大豆品種抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范

1主題內(nèi)容和適用范圍本規(guī)范規(guī)定了大豆品種胞囊線蟲病抗性鑒定技術(shù)和抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)范適用于安徽省主要農(nóng)作物品種審定中大豆胞囊線蟲病抗性鑒定和抗性評(píng)價(jià)。本規(guī)范同時(shí)適用于安徽省大豆品種區(qū)域試驗(yàn)、生產(chǎn)試驗(yàn)和自然誘發(fā)鑒定中大豆胞囊線蟲病病情調(diào)查和抗性評(píng)價(jià)。3術(shù)語(yǔ)和定義3.1大豆胞囊線蟲病SoybeanCystNamatode由大豆異皮線蟲(HeteroderaglycinesIchinche)所引起的以葉部黃化和植株矮化癥狀為主的大豆線蟲病害。3.2對(duì)照品種本規(guī)范中特指為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性，在品種鑒定時(shí)附加的在特定生態(tài)區(qū)表現(xiàn)為已知抗病程度的抗病品種（Peking）或感病品種（Lee）。3.3胞囊指數(shù)通過(guò)對(duì)植株個(gè)體根部著生胞囊數(shù)值的綜合計(jì)算所獲得的群體發(fā)病程度的數(shù)值化描述形式。4、病原物4.1病原物來(lái)源在安徽大豆產(chǎn)區(qū)的不同生態(tài)區(qū)采集大豆胞囊線蟲，按生理小種（群）建立菌種庫(kù)。4.2接種體接種體一般為單個(gè)生理小種，或淮北、江淮丘陵、沿江等生態(tài)區(qū)內(nèi)不同生理小種的混合菌種，一般根據(jù)委托單位要求從菌種庫(kù)中制備。沒(méi)有特定要求的情況下，接種體為菌種庫(kù)中最新的病原物。4.3．供試大豆胞囊線蟲繁殖（用有胞囊的土壤繁殖）采集的土壤胞囊線蟲密度在30個(gè)胞囊/100克土壤或60個(gè)卵/克土壤時(shí)可以直接進(jìn)行抗性鑒定。如果線蟲量低于以上標(biāo)準(zhǔn)，要種植多個(gè)感病品種進(jìn)行1代的擴(kuò)繁。4.4大豆胞囊線蟲卵的分離和卵懸浮液配備通過(guò)漂浮過(guò)篩法進(jìn)行胞囊分離，獲得的胞囊采用組織細(xì)胞勻漿器破碎胞囊后過(guò)200目網(wǎng)篩后在500目網(wǎng)篩下收集卵，并配成200粒卵/ml的卵懸浮液。5鑒定圃5.1選擇在有較好生態(tài)代表性的試驗(yàn)基地建立胞囊分布均勻的田間病圃，具體條件符合4.3規(guī)定。5.2自然誘發(fā)鑒定試驗(yàn)圃應(yīng)當(dāng)選擇在淮北、江淮丘陵、沿江等生態(tài)區(qū)內(nèi)大豆生產(chǎn)集中產(chǎn)區(qū)。5.3鑒定圃設(shè)計(jì)、種植和管理因鑒定方法不同而異，具體見6.1，6.2。6鑒定6.1田間病圃鑒定法6.1.1．種植方法選擇符合要求的病圃，6月上中旬播種，每份材料種1行，行長(zhǎng)2米，留苗15-20株，2次重復(fù)。鑒定品種中加入抗病或感病的對(duì)照品種。6.1.2．病情調(diào)查播種出苗后正常田間管理，播后第26-29天檢測(cè)抗性對(duì)照品種根部的大豆胞囊線蟲的發(fā)育情況，當(dāng)大豆胞囊線蟲白色的雌蟲突出表皮時(shí)，即可進(jìn)行挖查，調(diào)查記錄每株大豆根上的白色胞囊的數(shù)量。挖查過(guò)晚或過(guò)早，調(diào)查結(jié)果都不準(zhǔn)確。每個(gè)品種每次重復(fù)調(diào)查15株，共調(diào)查30株。病情調(diào)查記載表格式見附錄A，附錄A-1.A-2由鑒定單位自行選擇一種。6.2人工接種（盆栽）鑒定法6.2.1供試土壤采用無(wú)線蟲胞囊的土壤，按2：1的比例混入細(xì)紗裝入花盆或薄塑料杯備用。6.2.2．接種方法鑒定在溫室中進(jìn)行，將裝入花盆或薄塑料杯備用的土壤澆透水后，每個(gè)用鉛筆或木棍在花盆或薄塑料杯的對(duì)稱處扎兩個(gè)小孔，將供試鑒別寄主大豆品種催芽后待根長(zhǎng)出1cm左右時(shí)挑選均勻的豆苗，播入小孔中，每個(gè)孔中澆灌（含200粒卵/ml）5ml卵懸浮液后覆土封蓋后培養(yǎng)。每品種播種20株，25℃下正常管理。每次加10株感病對(duì)照品種。如果在塑料杯中鑒定，每杯種1株，接種（含200粒卵/ml）5ml卵懸浮液。6.2.3病情調(diào)查播種25天后檢測(cè)感病品種根部的大豆胞囊線蟲的發(fā)育情況，當(dāng)大豆胞囊線蟲白色的雌蟲突出表皮時(shí)，即可進(jìn)行扣盆調(diào)查記錄每株大豆根上的白色胞囊的數(shù)量。每個(gè)品種調(diào)查20株。病情調(diào)查記載表格式見附錄A，附錄A-1.A-2由鑒定單位自行選擇一種。6.2.4鑒定調(diào)查記載表要有鑒定人員和復(fù)核人員簽字。在開展鑒定調(diào)查時(shí)，鑒定人員與復(fù)核人員一同進(jìn)行，鑒定人員對(duì)鑒定植株病情級(jí)別進(jìn)行判斷，經(jīng)復(fù)核人員確認(rèn)后記載。6.3抗性分離現(xiàn)象記載若一個(gè)鑒定群體中出現(xiàn)明顯的抗、感類型，應(yīng)在調(diào)查表中注明“抗性分離”。用/表示。6.4一般只選擇6.1或6.2中一種方法進(jìn)行鑒定。如果選用2種方法鑒定，鑒定單位要對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)定。7抗性評(píng)價(jià)71抗性類別劃分標(biāo)準(zhǔn)7.1.1田間病圃鑒定法抗性類別劃分標(biāo)準(zhǔn)（表1）7.1.2盆栽鑒定法抗性類別劃分標(biāo)準(zhǔn)（表2-南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用標(biāo)準(zhǔn)）胞囊指數(shù)保留1位小數(shù)。表1田間病圃鑒定法抗性類別劃分標(biāo)準(zhǔn)抗性級(jí)別根系平均胞囊數(shù)量抗性類別縮寫類別10I免疫30.1-3.0R抗53.1-10.0MR中抗710.1-30.0S感9＞30HS高感表2盆栽鑒定法抗性類別劃分標(biāo)準(zhǔn)抗性級(jí)別胞囊指數(shù)%抗性類別縮寫類別10I免疫30.1-15R抗515.1-40MR中抗740.1-70S感9>70HS高感7.2有效性判別采用田間病圃鑒定法鑒定的，對(duì)照感病品種或鑒定對(duì)象中有任一品種的抗性級(jí)別達(dá)到7-9的，該批次鑒定有效；采用人工接種（盆栽）鑒定法鑒定的，對(duì)照感病品種或鑒定對(duì)象中有任一品種的根系胞囊數(shù)量達(dá)到在30個(gè)以上的，該批次鑒定有效。7.3重復(fù)鑒定同一鑒定品種的抗性級(jí)別一年為5，另一年在5以下或5以上的，如果兩年抗性級(jí)別相差2個(gè)級(jí)別以上（包括2個(gè)級(jí)別）的，則需要做第三次抗性鑒定?；蛞荒暝?以上，另一年在5以下的，則需要做第三次抗性鑒定。7.4抗性評(píng)價(jià)7.4.1在有3年鑒定的結(jié)果中，如有2年的抗性類別是一致的，則此抗性類別作為最終鑒定結(jié)論。7.4.2達(dá)到免疫-抗或感-高感類別的鑒定品種，當(dāng)兩年抗性類別不一致時(shí)，以記載的最高根系胞囊數(shù)量或胞囊指數(shù)所對(duì)應(yīng)的抗性類別為準(zhǔn)。7.4.3同一鑒定品種的抗性級(jí)別一年為5級(jí)，一年在5以下或5以上的，如果兩年抗性級(jí)別相差1個(gè)等級(jí)，用兩年根系平均胞囊數(shù)量或胞囊指數(shù)的平均數(shù)，對(duì)照7.1標(biāo)準(zhǔn)重新劃分抗性類別；如果兩年抗性級(jí)別相差2個(gè)級(jí)別以上（包括2個(gè)級(jí)別）的，則需要做第三次抗性鑒定，與相差1個(gè)等級(jí)的根系平均胞囊數(shù)量或胞囊指數(shù)平均，重新劃分抗性類別，或在其他情況下直接用3次鑒定的根系胞囊數(shù)量或胞囊指數(shù)平均，重新劃分抗性類別。7.4.4同一鑒定品種的抗性級(jí)別一年在5以上，另一年在5以下的,則需要做第三次抗性鑒定，按7.4.1～7.4.3規(guī)則重新劃分抗性類別。3術(shù)語(yǔ)和定義3.1大豆花葉病毒病soybeanmosaicvirus由大豆花葉病毒(soybeanmosaicvirus，SMV)所引起的以葉部花葉、皺縮和植株矮化癥狀為主的大豆病毒病害。3.2對(duì)照品種checkvariety本規(guī)范中特指為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性，在品種鑒定時(shí)附加的抗病品種（誘變30）和感病品種（南農(nóng)1138-2）。4病原物4.1病原物來(lái)源在安徽大豆產(chǎn)區(qū)的不同生態(tài)區(qū)采集由SMV侵染引起的大豆花葉病病葉，按病毒株系建立菌種庫(kù)。4.2接種體接種體一般為單個(gè)SMV株系，或特定生態(tài)區(qū)內(nèi)不同SMV病葉的混合病原物，一般根據(jù)委托單位要求從菌種庫(kù)中制備。沒(méi)有特定要求的情況下，接種體為菌種庫(kù)中最新的病原物。5鑒定圃5.1選擇在有較好生態(tài)代表性的試驗(yàn)基地建立田間病圃。5.2自然誘發(fā)鑒定試驗(yàn)圃應(yīng)當(dāng)選擇在淮北、江淮丘陵、沿江等生態(tài)區(qū)內(nèi)大豆生產(chǎn)集中產(chǎn)區(qū)。5.3鑒定圃設(shè)計(jì)、種植和管理因鑒定方法不同而異，隨機(jī)區(qū)組排列，具體見6.1，6.2。大豆生育前期不滅蚜，依靠蚜蟲傳毒造成發(fā)病。6鑒定6.1田間病圃自然誘發(fā)鑒定法6.1.1選擇符合要求的鑒定圃，在比較接近生產(chǎn)的條件下進(jìn)行鑒定，鑒定品種數(shù)目適當(dāng)。6.1.2一般采用人工摩擦接種與自然誘發(fā)相結(jié)合的方法。發(fā)病前期蚜蟲發(fā)生較少時(shí)，可用人工汁液摩擦接種。6.1.3在病圃中，每個(gè)鑒定品種種植一行，每行種植25-30粒種子，行距為50cm，出苗后間苗，保證一定株距。每隔10行各種植1行抗病和感病對(duì)照品種，2次重復(fù)。6.1.4出苗后檢苗，拔除種傳毒苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出第1片復(fù)葉時(shí)，把帶毒的蚜蟲移至復(fù)葉上。為了保證傳毒效果，在大豆開花前不施藥滅蚜蟲。由于整個(gè)大豆生長(zhǎng)期間蚜蟲不斷的繁殖和傳播病毒，被鑒定的大豆材料容易被病毒侵染。田間病圃鑒定，由于病毒為田間混合群體，難以反映被鑒定大豆材料對(duì)單一病毒株系的抗病性。田間病圃鑒定受自然環(huán)境影響較大，發(fā)病程度不穩(wěn)定，只能作為輔助鑒定。6.2人工接種鑒定法6.2.1．準(zhǔn)備工作⑴整個(gè)接種試驗(yàn)在防蟲溫室或網(wǎng)室中進(jìn)行。⑵種植材料基質(zhì)用沙或沙：壤土（1：1）。接種前，研缽、研棒用洗潔劑洗凈，放入微波爐中處理3分鐘，接種刷（即油畫筆）用洗潔劑洗凈后，在紫外燈下照射半小時(shí)，避免不同病毒、株系的交叉感染。選用600目金剛砂，配制0.1MpH7.5的磷酸緩沖液（配方：Na2HPO4?12H2O71.6g和KH2PO4?12H2O6.8g，加純凈水2400ml攪拌使其溶解，調(diào)pH到7.3-7.5，定容到2500ml）備用。⑶網(wǎng)室中毒源繁殖和保存期間，定期噴藥殺滅蚜蟲，以保證試驗(yàn)毒源的純度。⑷接種體制備。見4.2。⑸病毒的繁殖在防蟲溫室或網(wǎng)室內(nèi)，采用盆栽種植感病品種（南農(nóng)1138-2），出苗后檢苗，淘汰種傳毒苗，每盆留苗8～10株。將低溫保存的SMV病葉在研缽中用少量0.1MpH7.5的磷酸緩沖液(1克新鮮病葉加3-5ml緩沖液)和600目金剛砂研碎，用接種刷蘸取汁液均勻摩擦接種于感病品種（南農(nóng)1138-2）第一對(duì)充分展開的真葉上，接種后立即用清水沖洗葉片上多余的汁液。每接完一個(gè)病毒樣本后，換一次性手套。發(fā)病的葉片裝入無(wú)菌塑料袋放低溫冰箱保存，或者隔3個(gè)月接種繁殖一次。6.2.2種植將鑒定品種條播種植在防蟲網(wǎng)室中，每行種植25-50粒種子，行距為50cm，2次重復(fù)。防止葉片間摩擦傳毒，檢驗(yàn)苗后每行留苗15～30株，單株之間留5～10cm的間隙。6.2.3接種將在感病對(duì)照品種（南農(nóng)1138-2）上繁殖的病樣接種于第一對(duì)完全展開的真葉上。大約1周后，在第一片展開的復(fù)葉上進(jìn)行第二次接種，以保證每一單株都被接上病毒。6.3病情調(diào)查6.3.1接種后30天內(nèi)（接種后第20天觀察一次，第30天復(fù)查一次）連續(xù)觀察寄主的反應(yīng)；逐株記載癥狀、病情級(jí)別。6.3.2按癥狀分別記載接種葉和上位葉的癥狀反應(yīng)，系統(tǒng)花葉記為“M”；葉脈壞死、頂枯或枯斑均視為壞死，以“N”表示；無(wú)癥狀記為“0”。凡上位葉出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀者為感病，每個(gè)感病單株根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分為相應(yīng)的級(jí)別。上位葉片無(wú)癥狀或只在接種葉上出現(xiàn)局部枯斑的為抗病。對(duì)無(wú)癥狀植株的參試品種進(jìn)行再次播種，重復(fù)鑒定以進(jìn)一步確認(rèn)。6.3.3鑒定調(diào)查記載表要有鑒定人員和復(fù)核人員簽字。在開展鑒定調(diào)查時(shí)，鑒定人員與復(fù)核人員一同進(jìn)行，鑒定人員對(duì)鑒定植株病情級(jí)別進(jìn)行判斷，經(jīng)復(fù)核人員確認(rèn)后記載。6.4病情指數(shù)計(jì)算病情指數(shù)保留1位小數(shù)。6.5抗性分離記載若一個(gè)鑒定群體中出現(xiàn)明顯的抗、感類型，應(yīng)在調(diào)查表中注明“抗性分離”，用/表示。6.6病情級(jí)別劃分標(biāo)準(zhǔn)個(gè)體按鑒定品種癥狀的嚴(yán)重度分級(jí)。一般將癥狀按花葉、壞死兩種類型分別考慮，各分為5級(jí)。病害調(diào)查時(shí)，如在同一植株上同時(shí)出現(xiàn)花葉和壞死兩種癥狀，病害級(jí)別取級(jí)別高者。單株病情嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Z(yǔ)hi等（ZhiHaijian，2004中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)）的方法：6.61花葉型（見圖1）病情級(jí)別劃分標(biāo)準(zhǔn)：病情級(jí)別癥狀0無(wú)癥狀或僅在接種葉上出現(xiàn)局部枯班1輕花葉2黃斑花葉、葉片輕度皺縮3重花葉、葉片皺縮卷曲4葉片嚴(yán)重皺縮且植株矮化6.62壞死型（見圖2）病情級(jí)別劃分標(biāo)準(zhǔn)：病情級(jí)別癥狀0無(wú)癥狀或僅在接種葉上出現(xiàn)局部枯班1部分葉片上出現(xiàn)可見微小壞死斑2多數(shù)壞死斑直徑在5mm以下或有小葉脈壞死3壞死斑連片或壞死葉脈長(zhǎng)度在20mm以上4葉片因壞死脫落，或壞死面積超過(guò)葉片總面積50%，或出現(xiàn)頂枯，不能繼續(xù)生長(zhǎng)7抗性評(píng)價(jià)7.1抗性類別劃分標(biāo)準(zhǔn)抗性級(jí)別病情指數(shù)抗性類別縮寫類別1＜10HR高抗310.1-30R抗530.1-50MR中抗750.1-70S感9＞70HS高感7.2有效性判別對(duì)照感病品種或任一鑒定品種的抗性級(jí)別達(dá)到7-9，該批次鑒定有效。7.3重復(fù)鑒定同一鑒定品種的抗性級(jí)別一年為5，另一年在5以下或5以上的，如果兩年抗性級(jí)別相差2個(gè)級(jí)別以上（包括2個(gè)級(jí)別）的，則需要做第三次抗性鑒定。或一年在5以上，另一年在5以下的，則需要做第三次抗性鑒定。7.4抗性評(píng)價(jià)7.4.1在有3年鑒定的結(jié)果中，如有2年的抗性類別是一致的，則此抗性類別作為最終鑒定結(jié)論。7.4.2達(dá)到高抗-抗或感-高感類別的鑒定品種，當(dāng)兩年抗性類別不