大豆品種抗病性鑒定技術規(guī)范

1主題內容和適用范圍本規(guī)范規(guī)定了大豆品種胞囊線蟲病抗性鑒定技術和抗病性評價標準。本規(guī)范適用于安徽省主要農作物品種審定中大豆胞囊線蟲病抗性鑒定和抗性評價。本規(guī)范同時適用于安徽省大豆品種區(qū)域試驗、生產試驗和自然誘發(fā)鑒定中大豆胞囊線蟲病病情調查和抗性評價。3術語和定義3.1大豆胞囊線蟲病SoybeanCystNamatode由大豆異皮線蟲(HeteroderaglycinesIchinche)所引起的以葉部黃化和植株矮化癥狀為主的大豆線蟲病害。3.2對照品種本規(guī)范中特指為檢驗試驗的可靠性，在品種鑒定時附加的在特定生態(tài)區(qū)表現(xiàn)為已知抗病程度的抗病品種（Peking）或感病品種（Lee）。3.3胞囊指數通過對植株個體根部著生胞囊數值的綜合計算所獲得的群體發(fā)病程度的數值化描述形式。4、病原物4.1病原物來源在安徽大豆產區(qū)的不同生態(tài)區(qū)采集大豆胞囊線蟲，按生理小種（群）建立菌種庫。4.2接種體接種體一般為單個生理小種，或淮北、江淮丘陵、沿江等生態(tài)區(qū)內不同生理小種的混合菌種，一般根據委托單位要求從菌種庫中制備。沒有特定要求的情況下，接種體為菌種庫中最新的病原物。4.3．供試大豆胞囊線蟲繁殖（用有胞囊的土壤繁殖）采集的土壤胞囊線蟲密度在30個胞囊/100克土壤或60個卵/克土壤時可以直接進行抗性鑒定。如果線蟲量低于以上標準，要種植多個感病品種進行1代的擴繁。4.4大豆胞囊線蟲卵的分離和卵懸浮液配備通過漂浮過篩法進行胞囊分離，獲得的胞囊采用組織細胞勻漿器破碎胞囊后過200目網篩后在500目網篩下收集卵，并配成200粒卵/ml的卵懸浮液。5鑒定圃5.1選擇在有較好生態(tài)代表性的試驗基地建立胞囊分布均勻的田間病圃，具體條件符合4.3規(guī)定。5.2自然誘發(fā)鑒定試驗圃應當選擇在淮北、江淮丘陵、沿江等生態(tài)區(qū)內大豆生產集中產區(qū)。5.3鑒定圃設計、種植和管理因鑒定方法不同而異，具體見6.1，6.2。6鑒定6.1田間病圃鑒定法6.1.1．種植方法選擇符合要求的病圃，6月上中旬播種，每份材料種1行，行長2米，留苗15-20株，2次重復。鑒定品種中加入抗病或感病的對照品種。6.1.2．病情調查播種出苗后正常田間管理，播后第26-29天檢測抗性對照品種根部的大豆胞囊線蟲的發(fā)育情況，當大豆胞囊線蟲白色的雌蟲突出表皮時，即可進行挖查，調查記錄每株大豆根上的白色胞囊的數量。挖查過晚或過早，調查結果都不準確。每個品種每次重復調查15株，共調查30株。病情調查記載表格式見附錄A，附錄A-1.A-2由鑒定單位自行選擇一種。6.2人工接種（盆栽）鑒定法6.2.1供試土壤采用無線蟲胞囊的土壤，按2：1的比例混入細紗裝入花盆或薄塑料杯備用。6.2.2．接種方法鑒定在溫室中進行，將裝入花盆或薄塑料杯備用的土壤澆透水后，每個用鉛筆或木棍在花盆或薄塑料杯的對稱處扎兩個小孔，將供試鑒別寄主大豆品種催芽后待根長出1cm左右時挑選均勻的豆苗，播入小孔中，每個孔中澆灌（含200粒卵/ml）5ml卵懸浮液后覆土封蓋后培養(yǎng)。每品種播種20株，25℃下正常管理。每次加10株感病對照品種。如果在塑料杯中鑒定，每杯種1株，接種（含200粒卵/ml）5ml卵懸浮液。6.2.3病情調查播種25天后檢測感病品種根部的大豆胞囊線蟲的發(fā)育情況，當大豆胞囊線蟲白色的雌蟲突出表皮時，即可進行扣盆調查記錄每株大豆根上的白色胞囊的數量。每個品種調查20株。病情調查記載表格式見附錄A，附錄A-1.A-2由鑒定單位自行選擇一種。6.2.4鑒定調查記載表要有鑒定人員和復核人員簽字。在開展鑒定調查時，鑒定人員與復核人員一同進行，鑒定人員對鑒定植株病情級別進行判斷，經復核人員確認后記載。6.3抗性分離現(xiàn)象記載若一個鑒定群體中出現(xiàn)明顯的抗、感類型，應在調查表中注明“抗性分離”。用/表示。6.4一般只選擇6.1或6.2中一種方法進行鑒定。如果選用2種方法鑒定，鑒定單位要對鑒定結果進行綜合評定。7抗性評價71抗性類別劃分標準7.1.1田間病圃鑒定法抗性類別劃分標準（表1）7.1.2盆栽鑒定法抗性類別劃分標準（表2-南京農業(yè)大學用標準）胞囊指數保留1位小數。表1田間病圃鑒定法抗性類別劃分標準抗性級別根系平均胞囊數量抗性類別縮寫類別10I免疫30.1-3.0R抗53.1-10.0MR中抗710.1-30.0S感9＞30HS高感表2盆栽鑒定法抗性類別劃分標準抗性級別胞囊指數%抗性類別縮寫類別10I免疫30.1-15R抗515.1-40MR中抗740.1-70S感9>70HS高感7.2有效性判別采用田間病圃鑒定法鑒定的，對照感病品種或鑒定對象中有任一品種的抗性級別達到7-9的，該批次鑒定有效；采用人工接種（盆栽）鑒定法鑒定的，對照感病品種或鑒定對象中有任一品種的根系胞囊數量達到在30個以上的，該批次鑒定有效。7.3重復鑒定同一鑒定品種的抗性級別一年為5，另一年在5以下或5以上的，如果兩年抗性級別相差2個級別以上（包括2個級別）的，則需要做第三次抗性鑒定?；蛞荒暝?以上，另一年在5以下的，則需要做第三次抗性鑒定。7.4抗性評價7.4.1在有3年鑒定的結果中，如有2年的抗性類別是一致的，則此抗性類別作為最終鑒定結論。7.4.2達到免疫-抗或感-高感類別的鑒定品種，當兩年抗性類別不一致時，以記載的最高根系胞囊數量或胞囊指數所對應的抗性類別為準。7.4.3同一鑒定品種的抗性級別一年為5級，一年在5以下或5以上的，如果兩年抗性級別相差1個等級，用兩年根系平均胞囊數量或胞囊指數的平均數，對照7.1標準重新劃分抗性類別；如果兩年抗性級別相差2個級別以上（包括2個級別）的，則需要做第三次抗性鑒定，與相差1個等級的根系平均胞囊數量或胞囊指數平均，重新劃分抗性類別，或在其他情況下直接用3次鑒定的根系胞囊數量或胞囊指數平均，重新劃分抗性類別。7.4.4同一鑒定品種的抗性級別一年在5以上，另一年在5以下的,則需要做第三次抗性鑒定，按7.4.1～7.4.3規(guī)則重新劃分抗性類別。3術語和定義3.1大豆花葉病毒病soybeanmosaicvirus由大豆花葉病毒(soybeanmosaicvirus，SMV)所引起的以葉部花葉、皺縮和植株矮化癥狀為主的大豆病毒病害。3.2對照品種checkvariety本規(guī)范中特指為檢驗試驗的可靠性，在品種鑒定時附加的抗病品種（誘變30）和感病品種（南農1138-2）。4病原物4.1病原物來源在安徽大豆產區(qū)的不同生態(tài)區(qū)采集由SMV侵染引起的大豆花葉病病葉，按病毒株系建立菌種庫。4.2接種體接種體一般為單個SMV株系，或特定生態(tài)區(qū)內不同SMV病葉的混合病原物，一般根據委托單位要求從菌種庫中制備。沒有特定要求的情況下，接種體為菌種庫中最新的病原物。5鑒定圃5.1選擇在有較好生態(tài)代表性的試驗基地建立田間病圃。5.2自然誘發(fā)鑒定試驗圃應當選擇在淮北、江淮丘陵、沿江等生態(tài)區(qū)內大豆生產集中產區(qū)。5.3鑒定圃設計、種植和管理因鑒定方法不同而異，隨機區(qū)組排列，具體見6.1，6.2。大豆生育前期不滅蚜，依靠蚜蟲傳毒造成發(fā)病。6鑒定6.1田間病圃自然誘發(fā)鑒定法6.1.1選擇符合要求的鑒定圃，在比較接近生產的條件下進行鑒定，鑒定品種數目適當。6.1.2一般采用人工摩擦接種與自然誘發(fā)相結合的方法。發(fā)病前期蚜蟲發(fā)生較少時，可用人工汁液摩擦接種。6.1.3在病圃中，每個鑒定品種種植一行，每行種植25-30粒種子，行距為50cm，出苗后間苗，保證一定株距。每隔10行各種植1行抗病和感病對照品種，2次重復。6.1.4出苗后檢苗，拔除種傳毒苗。當幼苗長出第1片復葉時，把帶毒的蚜蟲移至復葉上。為了保證傳毒效果，在大豆開花前不施藥滅蚜蟲。由于整個大豆生長期間蚜蟲不斷的繁殖和傳播病毒，被鑒定的大豆材料容易被病毒侵染。田間病圃鑒定，由于病毒為田間混合群體，難以反映被鑒定大豆材料對單一病毒株系的抗病性。田間病圃鑒定受自然環(huán)境影響較大，發(fā)病程度不穩(wěn)定，只能作為輔助鑒定。6.2人工接種鑒定法6.2.1．準備工作⑴整個接種試驗在防蟲溫室或網室中進行。⑵種植材料基質用沙或沙：壤土（1：1）。接種前，研缽、研棒用洗潔劑洗凈，放入微波爐中處理3分鐘，接種刷（即油畫筆）用洗潔劑洗凈后，在紫外燈下照射半小時，避免不同病毒、株系的交叉感染。選用600目金剛砂，配制0.1MpH7.5的磷酸緩沖液（配方：Na2HPO4?12H2O71.6g和KH2PO4?12H2O6.8g，加純凈水2400ml攪拌使其溶解，調pH到7.3-7.5，定容到2500ml）備用。⑶網室中毒源繁殖和保存期間，定期噴藥殺滅蚜蟲，以保證試驗毒源的純度。⑷接種體制備。見4.2。⑸病毒的繁殖在防蟲溫室或網室內，采用盆栽種植感病品種（南農1138-2），出苗后檢苗，淘汰種傳毒苗，每盆留苗8～10株。將低溫保存的SMV病葉在研缽中用少量0.1MpH7.5的磷酸緩沖液(1克新鮮病葉加3-5ml緩沖液)和600目金剛砂研碎，用接種刷蘸取汁液均勻摩擦接種于感病品種（南農1138-2）第一對充分展開的真葉上，接種后立即用清水沖洗葉片上多余的汁液。每接完一個病毒樣本后，換一次性手套。發(fā)病的葉片裝入無菌塑料袋放低溫冰箱保存，或者隔3個月接種繁殖一次。6.2.2種植將鑒定品種條播種植在防蟲網室中，每行種植25-50粒種子，行距為50cm，2次重復。防止葉片間摩擦傳毒，檢驗苗后每行留苗15～30株，單株之間留5～10cm的間隙。6.2.3接種將在感病對照品種（南農1138-2）上繁殖的病樣接種于第一對完全展開的真葉上。大約1周后，在第一片展開的復葉上進行第二次接種，以保證每一單株都被接上病毒。6.3病情調查6.3.1接種后30天內（接種后第20天觀察一次，第30天復查一次）連續(xù)觀察寄主的反應；逐株記載癥狀、病情級別。6.3.2按癥狀分別記載接種葉和上位葉的癥狀反應，系統(tǒng)花葉記為“M”；葉脈壞死、頂枯或枯斑均視為壞死，以“N”表示；無癥狀記為“0”。凡上位葉出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀者為感病，每個感病單株根據分級標準劃分為相應的級別。上位葉片無癥狀或只在接種葉上出現(xiàn)局部枯斑的為抗病。對無癥狀植株的參試品種進行再次播種，重復鑒定以進一步確認。6.3.3鑒定調查記載表要有鑒定人員和復核人員簽字。在開展鑒定調查時，鑒定人員與復核人員一同進行，鑒定人員對鑒定植株病情級別進行判斷，經復核人員確認后記載。6.4病情指數計算病情指數保留1位小數。6.5抗性分離記載若一個鑒定群體中出現(xiàn)明顯的抗、感類型，應在調查表中注明“抗性分離”，用/表示。6.6病情級別劃分標準個體按鑒定品種癥狀的嚴重度分級。一般將癥狀按花葉、壞死兩種類型分別考慮，各分為5級。病害調查時，如在同一植株上同時出現(xiàn)花葉和壞死兩種癥狀，病害級別取級別高者。單株病情嚴重度分級標準參照Zhi等（ZhiHaijian，2004中國農業(yè)科學）的方法：6.61花葉型（見圖1）病情級別劃分標準：病情級別癥狀0無癥狀或僅在接種葉上出現(xiàn)局部枯班1輕花葉2黃斑花葉、葉片輕度皺縮3重花葉、葉片皺縮卷曲4葉片嚴重皺縮且植株矮化6.62壞死型（見圖2）病情級別劃分標準：病情級別癥狀0無癥狀或僅在接種葉上出現(xiàn)局部枯班1部分葉片上出現(xiàn)可見微小壞死斑2多數壞死斑直徑在5mm以下或有小葉脈壞死3壞死斑連片或壞死葉脈長度在20mm以上4葉片因壞死脫落，或壞死面積超過葉片總面積50%，或出現(xiàn)頂枯，不能繼續(xù)生長7抗性評價7.1抗性類別劃分標準抗性級別病情指數抗性類別縮寫類別1＜10HR高抗310.1-30R抗530.1-50MR中抗750.1-70S感9＞70HS高感7.2有效性判別對照感病品種或任一鑒定品種的抗性級別達到7-9，該批次鑒定有效。7.3重復鑒定同一鑒定品種的抗性級別一年為5，另一年在5以下或5以上的，如果兩年抗性級別相差2個級別以上（包括2個級別）的，則需要做第三次抗性鑒定?；蛞荒暝?以上，另一年在5以下的，則需要做第三次抗性鑒定。7.4抗性評價7.4.1在有3年鑒定的結果中，如有2年的抗性類別是一致的，則此抗性類別作為最終鑒定結論。7.4.2達到高抗-抗或感-高感類別的鑒定品種，當兩年抗性類別不