作者：蔣華云44201504課件作者:蔣華云45實驗儀器分析天平微波爐（電爐）移液器（10uL）瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（水平槽）紫外線透射儀（或凝膠成像系統(tǒng)）2012-3-13課件作者：蔣華云45201504課件作者:蔣華云46瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（水平槽）201504課件作者:蔣華云47水平槽電泳系統(tǒng)的使用緩沖液染料指示劑瓊脂糖凝膠電泳儀201504課件作者:蔣華云48電泳正在進行電泳儀DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。點樣端靠近負(fù)極DNA分子在凝膠中移動201504課件作者:蔣華云49材料與試劑質(zhì)粒DNADNAmarker2000DNAmarker100001×TAE(電泳緩沖液)6×凝膠加樣緩沖液瓊脂糖1%溴化乙錠溶液（EB）（注意：EB

具有毒性，戴手套操作）201504課件作者:蔣華云50實驗操作步驟膠板的制備制備1%瓊脂糖凝膠加樣記錄點樣的順序和點樣量電泳DNA的遷移速度和電壓成正比，最高的電壓不超過5V/cm，DNA片段從負(fù)極向正極移動，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移動到距凝膠前沿1～2cm處時，停止電泳。90V恒壓電泳25min實驗報告請詳細(xì)記錄實驗過程201504課件作者:蔣華云51操作詳解制備1%瓊脂糖凝膠（1）按水平槽制膠板操作說明，將制膠板安裝好，調(diào)節(jié)水平。（2）稱取0.3g瓊脂糖，加30mL1×TAE電泳緩沖液，微波爐加熱至完全透明，涼卻至60度時，加入1μL1%EB，搖勻倒板。記錄加樣的順序和加樣量（3）待瓊脂糖凝膠完全凝固，將膠板放入電泳槽，加入1×TAE電泳緩沖液，通常加至沒過膠面2mm，拔去梳子。（4）選擇一個加樣孔加入5μLDNAmarker2000或15000（5）吸取5μL樣品DNA和1μL6×凝膠加樣緩沖液混勻，加入加樣孔。（注意：此混勻操作可在一次性手套上完成。）電泳 （6）接通電泳槽和電泳儀電源，調(diào)節(jié)電壓為90V，穩(wěn)壓電泳25分鐘。（注意：DNA片段從負(fù)極向正極移動，即加樣端靠近電泳槽負(fù)極。）201504課件作者:蔣華云52結(jié)果檢測在紫外燈（360nm，312nm，254nm）下觀察電泳凝膠，DNA存在處顯出桔紅色熒光條帶。【紫外透射儀】記錄觀察結(jié)果或拍照記錄實驗結(jié)果【402房間】注意：紫外線對眼睛有傷害作用，應(yīng)隔防護玻璃觀察或戴上防護眼鏡。201504課件作者:蔣華云53預(yù)習(xí)提示分子生物學(xué)中常用的工具酶2012-3-13課件作者：蔣華云53質(zhì)粒DNA的雙酶切課件作者:蔣華云55實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗掌握質(zhì)粒DNA雙酶切的原理和操作方法。課件作者:蔣華云56實驗步驟質(zhì)粒DNA雙酶切的實驗操作1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果UVP凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果（電泳圖）

37度酶切1.5h原理講解課件作者:蔣華云57實驗儀器、材料與試劑制冰機水浴鍋（37℃）瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（電泳槽、電泳儀和制膠裝置）紫外線透射儀（凝膠成像系統(tǒng)）10μL移液槍和槍頭20μL移液槍和槍頭浮板小離心管R-pGEX-4T-1質(zhì)粒DNA課件作者:蔣華云58實驗儀器、材料與試劑XhoⅠ酶（TaKaRa公司）EcoRⅠ酶（TaKaRa公司）10×HBuffer（TaKaRa公司）無菌水DNAmarker2000（TaKaRa公司）瓊脂糖1×TAE10mg/mL溴化乙錠溶液（EB）（0.5μg/mL終濃度，20mL膠加1μL）10×LoadingBuffer:1%SDS/50%Glycerol(甘油)/0.05%BromophenolBlue(溴酚藍(lán))課件作者:蔣華云59EcoRⅠ1μLXhoⅠ1μL10×HBuffer2μL質(zhì)粒DNA10μL～12μL≤1μg無菌水6μL～4μL總體積20μL（無菌水補至總體積）質(zhì)粒DNA雙酶切的實驗操作酶切反應(yīng)條件：溫度37℃，酶切1小時30分鐘。

酶切反應(yīng)體系取0.5mL無菌小離心管按上表在管中加入酶切反應(yīng)體系酶切課件作者:蔣華云60實驗原理分子生物學(xué)中常用的工具酶限制性內(nèi)切酶連接酶聚合酶激酶、磷酸酶核酸酶回憶DNA結(jié)構(gòu)課件作者:蔣華云61限制性內(nèi)切酶（I型）限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。(II型)限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的，因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆。課件作者:蔣華云62(II型)限制性內(nèi)切酶這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。II型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：課件作者:蔣華云63EcoRI–5’端突出粘性末端Pstl–3’端突出粘性末端EcoRⅤ–平頭末端不同的末端課件作者:蔣華云64EcoRI識別序列和酶切EcoRI識別序列（回文順序）酶切位點片段1片段2課件作者:蔣華云65XhoⅠ識別序列和酶切酶切位點片段1XhoⅠ識別序列（回文順序）片段2課件作者:蔣華云66連接酶DNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶RNA連接酶課件作者:蔣華云67DNA聚合酶依賴于DNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow酶T4DNA聚合酶天然T7DNA聚合酶經(jīng)修飾的T7DNA聚合酶（測序酶）TaqDNA聚合酶不依賴模板的DNA聚合酶（末端轉(zhuǎn)移酶）依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）課件作者:蔣華云68RNA聚合酶依賴于DNA的RNA聚合酶不依賴于DNA的RNA聚合酶結(jié)束！課件作者:蔣華云70DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)課件作者:蔣華云71堿基互補配對、磷酸二酯鍵OCH2OPOOOBaseCH2OPOOOBaseOHSugarSugarO返回課件作者:蔣華云72實驗四、質(zhì)粒DNA的雙酶切(板書)實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗掌握質(zhì)粒DNA雙酶切的原理和操作方法實驗原理分子生物學(xué)中常用的工具酶。雙酶切原理。實驗步驟酶切反應(yīng)體系和酶切1.5小時:取0.5mL離心管，按表加入試劑，反應(yīng)1.5小時。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察實驗結(jié)果。EcoRⅠ1μLXhoⅠ1μL10×HBuffer2μL質(zhì)粒DNA10μL～12μL≤1μg無菌水6μL～4μL總體積20μL（無菌水補至總體積）PCR基因擴增2025/2/6作者:蔣華云一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)2025/2/6作者:蔣華云二、實驗原理PCR是一種由引物介導(dǎo)的選擇性體外擴增DNA的方法，由美國人B.Mullis于1983年發(fā)明包括三個基本步驟:變性（Denature）：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈退火（Anneal）：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25～35輪循環(huán)就可使DNA擴增達(dá)106倍2025/2/6作者:蔣華云5’3’5’3’DoublestrandedDNAtemplateRegiontobeamplified2025/2/6作者:蔣華云5’3’5’3’DesignprimerswiththissequenceinformationIdenticaltothissequenceReversecomplementofthissequenceDoublestrandedDNAtemplate2025/2/6作者:蔣華云5’3’5’3’PCRCycle1PrimersTaqTaqDoublestrandedDNAtemplate2025/2/6作者:蔣華云5’5’3’3’PCRCycle1Denaturation95℃

strandsseparate

PrimersTaqTaqTaqpolymeraseisthermostable2025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’Annealing~55℃PrimersbindTaqTaqForwardprimerannealstolowerstrandReverseprimerannealstoupperstrandPCRCycle12025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’Annealing~55℃TaqbindsTaqTaqPCRCycle12025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’Extension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPsTaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’direction

PCRCycle12025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’TaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1Extension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPs2025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’TaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1Extension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPs2012-3-20課件作者:蔣華云2025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’TaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1TaqTaqExtension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPs2025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’5’3’5’3’Endcycle1

PCRCYCLE12025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’5’5’3’3’PCRCycle2Denaturation95℃strandsseparate2025/2/6作者:蔣華云3’5’5’3’5’5’3’3’Annealing~55℃PrimersbindPCRCycle22025/2/6作者:蔣華云Extension72℃TaqcopiesDNAstrandPCRCycle22025/2/6作者:蔣華云TwosinglestrandsofcorrectlengthPCRCycle2Endcycle2

2025/2/6作者:蔣華云Endcycle3

2025/2/6作者:蔣華云Endcycle4

2025/2/6作者:蔣華云FollowingncyclesofPCRtherewillbeNo(1+Y)ncopiesNo initialnumberoftargetsY efficiencyofPCRreactionn cyclenumber2025/2/6作者:蔣華云1、PCR反應(yīng)中的主要成份引物dNTPMg2+模板TaqDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液2025/2/6作者:蔣華云引物PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時遵循下列原則：引物長度約為16～30bp引物中G+C含量通常為40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估計引物的解鏈溫度四種堿基應(yīng)隨機分布，在3’端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)引物3’端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對在引物內(nèi)，尤其在3’端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)兩引物之間尤其在3’端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量引物5’端對擴增特異性影響不大，可引入酶切位點或突變位點引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子引物的濃度一般為0.1～0.5μmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，引物濃度偏低則降低產(chǎn)量2025/2/6作者:蔣華云dNTPdNTP常用的濃度為20～200μmol/L，而且4種dNTP的終濃度相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足而出現(xiàn)的錯誤摻入dNTP濃度過高雖可加快反應(yīng)速度，但會增加堿基的錯誤摻入率，同時會抑制TaqDNA聚合酶的反應(yīng)活性；適當(dāng)?shù)牡蜐舛葧岣叻磻?yīng)的精確度注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系2025/2/6作者:蔣華云Mg2+Mg2+濃度會影響TaqDNA聚合酶的活性、真實性，影響引物退火、解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等通常Mg2+濃度范圍為0.5～2mmol/L在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團，例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+濃度2025/2/6作者:蔣華云模板PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進行擴增，單鏈分子、雙鏈分子、線狀分子或環(huán)狀分子均可以作為模板DNA（線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好）模板的數(shù)量和純度均會影響PCR結(jié)果：一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102

～105個拷貝。模板拷貝數(shù)過多可能會增加非特異性產(chǎn)物模板DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率2025/2/6作者:蔣華云TaqDNA聚合酶早期PCR擴增是由大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段完成，但這種酶不耐熱，所以每一輪循環(huán)在變性和退火后必須加入新酶后來引入耐熱的TaqDNA聚合酶，一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min，因此PCR中變性溫度不宜超過95℃TaqDNA聚合酶的最適溫度是72℃，連續(xù)保溫30min仍具有相當(dāng)?shù)幕钚?，一次加酶可滿足PCR反應(yīng)全過程的需要純化的TaqDNA聚合酶有5’→3’外切酶活性，而無3’→5’外切酶活性，不具有Klenow酶的3’→5’校對活性，因此在PCR中有錯誤摻入率，大約是每2×104個核苷酸中有一個，在利用PCR克隆和進行序列分析時尤為注意TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。在100μL反應(yīng)體系中，1.5～2U的TaqDNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)使用TaqDNA聚合酶濃度過高，可引起非特異性產(chǎn)物的擴增，濃度過低則擴增產(chǎn)物量減少2025/2/6作者:蔣華云反應(yīng)緩沖液一般含100mmol/LTris·Cl（20℃下pH8.3-8.8）,500mmol/LKCl和0.1％的明膠，有時候還有適當(dāng)濃度的Mg2+Tris·Cl是一種雙極性離子緩沖液，主要靠其調(diào)節(jié)pH，使TaqDNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性KCl有利于引物的退火，但濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶的活性明膠保護酶不變性失活Mg2+影響TaqDNA聚合酶的活性，直接影響反應(yīng)的特異性和擴增DNA的產(chǎn)率反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA），它們可穩(wěn)定酶活性2025/2/6作者:蔣華云2、PCR反應(yīng)參數(shù)變性(94度)退火(55度)延伸(72度)循環(huán)次數(shù)(30個循環(huán))2025/2/6作者:蔣華云變性變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量一般變性溫度與時間為94℃1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富含GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失2025/2/6作者:蔣華云退火引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高、長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高有些反應(yīng)可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度（如用60℃和94℃）完成整個擴增循環(huán)，既省時間又提高了特異性退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時間主要是為使整個反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37℃～55℃，1-2min2025/2/6作者:蔣華云延伸延伸反應(yīng)溫度通常為72℃，接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃～85℃，引物延伸在退火時即已開始延伸時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。一般反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成1kb長的DNA。延伸時間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。對很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時間擴增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時間（10～30min）的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對以后進行克隆或測序反應(yīng)尤為重要2025/2/6作者:蔣華云循環(huán)次數(shù)當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度一般而言25～30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加通常25～30輪循環(huán)擴增后，反應(yīng)中TaqDNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時產(chǎn)物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的DNA樣品稀釋103～105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進行擴增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴增水平可達(dá)109～10102025/2/6作者:蔣華云三、儀器、材料與試劑PCR熱循環(huán)儀移液槍（配套槍頭）DNA模板（質(zhì)粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）2.5mmol/LdNTP（TaKaRa）10×PCR緩沖液（TaKaRa）25mmol/LMgCl2（TaKaRa）引物1、引物2（5pmol/μL）引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’TaqDNA聚合酶（TaKaRa）2025/2/6作者:蔣華云四、實驗步驟反應(yīng)物體積（μL）10×PCR緩沖液2.525mmol/LMgCl21.52.5mmol/LdNTP2.0引物11.5引物21.5TaqDNA聚合酶0.2模板DNA(1ng/μL)2.0加ddH2O至25μL13.8PCR反應(yīng)體系的配制，即在0.2mLEppendorf管內(nèi)配制25μL反應(yīng)體系，按下表準(zhǔn)確加入各反應(yīng)物2025/2/6作者:蔣華云PCR反應(yīng)條件的設(shè)置，即在PCR熱循環(huán)儀上設(shè)置程序，按程序設(shè)置的條件進行擴增94℃預(yù)變性5min94℃變性40sec55℃退火50sec72℃延伸50sec72℃延伸8min1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果（此步驟與下次實驗PCR擴增產(chǎn)物的割膠純化一起進行）重復(fù)30次2025/2/6作者:蔣華云實驗分組2位同學(xué)一小組，全班共11小組，4個小組組成一個大組，采取混合加樣分管的方法，減小操作誤差。每個大組混合加樣，配不加模板的反應(yīng)體系6管，分成23μL/管，每個小組單獨加自己的模板（4組實驗組），每一大組做1管陰性對照加2μL無菌水作為模板。2025/2/6作者:蔣華云五、思考題PCR反應(yīng)的基本原理是什么？典型的PCR反應(yīng)體系由哪些組分組成，如何影響PCR反應(yīng)？繪出電泳結(jié)果圖，若實驗結(jié)果可見拖尾現(xiàn)象或有幾條區(qū)帶，試分析是什么原因造成的？該怎樣解決？？2025/2/62012-3-20作者:蔣華云課件作者:蔣華云返回2012-3-20課件作者:蔣華云2025/2/6作者:蔣華云返回2012-3-20課件作者:蔣華云2025/2/6作者:蔣華云結(jié)束2012-3-20課件作者:蔣華云PCR擴增產(chǎn)物的鑒定與純化課件作者：蔣華云116實驗?zāi)康耐ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。對獲得的目的產(chǎn)物進行割膠純化回收,為接下來的DNA重組和轉(zhuǎn)化實驗提供外源DNA片段。課件作者：蔣華云117實驗原理瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0課件作者：蔣華云118TaKaRa公司的膠純化試劑盒

TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段的試劑盒，采用了獨特的凝膠溶解bufffer，其具有較強的緩沖性能并含有pH指示劑，方便判斷溶液的pH是否適合與DNA制備膜結(jié)合，其溶膠能力很強，無需加熱，再室溫（15-25度）條件下即可快速溶膠。結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效、快速、方便的特點，全套操作只需20min便可完成。使用該試劑盒每次可純化得到多至20μg的DNA片段（50bp～20kb），回收率高達(dá)50～80%。本試劑盒回收純化的DNA片段純度高，完整性好，可直接用于連接反應(yīng)、PCR擴增、DNA測序等各種分子生物學(xué)實驗。經(jīng)膠純化試劑盒回收的DNA片段采用-20℃低溫保存，延緩DNA的降解。課件作者：蔣華云119儀器、材料與試劑【儀器】瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)紫外透射儀臺式離心機移液槍（配套槍頭）-20℃低溫冰箱分析天平【材料與試劑】PCR擴增產(chǎn)物AgaroseGelDNAPurificationKit(TaKaRa)瓊脂糖1×TAE6×LoadingBufferDNAMarker2000單面刀片純化試劑盒1.5mL離心管超純水（無菌）課件作者：蔣華云120實驗步驟（1）使用1×TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。（參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗）（2）在紫外燈下切出含有目的DNA（約600bp）的瓊脂糖凝膠。此時應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。注意：切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。課件作者：蔣華云121實驗步驟（3）切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。（4）稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1mg=1μL進行計算。（5）向膠塊中加入膠塊融化液BufferGM，BufferGM的加量如下表：課件作者：蔣華云122（6）均勻混合后15-25℃融化膠塊（膠濃度較大或比較難溶時可以在37℃加熱）。此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約5～10分鐘）。注意：膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA的回收率。（7）*當(dāng)分離小于400bp的DNA片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。（8）將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。（9）將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，12000rpm離心1min，棄濾液。注意：如將濾液再加入SpinColumn中離心一次，可以提高DNA的回收率。課件作者：蔣華云123（10）將700μL的BufferWB加入SpinColumn中，12000rpm離心30s，棄濾液。（11）重復(fù)操作步驟10。（12）將SpinColumn安置于新的1.5mL的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入25μL的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1min。注意：使用加熱至60℃的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer有利于提高洗脫效率。（13）室溫12000rpm離心1min洗脫DNA。（14）-20℃低溫保存純化的目的DNA片段。課件作者：蔣華云124實驗分組PCR產(chǎn)物鑒定全班分為2大組，每大組制備1塊1%的瓊脂糖凝膠。（8個點樣孔，1孔Marker,7孔樣品。）割膠純化回收目的DNA片段每4人1組（檢測到PCR反應(yīng)產(chǎn)物的），全班約7組。課件作者：蔣華云125思考題為什么PCR擴增得到的目的DNA片段不宜直接用于連接反應(yīng)，采用什么方法純化目的DNA片段可提高連接效率？純化的目的DNA片段應(yīng)如何保存？課件作者：蔣華云126電泳圖大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備2015年3月課件作者:蔣華云128什么是感受態(tài)？宿主大腸桿菌（E.coliDH-5α）（R-，M-，Amp-）感受態(tài)細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)2012-4-16課件作者:蔣華云2015年3月課件作者:蔣華云129實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的方法和技術(shù)。為接下來的DNA重組與轉(zhuǎn)化實驗提供感受態(tài)細(xì)胞。2015年3月課件作者:蔣華云130實驗原理處于對數(shù)生長期的細(xì)菌經(jīng)低溫CaCl2處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。2015年3月課件作者:蔣華云131實驗原理在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài),以攝取外源DNA。2015年3月課件作者:蔣華云132實驗原理轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。2015年3月課件作者:蔣華云133實驗原理進入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。2015年3月課件作者:蔣華云134實驗原理目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法CaCl2法

CaCl2

法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用廣泛。RbCl(KCl)法2015年3月課件作者:蔣華云135儀器、材料與試劑【儀器】超凈工作臺冷凍離心機恒溫?fù)u床－70℃冰箱1mL、200μL移液槍（配套槍頭）10mL移液管吸耳球100mL離心管1.5mL小指管【材料與試劑】大腸桿菌DH5α（R-，M-，Amp-）

LB液體培養(yǎng)基0.1mol/LCaCl2溶液30%甘油2015年3月課件作者:蔣華云136實驗步驟（一）受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α單菌落，接種于3～5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過夜（12h左右）。將該菌種懸液以1:100的比例接種，取500μL菌液轉(zhuǎn)接到50mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2～3h至OD600＝0.5左右。2015年3月課件作者:蔣華云137實驗步驟（二）感受態(tài)細(xì)胞的制備（注意：以下操作在超凈工作臺完成。）將菌液轉(zhuǎn)入100mL離心管中，冰上放置10min。在4℃下，4000r/min離心10min。棄去上清，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。用冰上預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2

溶液10mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min。0～4℃4000r/min離心10min，棄去上清，加入2mL預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2

溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置（務(wù)必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鮮感受態(tài)細(xì)胞的制備）2015年3月課件作者:蔣華云138實驗步驟（三）感受態(tài)細(xì)胞的分裝與凍存在2mL制備好的感受態(tài)細(xì)胞中加入2mL30%甘油（即1:1體積，甘油終濃度15%）,輕輕混勻。將此感受態(tài)細(xì)胞分裝成每份200μL(1.5mL小指管)，液氮速凍，快速轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。（如果沒有液氮，可以將分裝的感受態(tài)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。）2015年3月課件作者:蔣華云139實驗分組全班分為2大組，每大組培養(yǎng)50mL菌液，最后每人制備得到1支200μL的感受態(tài)細(xì)胞，全班至少保存32支感受態(tài)細(xì)胞。另外，沒有到超凈工作臺操作的學(xué)生可以在實驗室進行小量感受態(tài)的模擬制備。（非無菌條件下，制備完成后不保存。）2015年3月課件作者:蔣華云140思考題怎樣制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞？如何獲得適合用于制備感受態(tài)的菌體細(xì)胞？2015年3月課件作者:蔣華云141結(jié)束2012-4-16課件作者:蔣華云DNA重組與轉(zhuǎn)化2015年5月課件作者:蔣華云143一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)重組DNA連接與轉(zhuǎn)化的方法。2015年5月課件作者:蔣華云144什么是重組？怎樣轉(zhuǎn)化？重組：載體和外源連接什么是載體？這里的外源指什么？轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。準(zhǔn)備好的感受態(tài)的細(xì)胞（－70度低溫保存）2015年5月課件作者:蔣華云145二、實驗原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。通常:重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA連接。T載體:

pMD18-T

2015年5月課件作者:蔣華云146pMD18-T(PCR產(chǎn)物克隆載體)2015年5月課件作者:蔣華云147連接2015年5月課件作者:蔣華云148DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過（牛小腸堿性磷酸酶）CIP處理克服連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中的溫度，