ALK陽性NSCLC診斷方法更新

NSCLC分子病理診斷的重要性NSCLC：腫瘤驅(qū)動基因及相應(yīng)靶向藥物驅(qū)動基因檢測：靶向藥物選擇和臨床試驗規(guī)范分子檢測：是規(guī)范治療的前提和保證EGFRKRASALKfusions3-7%HER2BRAFPIK3CAAKT1MAP2K1NRASROS1fusionsKIF5B-RET上海腫瘤醫(yī)院胸外科-非吸煙腺癌廣州省人民醫(yī)院中國ALK陽性NSCLC總患者數(shù)約為HER2陽性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多ALK陽性腫瘤患者34,820例乳腺癌HER2陽性患者49,631例驅(qū)動突變腫瘤的每年發(fā)病數(shù)中國腫瘤登記年報，2012CML10,000例左右三大指南權(quán)威推薦

ALK陽性NSCLC診斷方法規(guī)范中華醫(yī)學(xué)會三大指南推薦

ALK陽性NSCLC的診斷目的：提高我國ALK+NSCLC領(lǐng)域診斷的規(guī)范化水平背景：中國肺癌發(fā)病率、死亡率均居癌癥首位。ALK陽性NSCLC已成為NSCLC一個特定亞型中國ALK陽性NSCLC總患者數(shù)約為35000人，是HER2陽性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多

因此：如何準(zhǔn)確診斷這些ALK陽性NSCLC患者是當(dāng)務(wù)之急。中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期主要內(nèi)容：ALK陽性NSCLC的診斷ALK陽性NSCLC的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華結(jié)核呼吸科雜志2014年3月第27卷第3期主要內(nèi)容：ALK陽性NSCLC的診斷ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華結(jié)核呼吸科雜志2014年3月第27卷第3期ALK陽性NSCLC命名的由來2007,Soda&Mano首次發(fā)現(xiàn)EML4-ALK基因2009,AliceT.Shaw首次出現(xiàn)EML4-ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的稱謂，并將其定義為NSCLC的獨特亞型2010,KwakEL:證實克唑替尼治療有效，但仍沿用EML4-ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的稱謂SodaM,etal.Nature2007;448(7153):561-566.ShawAT,etal.JClinOncol2009;27:4247-4253.KwakEL,etal.NEnglJMed2010;363:1693-1703.EML4-ALKpositiveALKrearrangementpositiveALKfusionpositive

ALKIHCpositiveALKpositiveALK陽性NSCLC定義ALK陽性非小細(xì)胞肺癌：是指包括ALKFISH檢測陽性、ALK序列融合變異或ALK融合蛋白表達(dá)陽性的肺癌，腫瘤細(xì)胞中存在ALK融合基因表達(dá)，是非小細(xì)胞肺癌的一個分子亞型，常見于腺癌，該類患者通?？蓮腁LK抑制劑治療中獲益。張緒超等.中華病理學(xué)雜志2013;42(6):402-406.ALK陽性NSCLC具有鮮明的

臨床及病理特征特征EGFR突變EML4/ALK組織學(xué)腺癌TTF1+腺癌TTF1+亞型非粘液型粘液型吸煙狀態(tài)不吸煙不吸煙人種東亞所有人種發(fā)病年齡66歲52歲性別女性無差異ShawAT,etal.JClinOncol2009;27:4247-4253.ALK陽性NSCLC年齡50歲左右偏年輕中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華結(jié)核呼吸科雜志2014年3月第27卷第3期細(xì)胞外黏液黏液篩狀結(jié)構(gòu)印戒細(xì)胞微乳頭結(jié)構(gòu)砂粒體主要內(nèi)容：ALK陽性NSCLC的診斷ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華結(jié)核呼吸科雜志2014年3月第27卷第3期ALK陽性NSCLC的診斷-三大指南推薦適宜人群診斷方法中國EGFR與ALK陽性NSCLC診斷及治療指南（2014）所有含腺癌成分的NSCLCFISH,

經(jīng)權(quán)威機構(gòu)批準(zhǔn)的IHC與RT-PCR，其余IHC可做為篩選CSCO中國專家共識所有含腺癌成分的NSCLC，富集人群可優(yōu)先檢測FISH,VentanaIHC,RT-PCR,常規(guī)IHC可做初篩晚期非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療專家共識所有含腺癌成分的NSCLCFISH,RT-PCR，VentanaIHCCFDA（中國國家藥監(jiān)局）

VentanaIHCAmoyRT-PCR

FISH中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華結(jié)核呼吸雜志2014年3月第37卷第3期所有含腺癌成分的NSCLC需常規(guī)檢測

EGFR&ALK“先檢測，后治療”的NSCLC靶向個體化治療模式已成為臨床的診療規(guī)范

EGFR

&ALK是NSCLC已知的“高頻”驅(qū)動基因，且有靶向藥物治療ALK驅(qū)動基因變異的患者接受靶向治療，中位OS可達(dá)4.3年1KrisMG,etal.JAMA2014;311:1998-20062015NCCNV4關(guān)于分子檢測的推薦小標(biāo)本鱗癌診斷存在誤差:首次診斷為鱗癌再次重復(fù)評估診斷腺癌或者腺鱗混合PK.Paik,etal.MolCancerTher.2012.Patient#AgeGenderBiopsy#1^Biopsy#1MutationBiopsy#2^BestresponsetoEGFRTKITTPonTKI(months)1(1)61MSquamous(L1)?exon19delAdenosquamous(LLLlung)PR12.12(2)71FSquamous(RLLlung)?exon19delAdenocarcinoma(RLLlung)Unavailable19.63(3)58FSquamous(RULlung)exon19delAdenosquamous(LLLlung)?SD23.64(4)45FSquamous(sacrum)exon19delAdenocarcinoma(pleuralfluid)UnavailableUnavailable5(5)46MSquamous(Rlung)exon19delAdenocarcinoma(SCLN)PR5.0+6(6)73MSquamous(adrenal)exon19delAdenocarcinoma(SCLN)UnavailableUnavailable7(10)58MSquamous(bronchus)L858RSquamous(T8)PR1.98(new)76MSquamous(Rlung)?insufficientAdenocarcinoma(Llung)PR5.39(new)68MSquamous(Llung)L858RNonePR2.8+10(new)30FAdenosquamous(Rlung)L858RNonePR8.411(new)50MAdenosquamous(Llung)exon19delNonePR9.2+“中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診療指南”更新專家推薦：

晚期NSCLC患者使用ALK酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療前必須檢測ALK融合變異狀態(tài)。推薦所有含腺癌成分的NSCLC，應(yīng)在診斷時常規(guī)進(jìn)行ALK融合基因或融合蛋白檢測（1類）。對于小活檢標(biāo)本或者不吸煙的鱗癌患者也建議進(jìn)行（1類）。檢測前應(yīng)有送檢樣本的質(zhì)控包括亞型確認(rèn)和樣本量確認(rèn)。送檢樣本類型包括手術(shù)樣本、活檢組織樣本、細(xì)胞學(xué)樣本和細(xì)胞蠟塊。對于部分活檢組織標(biāo)本臨床取材小樣本的局限性，有時無法保證肺腺癌的準(zhǔn)確診斷，應(yīng)考慮對不能判斷組織學(xué)類型的肺癌（NOS）也進(jìn)行ALK檢測（1類）。專家推薦：對于送檢樣本ALK融合和EGFR突變雙陰性的患者，NCCN指南推薦進(jìn)一步檢測ROS1的重排，考慮到小活檢樣本的有限性，關(guān)于ROS1的檢測，在患者的允許下，推薦ROS1和ALK、EGFR同時檢測（IIA類）。目前關(guān)于ROS1檢測方法還沒有完全統(tǒng)一，建議有條件的實驗室先進(jìn)行ALK/ROS1的免疫組化檢測，檢測結(jié)果陽性的患者，進(jìn)一步使用FISH或者RT-PCR確診。為了避免樣本浪費和節(jié)約檢測時間，對于晚期NSCLC活檢樣本，建議一次性切出需要診斷組織類型和ALK/EGFR檢測的樣本量，避免重復(fù)切片浪費樣本（1IA類）。有研究表明，在我國年齡是ALK陽性NSCLC一項顯著的獨立預(yù)測因子，在年輕NSCLC患者中，發(fā)生ALK融合的概率顯著高于發(fā)生EGFR突變的概率15，因此對于樣本量有限不能滿足同時檢測ALK/EGFR檢測的樣本，對于年齡相對比較年輕的患者，建議優(yōu)先檢測ALK融合狀態(tài)（IIB類）?！爸袊鳤LK陽性非小細(xì)胞肺癌診療指南”更新主要內(nèi)容：ALK陽性NSCLC的診斷ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華結(jié)核呼吸科雜志2014年3月第27卷第3期ALK異常形式及檢測方法DNAALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5BALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5BALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5BE13;A20E6;A20E20;A20E14;A20E18;A20E15;A20E2;A20KIF5B-ALKE17;A20TFG-ALKEML4-ALKE14;A20KIF5B-ALKTFG-ALKEML4-ALKmRNAProteinALKTyrosineKinaseactivationFISHReal-timePCRIHCFISH3’5’在中國批準(zhǔn)的ALK診斷試劑盒ALKbreak-apartFISHassay(AbbottMolecular,Vysisprobes)ALKimmunohistochemistry(RocheVentana)SplitIsolatedredAmoyDxEML4-ALK融合基因檢測試劑盒（廈門艾德）陰性或未知；據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)§新鮮標(biāo)本VentanaIHC常規(guī)IHC檢測*

陽性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突變且使用EGFR-TKIs后出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)耐藥的患者石蠟標(biāo)本3+/2+/1+陰性ALK陽性非小細(xì)胞肺癌EGFR突變檢測中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期NSCLC活檢組織標(biāo)本衛(wèi)生部診療規(guī)范及三大指南推薦FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）均可用于診斷ALK陽性NSCLC任一陽性即可診斷對一種方法有懷疑時可選用另外兩種方法進(jìn)行驗證衛(wèi)生部診療規(guī)范及三大指南推薦FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）

2p23ALKFISH檢測原理normal3’5’RearrangementpositiveinversionwithEML4-ALK

fusionRearrangementNegative細(xì)胞內(nèi)陽性信號幾種常見形式（1）融合信號和橙/綠色分離信號（為經(jīng)典的、主要的陽性信號形式）；（2）融合信號和單獨的橙色信號（綠色信號缺失）；（3）單獨的橙/綠分離信號。

Vysis

?ALKFISH:ALKDualColorBreakApartRearrangementProbe陰性細(xì)胞陽性細(xì)胞判斷方法優(yōu)勢：分離信號，直觀可信；大部分病例敏感，易判斷。不足：對細(xì)胞量少的病例；接近cutoff病例；保存年份久/前處理欠佳的病例；無信號，部分信號弱其他異常信號特征的判斷及其價值：需要進(jìn)一步驗證

單拷貝？以單獨綠色信號？（5’-缺失）檢測體會FISH方法問題：假陰性Split-signalFISHResult:假陰性假陰性Microscope:Sample/nucleus:Slide:FISH方法:

15%陽性細(xì)胞Cutoff值的合理性

1426例NSCLC患者接受FISH檢測FISH陽性細(xì)胞數(shù)患者占比0%-9%79.3%10%-15%8.5%16%-30%1.4%31%-50%2.7%>50%8.1%DR.Camidge,etal.Cancer2013DiscrepanciesbetweenFISHandimmunohistochemistryforassessmentoftheALKstatusareassociatedwithALK'borderline'-positiverearrangementsorahighcopynumber:apotentialmajorissueforanti-ALKtherapeuticstrategies.IlieMI1,BenceC2,HofmanV3,Long-MiraE1,ButoriC2,BouhlelL4,LalvéeS2,MourouxJ5,PoudenxM4,OttoJ6,MarquetteCH7,HofmanP8.

AnnOncol.2015Jan;26(1):238-44.M.IIlie,etal.AnnalsofOncology,2014176例肺腺癌患者使用FISH、VentanaIHC、PCR檢測ALK狀態(tài)

1例患者FISH陽性，IHC陰性，克唑替尼效果不佳

5例FISH臨界陽性患者，克唑替尼療效與Cmet狀態(tài)有關(guān)FISH

bordline陽性，IHC陰性患者接受克唑替尼治療效果不佳FISH不典型，IHC陽性患者接受克唑替尼治療有效衛(wèi)生部診療規(guī)范及三大指南推薦FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）

免疫組織化學(xué)檢測ALK融合蛋白

優(yōu)勢:可用于常規(guī)檢測、快速、性價比高IASLCATLASofALKTestinginLungCancer,Chapter4,2013生物學(xué)基礎(chǔ)：ALKmRNA正常狀態(tài)下，僅微量存在與小腸大腦等，肺部未檢出；未發(fā)生ALK融合的肺癌，ALK蛋白幾乎不表達(dá)VentanaIHC試劑設(shè)計ALK融合蛋白:無ALK重排的NSCLC不表達(dá)ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表達(dá)較低VentanaIHC的原理:使用具有高度敏感性和特異性的一抗——D5F3全自動儀操作，充分保證特異性獨有Optiview擴增技術(shù)，充分保證敏感性D5F3rabbittmonoclonalantibodyOptiviewDABIHCDetectionOptiviewAmplificationKit雙向結(jié)果:

大部分病例“陽”或“陰”敏感性高:

均為強陽性顆粒，不用判斷強度和百分比重復(fù)性好:

不同人判斷無腫瘤細(xì)胞量要求VENTANA?anti-ALK(D5F3)IHC檢測優(yōu)勢Ventana

IHC與FISH檢測結(jié)果比較FISH總數(shù)敏感性特異性一致率陽性陰性VentanaIHC(1)陽性46753100%98.20%98.40%陰性0377377VentanaIHC(2)陽性3103194%100%99.10%陰性2198200VentanaIHC(2)陽性32032100%100%100%陰性0217217VentanaIHC(3)陽性4024291%96%94%陰性45357VentanaIHC(4)陽性1801890%100%99.60%陰性2503505(1)JinghuiWang,etal.PLoSONE20149(7):e101551(2)EugenC.Minca,etal.JMolDiagn2013,15:341-346(3)MurryW.Wynes,etal.JThoracOncol.2014;9:631–638(4)Greta,etal.ArchPatholLabMed.doi:10.5858/arpa.2013-0388-OAIHC典型陽性、陰性病例IHC陽性（FISH陽性）IHC陰性（FISH陰性)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院資料VentanaIHC可重復(fù)性高全自動檢測，避免操作流程中的誤差，可重復(fù)性好VentanaALK(D5F3)的CFDA注冊臨床實驗

三家公立醫(yī)院超過1100例NSCLC樣本進(jìn)行VentanaALK(D5F3)與FISHALK結(jié)果的對比驗證實驗結(jié)果表明VentanaALK(D5F3)與FISHALK的一致性為99.23%VentanaIHC試劑盒已于2013.8已于2013.8已于2013.8獲得CFDA批準(zhǔn)LDK378全球III期臨床使用VentanaIHC做為伴隨診斷方法LDK378VersusChemotherapyinPreviouslyUntreatedPatientsWithALKRearrangedNon-smallCellLungCancer（NCT01828099）EstimatedEnrollment:348StudyStartDate:July2013EstimatedStudyCompletionDate:June2018InclusionCriteria:Patienthasahistologicallyorcytologicallyconfirmeddiagnosisofnon-squamousNon-smallcelllungcancer(NSCLC)thatisAnaplasticlymphomakinase(ALK)positiveasassessedby

theVentanaImmunohistochemistry(IHC)test.ThetestwillbeperformedatNovartisdesignatedcentrallaboratories.PatienthasnewlydiagnosedstageIIIB(whoarenotacandidatefordefinitivemultimodalitytherapy)orstageIVNSCLCorrelapsedlocallyadvancedormetastaticNSCLCnotpreviouslytreatedwithanysystemicanti-cancertherapy(e.g.cytotoxicdrugs,monoclonalantibodytherapy,crizotiniborotherALKinhibitors,orothertargetedtherapies,eitherexperimentalornot),withexceptionofneo-adjuvantoradjuvanttherapyPatienthasatleastonemeasurablelesionasdefinedbyRECIST1.1.ApreviouslyirradiatedsitelesionmayonlybecountedasatargetlesionifthereisclearsignofprogressionsincetheirradiationAlectinib全球III期臨床亦使用VentanaIHC做為伴隨診斷方法ALEXStudy:ARandomized,PhaseIIIStudyComparingAlectinibWithCrizotinibinTreatment-NaiveAnaplasticLymphomaKinase(ALK)-PositiveAdvancedNon-SmallCellLungCancer(NSCLC)Patients(NCT02075840)EstimatedEnrollment:286StudyStartDate:August2014EstimatedStudyCompletionDate:December2017InclusionCriteria:Histologicallyorcytologicallyconfirmeddiagnosisofadvancedorrecurrent(StageIIIBnotamenableformultimodalitytreatment)ormetastatic(StageIV)NSCLCthatisALK-positiveasassessedbytheVentanaIHCtestAge>/=18yearsoldLifeexpectancyofatleast12weeksECOGPSof0-2Patientshadnopriorsystemictreatmentforadvancedorrecurrent(StageIIIBnotamenableformultimodalitytreatment)ormetastatic(StageIV)NSCLCAdequaterenal,hematologicandliverfunctionPatientsmusthaverecoveredfromeffectsofanymajorsurgeryorsignificanttraumaticinjuryatleast28daysbeforethefirstdoseofstudytreatmentMeasurabledisease(byRECISTv1.1)priortotheadministrationofstudytreatmentPriorbrainorleptomeningealmetastasesallowedifasymptomatic(e.g.,diagnosedincidentallyatstudybaseline).AsymptomaticCNSlesionsmightbetreatedatthediscretionoftheinvestigatorperlocalclinicalpractice.IfpatientshaveneurologicalsymptomsorsignsduetoCNSmetastasis,patientsneedtocompletewholebrainradiationorgammaknifeirradiationtreatment.Inallcases,radiationtreatmentmustbecompletedatleast14daysbeforeenrollmentandpatientsmustbeclinicallystableUseofhighlyeffectivecontraceptionasdefinedbythestudyprotocolVENTANA?ALKIHC不足之處假陰性：（1）受固定時間和類型影響:

atleast6hoursin10%neutralbufferedformalin(NBF)orzincformalin.Fixationtimesandtypesotherthanrecommendedcanleadtofalsenegativeresults.（2）切片時間不能長:

within3monthsofsectioning.LossofstainingperformancehasbeenobservedwiththeVENTANAanti-ALK(D5F3)onsectionsthathavebeenstoredatroomtemperatureforlongerthan3months.假陽性：小細(xì)胞肺癌？鱗癌？非特異染色？陽性強度？

衛(wèi)生部診療規(guī)范及三大指南推薦FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）

Real-timePCRdetectionofALKfusionmRNA樣品編號6艾德EML4-ALK結(jié)果RT-PCR結(jié)果FISH結(jié)果1MutationV1FISH+2Mutation

FISH+3MutationV2FISH+4MutationV3a/bFISH+5MutationV1FISH+6MutationV3a/bFISH+7MutationV1FISH+8MutationV3a/3bFISH+9MutationV2FISH+10MutationV3bFISH+11MutationV3a/bFISH+12MutationV1FISH+13MutationV2FISH+14MutationV2FISH+15MutationV1FISH+16MutationV1(EML4E10a/b,E13:A20)FISH+17MutationV1FISH+18MutationV1FISH+19MutationV1FISH+20MutationV1FISH+21MutationV1FISH+22MutationV1FISH+23Mutation

FISH+24MutationV3a/b(E6a/b:ALKintron18bp:E20FISH+25MutationV3a/bFISH+26MutationV1FISH+27WT

FISH+28WT

FISH+29WT

FISH+30WT

FISH+Real-timePCRn=9830

FISH(+)26RT-PCR(+)Sensitivity:26/30(86.7%)Real-timePCRdetectionofALKfusionmRNA(ourexperience)RACE-PCR或RT-PCR：融合序列捕獲的確定性

Takeuchietal.ClinCancerRes2008;14(20):6618Zhangetal.Molecularcancer2010腫瘤醫(yī)院數(shù)據(jù)分享臨床前研究：400例（多中心共1000多例）臨床病例檢測：

FISH——2011.12~2015.02

1086例IHC——2013.1~2015.021024例（ventana)

同時做FISH和IHC：807例肺腺癌中ALK重排

FISH法檢測肺癌中ALK基因重排

例數(shù)比例（%）陰性922922/1042(88.5%)陽性120120/1042(11.5%)無法判讀4444/1086(4.05%)合計1086

ALKprevalenceinChinaAuthorALKincidencePublicationsZhangX,WuYLetal.11.6%(12/103)MolCancer2009Wong,etal.(Hongkong)4.9%(13/265)Cancer2009LiH,ChenHQ,etal.3.0%(7/230smokers,AC)LungCancer2012SunY,ChenH,JiH,etal.5.8%(3/52surgicalAC,non-smokers)JCO2010WuSG,YangPC,etal.(Taiwan)34%(39/116,AC,WTEGFR)JTO2012RikovaK,etal4.7%(6/137)Cell2007WangZ,WangJ,etal.9.7%(11/113,StageIV)Oncology2012RenS,ZhouC,etal.9.6%(10/104,Female,AC,non-smoker)CellBiochemBiophys.2012;Cancer2012[GLCIinternaldata:7%(70/977);7.7%(31/400)]ALK重排與EGFR突變ALK重排與EGFR突變狀態(tài)的關(guān)系

例數(shù)ALK陽性例數(shù)（%）EGFR無突變40479(16.4%)EGFR有突變3241(0.031%)合計82880(9.7%）ALK重排不同檢測比較FISH與VentanaIHC檢測ALK易位結(jié)果比較

IHC

陰性陽性無法判讀合計陰性67845687FISH陽性178382無法判讀326038

合計711888807FISH和