脂肪酸合成酶（FAS）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

脂肪酸合成酶（FAS）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理脂肪酸合成酶（FAS）是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。CheKine?脂肪酸合成酶（FAS）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）可檢測(cè)生物體內(nèi)FAS活性，其原理是：FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長(zhǎng)鏈脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定340nm光吸收下降速率，計(jì)算FAS活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)（能測(cè)340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·制冰機(jī)、低溫離心機(jī)、水浴鍋·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；用前一天取出置于4℃充分解凍后混勻，平衡到室溫；-20℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：AssayBuffer有一定的刺激性，建議在使用過(guò)程中做好個(gè)人防護(hù)。WorkingNADPH：臨用前96T加入1.968mLAssayBuffer，48T加入0.984mLAssayBuffer，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復(fù)凍融。WorkingAcetylCoA：臨用前96T加入0.528mLAssayBuffer，48T加入0.264mLAssayBuffer，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復(fù)凍融。WorkingMalonylCoA：臨用前96T加入1.008mLAssayBuffer，48T加入0.504mLAssayBuffer，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復(fù)凍融。工作液的配制：每孔配制180μL工作液：吸取16μLWorkingNADPH，4μLWorkingAcetylCoA，8μLWorkingMalonylCoA和152μLAssayBuffer。工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，根據(jù)需要測(cè)定的樣本數(shù)按比例配制。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。1.動(dòng)物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，12,000g，4℃離心40min，取上清液，置冰上待測(cè)。2.植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer搗碎，冰浴超聲波破碎細(xì)胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），12,000g，4℃離心40min，取上清液，置冰上待測(cè)。3.細(xì)胞或細(xì)菌：收集500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），12,000g，4℃離心40min，取上清液，置冰上待測(cè)。4.血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定。注意：對(duì)于脂肪含量較高的動(dòng)物組織，離心后移除上層脂肪，再取上清液。如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟1.酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm。紫外分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。2.恒溫箱預(yù)熱到37℃，工作液置于恒溫箱中預(yù)熱15min以上。3.在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL樣本和180μL工作液，迅速混勻，測(cè)定340nm處吸光值。記錄第10s和70s時(shí)吸光值，分別記錄為A1和A2。ΔA測(cè)=A1-A2。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.0005可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.4，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋（計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)），或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。A.使用96孔UV板測(cè)定的計(jì)算公式1.按照蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmolNADPH為1個(gè)酶活單位。FAS酶活(U/mgprot)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T×n=3,216×ΔA測(cè)÷Cpr×n2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmolNADPH為1個(gè)酶活單位。FAS酶活(U/g鮮重)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T×n=3,216×ΔA測(cè)÷W×n3.按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算活性單位定義：每104個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘氧化1nmolNADPH為1個(gè)酶活單位。FAS酶活(U/104)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T×n=3,216×ΔA測(cè)÷500×n=6.432×ΔA測(cè)×n4.按液體體積計(jì)算活性單位定義：每mL樣本每分鐘氧化1nmolNADPH為1個(gè)酶活單位。FAS酶活(U/mL)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T×n=3,216×ΔA測(cè)×nε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，L，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.02mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；n：樣本稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量，g；V樣總：提取液體積，1mL；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。B.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中的光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計(jì)算即可。結(jié)果展示FAS(FAS(U/g)Figure1.小鼠腦、小鼠脾臟和玉米種子中的FAS活性。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB2210Che