分子診斷項目課件

分子診斷室項目介紹分子診斷項目內(nèi)容1.HBV-DNA熒光定量PCR2.流式基本應(yīng)用3.染色體核型分析分子診斷項目HBVDNA熒光定量PCR分子診斷項目 PCR技術(shù)簡介1985年美國PE-cetus公司的人類遺傳研究室mullis等人發(fā)明了具有劃時代意義的PCR技術(shù)，從而使人們夢寐以求的體外擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實。1988年P(guān)E-cetus公司推出了第一臺PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR技術(shù)的自動化成為現(xiàn)實。Mullis出因其卓越的貢獻(xiàn)與寡核苷酸基因定點誘變的發(fā)明者M(jìn)ichael分享了1993年諾貝爾化學(xué)獎。隨著PCR技術(shù)的日臻成熟1995年出現(xiàn)熒光基因探針雜交定量PCR方法4分子診斷項目PCR基本原理類似DNA的體內(nèi)復(fù)制，以單鏈DNA為模板，利用DNA聚合酶依賴于模板的特性，在附加的一對寡核苷酸引物之間催化合成互補(bǔ)鏈的過程。5分子診斷項目DNA合成的必備要素DNAPolymerasedNTPssingle-strandedtemplateprimer6分子診斷項目定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量7分子診斷項目常規(guī)PCR與定量PCR的比較8分子診斷項目實時熒光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定義：每個反應(yīng)管的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光閾值（threshold)的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：

threshold=10×SDcycle0-159分子診斷項目Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。10分子診斷項目熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3811分子診斷項目熒光檢測模式（1）SYBRGreenI染料（2）水解探針（Taqman）

（3）雜交探針（HybridizationProbes）（4）分子信標(biāo)（molecularbeacon)

發(fā)夾引物（sunriseprimer)

蝎狀引物（scorpionprimer)

復(fù)合探針（complexprobes)12分子診斷項目探針的5'端標(biāo)記一個熒光基團(tuán)，3'標(biāo)記另一個熒光基團(tuán)。5'端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3’端熒光淬滅基團(tuán)（FRET），正常情況下檢測不到該探針5'端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號。Taqman探針原理13分子診斷項目當(dāng)溶液中模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，Taq酶沿模板向前合成子鏈，當(dāng)延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；Taqman探針原理14分子診斷項目Taqman探針原理Taq酶的5‘—3’外切酶活性將探針5‘端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，發(fā)出熒光，熒光信號與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計算出初始模板的數(shù)量。15分子診斷項目定量PCR在乙肝檢測中意義1.判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性2.PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評價3.觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量4.獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷5.預(yù)測病情、判斷預(yù)后6.器官移植、母嬰垂直傳播16分子診斷項目17分子診斷項目標(biāo)本留取及檢測步驟標(biāo)本：靜脈血3ml，黃色蓋試管。標(biāo)本避免溶血和脂血。檢測步驟：1.反應(yīng)液配制

2.核酸提取

3.核酸擴(kuò)增結(jié)果分析：采用樣點擬合法，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到病毒的拷貝或IU/ML。18分子診斷項目1.分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為試劑準(zhǔn)備區(qū)，樣品處理區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)。2.試驗前實驗室應(yīng)使用紫外消毒至少30分鐘。3.操作時戴一次性手套，加樣頭要求及時更換，吸液時避免飛濺。注意事項19分子診斷項目4.每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，實驗時將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。5.所有試劑試驗前充分融化，避免反復(fù)凍融。6.每次PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽性對照。注意事項20分子診斷項目

流式基本應(yīng)用

分子診斷項目流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項特性，并加以定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征22分子診斷項目流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點細(xì)胞受體23分子診斷項目散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細(xì)胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性24分子診斷項目外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細(xì)胞溶解后）25分子診斷項目熒光信號使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量26分子診斷項目數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)顯示:

直方圖(Histogram)

二維點圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

密度圖(Density)

三維圖（3DPlot）27分子診斷項目流式的臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)28分子診斷項目淋巴細(xì)胞亞群分析使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的特異單克隆抗體，進(jìn)行多色染色，同時分析淋巴細(xì)胞膜上多種白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的表達(dá)，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，進(jìn)行定性分析各淋巴細(xì)胞亞群的百分含量淋巴細(xì)胞亞群的絕對計數(shù)，進(jìn)行定量分析29分子診斷項目根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。30分子診斷項目根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+），即Th/TiT抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）,即Ts/TcTh/Ts比值可用于評價自身免疫失調(diào)、被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)31分子診斷項目臨床意義診斷原發(fā)性免疫缺陷病（如先天性無r球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ鏏IDS）造血干細(xì)胞移植后免疫重建（6個月NK

；9個月T、B）Th/Ts

：機(jī)體免疫功能亢進(jìn)：自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等（治療有效恢復(fù)正常）Th/Ts

：機(jī)體免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活動性肝炎和活動性肝硬化、再障、結(jié)核、腫瘤等32分子診斷項目臨床意義移植后動態(tài)免疫監(jiān)測：急排臨床癥狀出現(xiàn)前1-5天，活化T和Th/Ts持續(xù)，>1.2預(yù)示急排；Th/Ts持續(xù)表明可能感染，比值<1.08，可能性大，<0.2應(yīng)停用免疫抑制劑；實體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察治療前常伴T

、Th/Ts

，放/化療有效可恢復(fù)；淋巴細(xì)胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴?fù)正常者預(yù)后常較好；探索疾病發(fā)病機(jī)理、進(jìn)程和預(yù)后（炎癥、腫瘤）33分子診斷項目淋巴細(xì)胞亞群雙色分析34分子診斷項目先天性無r球蛋白血癥35分子診斷項目淋巴細(xì)胞亞群雙色分析36分子診斷項目HLA-B27☆HLA-B27是MHCI類抗原，在有核細(xì)胞上廣泛表達(dá)

HLA-B27的表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎高度相關(guān)，超過90%的強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B27陽性。其他，如Reiters綜和癥陽性率70-90%，銀屑病性關(guān)節(jié)炎陽性率50-60%，葡萄膜炎陽性率40-50%☆檢測采用全血，無需分離淋巴細(xì)胞，操作簡單，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地分析HLA-B27?！罱Y(jié)果報告檢測的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)界值判定，得到陰性/陽性結(jié)果。實驗的靈敏度為100%，特異性為97.5%。37分子診斷項目流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（血液）

白血病和淋巴瘤免疫分型造血干細(xì)胞計數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）診斷網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表達(dá)血小板活化網(wǎng)織血小板分析38分子診斷項目流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（腫瘤）

細(xì)胞周期和倍體分析

腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究抗腫瘤藥物作用機(jī)制的研究放療/化療療效的研究

多藥耐藥基因的研究細(xì)胞凋亡的分析凋亡細(xì)胞的分析凋亡相關(guān)蛋白的分析39分子診斷項目流式標(biāo)本留取

紫色蓋試管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。不能有凝塊。單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)不少于106個。40分子診斷項目

染色體核型分析41分子診斷項目基本概念染色體核型：指一個物種所特有的染色體數(shù)目和每一條染色體的形態(tài)特征。------人類體細(xì)胞中共有23對染色體，22對常染色體，一對性染色體。核型分析：將待測細(xì)胞的核型進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)特征分析的過程稱核型分析。如正常女性核型：46,XX正常男性核型：46，XY。核型模式圖：是指將一個染色體組的全部染色體逐個按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。42分子診斷項目染色體模式圖43分子診斷項目人類23對染色體44分子診斷項目45分子診斷項目染色體編號(人X染色體)記述一特定帶時，需要寫明4個內(nèi)容：染色體號，長短臂，區(qū)的號序和帶的號序。這些內(nèi)容按順序?qū)懀挥瞄g隔或加標(biāo)點。如果某一帶被再細(xì)分，在原帶號數(shù)后加一小數(shù)點，編號原則仍按從著絲粒往臂端序貫編號。如1p31.2代表一號染色體短臂3區(qū)1帶第2亞帶46分子診斷項目染色體標(biāo)本常規(guī)制備

方法：中期染色體G帶顯色原理：采用秋水仙素處理培養(yǎng)的細(xì)胞，使細(xì)胞停留在分裂中期，再用低滲液處理細(xì)胞，使細(xì)胞脹大，以進(jìn)行染色體制片。G-帶是標(biāo)本片經(jīng)過預(yù)處理后，用Giemsa染色顯示的帶紋。47分子診斷項目操作步驟

細(xì)胞培養(yǎng)：

細(xì)胞培養(yǎng)液5mL（含植物凝血素），加0.3mL肝素抗凝全血37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)68～72小時。收獲細(xì)胞：

終止培養(yǎng)前1～1.5小時加入秋水仙素。

制片：低滲-預(yù)固定-固定-滴片-干燥老化

G-顯帶，圖像分析：胰酶消化，

Giemsa染色，采集圖像，分析20-30個中期分裂相48分子診斷項目核型描述首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號：A-G染色體組的名稱1-22染色體編號X,Y性染色體del缺失der結(jié)構(gòu)重排的染色體dup重復(fù)inv倒位t易位+/-在染色體符號前表示染色體增加或減少，在染色體符號后表示染色體多出或缺少一部分49分子診斷項目檢查適應(yīng)癥及意義生殖功能障礙

在不孕癥、多發(fā)性流產(chǎn)和畸胎等有生殖功能障礙的婦夫中至少有7%~10%是染色體異常的攜帶者。常見的有染色體結(jié)構(gòu)異常如平衡易位和倒位以及數(shù)量異常如由于女性少一條X染色體造成的45，XO，或多一條Y染色體造成的47，XXY。平衡易位和倒位由于無基因的丟失，攜帶者本身常并不發(fā)病，卻可因其生殖細(xì)胞染色體異常而導(dǎo)致不孕癥、流產(chǎn)和畸胎等生殖功能障礙。性染色體數(shù)目異常除可造成不孕外，還常出現(xiàn)第二性征異常。

50分子診斷項目檢查適應(yīng)癥及意