NGS與感染性疾病年月培訓(xùn)課件

1NGS與感染性疾病年月1/22/20252003年完成了人類基因組計(jì)劃2NGS與感染性疾病年月1/22/2025該計(jì)劃的完成使得人們強(qiáng)烈的意識(shí)到人們需要更多更好的技術(shù)與數(shù)據(jù)分析能力來(lái)回答隨之而來(lái)的一系列生物學(xué)問(wèn)題。然而，通量的限制以及居高不下的測(cè)序成本成為了人們進(jìn)一步了解基因組的一道坎。3NGS與感染性疾病年月1/22/2025下一代測(cè)序（next-generationsequencing，NGS）2000年之后推出的高通量測(cè)序平臺(tái)很好地解決了這個(gè)問(wèn)題，人類基因組測(cè)序的成本直接因此下降50000倍產(chǎn)生了一個(gè)新的名詞：NGS4NGS與感染性疾病年月1/22/2025一、NGS是什么？（一）傳統(tǒng)的測(cè)序方式大規(guī)模平行簽名測(cè)序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克?。≒olonySequencing）、454焦磷酸測(cè)序（454pyrosequencing）、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、離子半導(dǎo)體測(cè)序（Ionsemiconductorsequencing）、DNA納米球測(cè)序（DNAnanoballsequencing）等5NGS與感染性疾病年月1/22/2025（二）NGS(nextgenerationsequencing)

包括二代的大規(guī)模平行測(cè)序和三代的單分子測(cè)序。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定被稱為下一代測(cè)序技術(shù)(nextgenerationsequencing)足見其劃時(shí)代的改變6NGS與感染性疾病年月1/22/2025同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序7NGS與感染性疾病年月1/22/2025（三）測(cè)序平臺(tái)1、Illumina公司的Solexa測(cè)序平臺(tái)2、Roche公司的454測(cè)序平臺(tái)3、ABI公司的寡核苷酸連接檢測(cè)平臺(tái)(SOLiD)8NGS與感染性疾病年月1/22/2025（四）NGS特點(diǎn)1、不同平臺(tái)測(cè)序方法不同，但原理有著共通之處，都是將基因組DNA隨機(jī)切割成小片段DNA，再通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)、PCR擴(kuò)增等技術(shù)流程獲得測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，相對(duì)于Sanger測(cè)序來(lái)說(shuō)通量高、速度快、費(fèi)用低9NGS與感染性疾病年月1/22/2025（四）NGS特點(diǎn)1、高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度2、可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋）以及功能基因組學(xué)（基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究10NGS與感染性疾病年月1/22/2025（四）NGS特點(diǎn)2、越來(lái)越多地應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)問(wèn)題。比如在基因組水平上對(duì)還沒有參考序列的物種進(jìn)行從頭測(cè)序，獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；對(duì)有參考序列的物種，進(jìn)行全基因組重測(cè)序，在全基因組水平上掃描并檢測(cè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。11NGS與感染性疾病年月1/22/202512NGS與感染性疾病年月1/22/202513NGS與感染性疾病年月1/22/2025中科院動(dòng)物研究所已經(jīng)測(cè)序、組裝和分析了38只野生金絲猴的基因組突變。這項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)表在國(guó)際分子生物學(xué)和進(jìn)化領(lǐng)域的權(quán)威期刊《MolecularBiologyandEvolution》14NGS與感染性疾病年月1/22/2025二、NGS可以為感染性疾病做什么？15NGS與感染性疾病年月1/22/2025（一）宏基因組學(xué)（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)。它通過(guò)直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。16NGS與感染性疾病年月1/22/202517NGS與感染性疾病年月1/22/2025對(duì)特定環(huán)境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進(jìn)行克隆，并通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)和篩選等手段獲得新的生理活性物質(zhì)，通過(guò)系統(tǒng)學(xué)分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學(xué)信息18NGS與感染性疾病年月1/22/2025宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是特定環(huán)境中的總DNA，不是某特定的微生物或其細(xì)胞中的總DNA，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和純化，這對(duì)我們認(rèn)識(shí)和利用95%以上的未培養(yǎng)微生物提供了一條新的途徑。19NGS與感染性疾病年月1/22/2025不僅能夠從整體上認(rèn)識(shí)微生物群落自身數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)，而且可以認(rèn)識(shí)微生物群落自身及其與宿主之間的進(jìn)化關(guān)系，研究不同狀態(tài)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，分析人類正常菌群和疾病狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和功能特征。20NGS與感染性疾病年月1/22/2025腸道微生物宏基因組學(xué)與人體代謝、免疫等各方面聯(lián)系緊密，已成為近年來(lái)熱門的研究主題，腸道菌群和糖尿病、肥胖癥等代謝性疾病的關(guān)系被不斷深入研究，對(duì)于藥物和腸道微生物群落的相互影響也在不斷探索21NGS與感染性疾病年月1/22/202522NGS與感染性疾病年月1/22/2025（二）精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)23NGS與感染性疾病年月1/22/20251、第二屆感染性疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)高峰論壇感染性（傳染性）疾病危害嚴(yán)重，精準(zhǔn)診斷是實(shí)現(xiàn)其精準(zhǔn)防控的前提。目前針對(duì)性使用抗生素是一個(gè)重大課題，另外即時(shí)快速病原診斷、未知病原鑒定、混合感染病原診斷、全病程病原監(jiān)測(cè)等問(wèn)題都值得重視和研究。24NGS與感染性疾病年月1/22/2025針對(duì)感染這一重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題，需要將基因檢測(cè)與傳統(tǒng)檢測(cè)相結(jié)合，加快將最新的生物科技轉(zhuǎn)化成先進(jìn)生產(chǎn)力，應(yīng)用于臨床感染精準(zhǔn)診療。基于下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）的宏基因組學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅猛，將有力推動(dòng)感染性疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。25NGS與感染性疾病年月1/22/2025NGS在感染性疾病中的應(yīng)用26NGS與感染性疾病年月1/22/2025NGS技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌感染檢測(cè)，明確是否存在細(xì)菌感染對(duì)菌株進(jìn)行分型，獲得分子血清型、耐藥基因譜等信息，分析其菌株進(jìn)化歷史、感染源及感染路徑，有助于疾病預(yù)防、診療和疫苗研發(fā)等。27NGS與感染性疾病年月1/22/2025結(jié)核桿菌耐藥菌株培養(yǎng)難度高，時(shí)間長(zhǎng)，臨床檢測(cè)受到極大限制。但基因測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)其菌株毒力和耐藥性上有著極大的優(yōu)勢(shì)，可以快速檢測(cè)病原體感染及其耐藥性有望取代現(xiàn)有的培養(yǎng)和分子診斷法28NGS與感染性疾病年月1/22/2025病毒NGS技術(shù)主要應(yīng)用于基因型分析、耐藥突變檢測(cè)及病毒在宿主體內(nèi)演化，以及暴發(fā)感染病毒的快速檢測(cè)時(shí)以協(xié)助預(yù)防、診斷治療及疫苗研究等方面。29NGS與感染性疾病年月1/22/2025真菌通過(guò)建立本地真菌基因組學(xué)數(shù)據(jù)并對(duì)比分析，不僅可以進(jìn)行真菌感染快速準(zhǔn)確診斷，還能夠發(fā)現(xiàn)不同真菌特有的功能性基因，研究其致病機(jī)制及藥物耐藥位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶位點(diǎn)，從而開發(fā)具有廣譜、不良反應(yīng)低、無(wú)交叉耐藥性的抗真菌藥物。30NGS與感染性疾病年月1/22/20252011年5月以德國(guó)為中心，歐洲暴發(fā)了一次嚴(yán)重的出血性腸道感染，科學(xué)家對(duì)病菌菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)致病元兇為致死性的大腸埃希菌O104：H4，通過(guò)對(duì)序列的分析推斷其感染人體的途徑和致病機(jī)制，溯源追蹤了其感染路徑，為疫病的診斷和治療提供了重要信息。31NGS與感染性疾病年月1/22/2025同年6月法國(guó)也發(fā)生了類似感染，NGS序列分析發(fā)現(xiàn)德國(guó)大腸埃希菌菌株基因多樣性遠(yuǎn)低于法國(guó)菌株，由此確認(rèn)其為法國(guó)暴發(fā)病原體的演化支，明確了感染源32NGS與感染性疾病年月1/22/2025北京協(xié)和醫(yī)院在《InternationalJournalofInfectiousDiseases》發(fā)表了國(guó)內(nèi)mNGS用于臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染患者布氏桿菌檢出的文章。2016年6月1日至2017年6月1日臨床懷疑CNS感染患者的腦脊液樣本。mNGS快速檢出4例患者布氏桿菌感染，結(jié)合臨床癥狀和RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證，患者確診為神經(jīng)型布氏桿菌病。mNGS檢出序列數(shù)從11-104不等，覆蓋度從0.0043%-0.4%不等。4例布氏桿菌感染的確診，展現(xiàn)了mNGS在臨床疑難感染病原檢測(cè)應(yīng)用的突出優(yōu)勢(shì)。33NGS與感染性疾病年月1/22/20258月齡患兒“發(fā)熱12天，間斷抽搐8天，睡眠增多6天”就診，持續(xù)間歇性高熱和抽搐。通過(guò)mNGS技術(shù)檢出單純皰疹病毒1型(HSV-1)序列數(shù)高達(dá)35078條，占比99.66%，覆蓋度為95%，在相對(duì)比例和病毒基因組覆蓋度方面都達(dá)到了明確診斷HSV-1感染的強(qiáng)度。34NGS與感染性疾病年月1/22/2025隨后甘露醇降顱壓后，阿昔洛韋抗病毒及其他對(duì)癥治療后患兒痊愈出院。本文表明除不容易發(fā)現(xiàn)的病原外，mNGS針對(duì)較為常見的皰疹病毒具有明確診斷意義，為臨床不明原因的CNS感染性疾病提供了重要的病原學(xué)診斷方法。35NGS與感染性疾病年月1/22/20252014年西非暴發(fā)了記錄中最大的一次埃博拉病毒感染，暴發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，感染和死亡人數(shù)高，在世界范圍內(nèi)引起了極大恐慌。36NGS與感染性疾病年月1/22/2025通過(guò)NGS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)分析，研究者明確了其基因多樣性和易突變性及流行病學(xué)特征，追蹤其感染起始源及感染路徑，預(yù)估了病毒感染人體和機(jī)體免疫反應(yīng)的過(guò)程，詳細(xì)闡述了其在宿主體內(nèi)通過(guò)逐漸適應(yīng)性突變發(fā)生的演化從而減小被免疫細(xì)胞識(shí)別的機(jī)會(huì)，對(duì)疫情的預(yù)防、控制，疾病的診斷、治療和疫苗的研發(fā)都起到了極大的促進(jìn)作用37NGS與感染性疾病年月1/22/2025三、三代測(cè)序美國(guó)太平洋生物的單分子實(shí)時(shí)技術(shù)及英國(guó)牛津納米孔公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)是不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)不同手段區(qū)分堿基信號(hào)差異，直接讀取序列信息，其讀長(zhǎng)長(zhǎng)、高通量，可以對(duì)RNA和甲基化DNA序列進(jìn)行直接測(cè)序38NGS與感染性疾病年月1/22/2025四、缺點(diǎn)目前還存在錯(cuò)誤率高、成本較高和生物信息分析軟件不夠豐富等缺點(diǎn)。高通量測(cè)序會(huì)產(chǎn)生大批量的數(shù)據(jù)，需要進(jìn)行龐大的數(shù)據(jù)分析，如果缺乏本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)算工作的成本和時(shí)間難以控制；39NGS與感染性疾病年月1/22/2025四、缺點(diǎn)對(duì)于疾病，測(cè)序得到的基因組數(shù)據(jù)與疾病之間的關(guān)系尚不明