《小反芻獸疫病毒間接磁微粒 CLIA 抗體檢測(cè)方法》

ICSXX.XXX

XXX

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXX-20XX

小反芻獸疫病毒間接磁微粒

CLIA抗體檢測(cè)方法

Indirectmagneticparticlebasedchemiluminescenceimmunoassayfordetecting

antibodiesagainstpestedespetitsruminantsvirus

（征求意見(jiàn)稿）

在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

20XX-XX-XX發(fā)布20XX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

T/CVMAXX-20XX

小反芻獸疫病毒間接磁微粒CLIA抗體檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了小反芻獸疫病毒間接磁微粒CLIA抗體檢測(cè)方法的試劑、儀器設(shè)備、耗材、操作步驟、

結(jié)果判定。

本文件適用于定量檢測(cè)羊血清中小反芻獸疫病毒的特異性抗體。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

GB/T27982小反芻獸疫ELISA檢測(cè)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

CLIA:化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ChemiluminescenceImmunoassay）

ELISA：酶聯(lián)免疫吸附（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）

5試劑

5.125×濃縮洗液洗液，按照附錄A.1配置。

5.2磁微粒工作液（偶聯(lián)小反芻獸疫病毒N蛋白的磁微粒懸浮液）。

5.3稀釋液，按照附錄A.2配置。

5.4酶標(biāo)抗體（堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG）。

5.5小反芻獸疫病毒抗體工作校準(zhǔn)品

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包括：工作校準(zhǔn)品1、工作校準(zhǔn)品2、工作校準(zhǔn)品3、工作校準(zhǔn)品4、工作校準(zhǔn)品5、工作校準(zhǔn)品6，

抗體含量分別為0U、12.5U、50U、200U、800U、3200U，按照附錄B制備。

5.6小反芻獸疫病毒抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品

包括：產(chǎn)品校準(zhǔn)品1、產(chǎn)品校準(zhǔn)品2，抗體含量分別為50U、800U，按照附錄C.1制備。

5.7小反芻獸疫病毒抗體質(zhì)控品

范圍：質(zhì)控品1≤20U，質(zhì)控品2抗體含量范圍應(yīng)為160U～200U，按照附錄C.2制備。

5.8化學(xué)發(fā)光底物。

6儀器設(shè)備及耗材

本方法應(yīng)準(zhǔn)備儀器設(shè)備及耗材如下：

——全自動(dòng)化學(xué)發(fā)免疫分析儀：磁微粒和酶促化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備，LYC100、LYC200等；

——電子天平：最大稱量：Max=220g；最小稱量：Min=10mg；顯示分度值：d=0.1mg；

——離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速：16000rpm；

——可調(diào)單道移液器（100μL、1mL）；

——1.5mL尖底離心管；

——反應(yīng)杯；

——試劑船。

7技術(shù)原理

本方法使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，采用間接法原理，將小反芻獸疫病毒N蛋白作為抗原偶聯(lián)

于3μm羧基磁微粒上，并加入待檢血清進(jìn)行抗原抗體結(jié)合；再加入酶標(biāo)抗體進(jìn)行反應(yīng)；最后加入化學(xué)

發(fā)光底物，讀取發(fā)光值，待檢樣本抗體含量和發(fā)光值呈正相關(guān)。本方法通過(guò)檢測(cè)小反芻獸疫病毒N蛋白

抗體工作校準(zhǔn)品建立校準(zhǔn)曲線，并通過(guò)校準(zhǔn)曲線計(jì)算待檢樣本中小反芻獸疫病毒N蛋白的抗體含量，以

判定陰陽(yáng)性結(jié)果。

8檢測(cè)前準(zhǔn)備

8.1樣品采集及保存

樣品采集按照NY/T541進(jìn)行。無(wú)菌注射器靜脈采血，不少于2mL，用自然析出法分離血清后，置

于無(wú)菌血清管中，按照GB/19489樣品處理的生物安全措施、實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求處理樣本，若在

一周內(nèi)檢測(cè)，可置2℃~8℃條件下保存，若超過(guò)一周檢測(cè)，應(yīng)置于-20℃以下冷凍保存。

血清樣本運(yùn)輸時(shí)應(yīng)注意2-8℃冷藏。

8.2樣品處理

取8.1中的樣品，8000r/min，離心2min，取上清放于1.5mL尖底離心管中，體積應(yīng)大于300μL，待

檢；若樣品中存在沉淀或絮狀物等雜質(zhì)，應(yīng)離心去除雜質(zhì)，用移液槍吸出上清液，槍頭貼壁移至新1.5mL

尖底離心管中，輕微操作，避免出現(xiàn)泡沫。

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8.3溶液配制

洗滌液：將25×濃縮洗液用無(wú)離子水或蒸餾水1:25倍稀釋，裝入洗滌液桶。

無(wú)離子水或蒸餾水均應(yīng)符合GB/T6682的要求。

8.4儀器準(zhǔn)備

閱讀全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀說(shuō)明書(shū)，放置反應(yīng)杯，掃碼放置底物、系統(tǒng)維護(hù)液，開(kāi)始自檢。

8.5試劑準(zhǔn)備

將偶聯(lián)磁微粒工作液、酶標(biāo)抗體、稀釋液分別裝入試劑船上對(duì)應(yīng)試劑瓶中，將磁微粒用移液槍吹打

混勻，同時(shí)試劑船瓶蓋換為膠蓋；然后將試劑船裝入試劑倉(cāng)中。

9操作步驟

9.1校準(zhǔn)曲線擬合

將小反芻獸疫病毒抗體工作校準(zhǔn)品1～工作校準(zhǔn)品6分別放入樣本架，按照9.4進(jìn)行檢測(cè)標(biāo)定，按9.5

制作校準(zhǔn)曲線。工作校準(zhǔn)曲線示例見(jiàn)附錄D。

9.2校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)

將小反芻獸疫病毒抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品1、產(chǎn)品校準(zhǔn)品2放入樣本架，按儀器說(shuō)明書(shū)對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)。

以下情況應(yīng)校準(zhǔn)再進(jìn)行檢測(cè)：

a)試劑成分發(fā)生改變；

b)同一批次試劑盒使用周期超過(guò)28d；

c)質(zhì)控結(jié)果不符合要求。

9.3質(zhì)控

需要時(shí)檢測(cè)質(zhì)控血清，檢測(cè)值在參考范圍內(nèi)，方可繼續(xù)樣本檢測(cè)。

如下情況應(yīng)檢測(cè)質(zhì)控品：

a)試劑成分發(fā)生改變或校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)后；

b)質(zhì)控品超過(guò)24h需檢測(cè)1次。

9.4樣品檢測(cè)

取待檢樣本于1.5mL/2mL離心管中（樣本量需300μL以上），置于專用樣品架，設(shè)置測(cè)試樣品信息，

進(jìn)行檢測(cè)。

整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上進(jìn)行，具體檢測(cè)過(guò)程如下：

a)免疫反應(yīng)：取20μL待測(cè)樣本，25μL磁微粒工作液、55μL稀釋液，分別加入反應(yīng)杯中，37℃孵育10

min；

b)清洗：使用磁鐵吸附磁微粒30s，使其聚集于管壁，棄去上清液。加入1×洗滌液300L懸浮磁微粒，

混勻30s后吸附磁微粒，棄去1×洗滌液。重復(fù)清洗4次。

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c)酶反應(yīng)：取100μL酶標(biāo)抗體加入反應(yīng)杯中，37℃孵育10min；

d)清洗：使用磁鐵吸附磁微粒30s，使其聚集于管壁，棄去上清液。加入1×洗滌液300L懸浮磁微粒，

混勻30s后吸附磁微粒，棄去1×洗滌液。重復(fù)清洗4次。

e)檢測(cè)：加入化學(xué)發(fā)光底物溶液100L于清洗后的反應(yīng)杯中，混勻30s懸浮磁微粒，37℃反應(yīng)3min，

檢測(cè)發(fā)光值（RLU）。

f)計(jì)算：將發(fā)光值（RLU）代入校準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中小反芻獸疫病毒抗體含量。

9.5結(jié)果計(jì)算

檢測(cè)完成后，以工作校準(zhǔn)品抗體含量（0U、12.5U、50U、200U、800U、3200U）為橫坐標(biāo)、

相應(yīng)檢測(cè)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，擬合四參數(shù)為校準(zhǔn)曲線，四參數(shù)公式為Y=(a-d)/[1+(x/c)*b]+d，當(dāng)R2高于0.99

時(shí)，可以用于結(jié)果計(jì)算和判定。將待檢樣品檢測(cè)發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果即為待檢樣本中小反芻

獸疫病毒抗體含量。

10結(jié)果判定

10.1質(zhì)控血清參考范圍

質(zhì)控品1抗體含量≤20U，質(zhì)控品2抗體含量范圍應(yīng)為160U～200U，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。

10.2陰陽(yáng)性判定依據(jù)

抗體含量≥90U時(shí)，判為小反芻獸疫病毒抗體陽(yáng)性；抗體含量＜90U判為小反芻獸疫病毒抗體陰性。

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附錄A

(規(guī)范性)

試劑的配制

A.125×濃縮洗液配制，見(jiàn)表A1：

表A.125×濃縮洗液配方

名稱稱量

丁二酸1.98g

六水丁二酸鈉62.16g

氯化鈉225.00g

吐溫-2013.75g

加滅菌蒸餾水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存?zhèn)溆?。在使用時(shí)用無(wú)菌蒸餾水

稀釋25倍為1×洗液使用。

A.2稀釋液配制，見(jiàn)表A2：

表A.2稀釋液配方

名稱稱量

磷酸氫二鈉1.15g

氯化鈉8.00g

磷酸二氫鈉0.20g

吐溫-200.50mL

加滅菌蒸餾水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3校準(zhǔn)品稀釋液配制

表A.3校準(zhǔn)品稀釋液配方

名稱稱量

磷酸氫二鈉1.15g

氯化鈉8.00g

磷酸二氫鈉0.20g

牛血清白蛋白1.00g

海藻糖5.00g

吐溫-200.50mL

加滅菌蒸餾水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

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附錄B

(規(guī)范性)

小反芻獸疫病毒抗體工作校準(zhǔn)品制備

B.1小反芻獸疫病毒高免血清制備

使用小反芻獸疫弱毒活疫苗（傳代細(xì)胞苗）免疫60日齡SPF羊，按2頭份劑量，頸部肌肉注射接種。

可進(jìn)行3～4次免疫，在初次免疫后21天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，14天后檢測(cè)抗體水平，如達(dá)不到要求，再進(jìn)行第

三、第四次免疫。

抗體水平達(dá)到要求后，采集頸部靜脈血，用自然析出法，3000r/min離心10min，分離血清，然后用

0.22μm濾器過(guò)濾除菌，加入proclin300，使終濃度為0.05%（V/V），分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。操作滿足

生物安全實(shí)驗(yàn)要求《中華人民共和國(guó)生物安全法》《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》。

抗體水平合格標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)采集的血清樣品，使用小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法（GB/T27982）檢測(cè)

抗體水平，以檢測(cè)樣本為陽(yáng)性的最大稀釋滴度判斷小反芻獸疫病毒抗體水平。若抗體水平大于1∶4096，

則為合格的原始高免血清。制備好的小反芻獸疫高濃度抗體標(biāo)準(zhǔn)血清分裝于無(wú)菌血清管中，-20℃條件

下保存?zhèn)溆茫僮鳚M足生物安全實(shí)驗(yàn)要求（GB/19489）。

B.2小反芻獸疫病毒抗體工作校準(zhǔn)品制備

用工作校準(zhǔn)品稀釋液梯度稀釋B.1所制備的高免血清，小反芻獸疫ELISA檢測(cè)方法（GB/T27982）

檢測(cè)，并計(jì)算檢測(cè)結(jié)果，定義ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的最大稀釋滴度的稀釋血清抗體含量為100U，若此份

血清為1∶32稀釋，則1∶64稀釋血清為50U，依次類推。工作校準(zhǔn)品稀釋液定義為0U，最終選擇0

U、12.5U、50U、200U、800U、3200U分別為工作校準(zhǔn)品1、工作校準(zhǔn)品2、工作校準(zhǔn)品3、工作校

準(zhǔn)品4、工作校準(zhǔn)品5、工作校準(zhǔn)品6，稀釋的工作校準(zhǔn)品-20℃保存?zhèn)溆茫?6個(gè)月內(nèi)有效。

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附錄C

(規(guī)范性)

小反芻獸疫病毒抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品、質(zhì)控品

C.1小反芻獸疫病毒抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品制備

取B.1所制備的小反芻獸疫病毒高免血清，用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至抗體含量為50U、800U，分別

為小反芻獸疫病毒抗體產(chǎn)品校準(zhǔn)品1、產(chǎn)品校準(zhǔn)品2。

C.2小反芻獸疫病毒抗體質(zhì)控品制備

取B.1所制備的小反芻獸疫病毒高免血清，用工作校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至抗體含量為12.5U、200U，

分別為小反芻獸疫病毒抗體質(zhì)控品1、質(zhì)控品2，使用小反芻獸疫病毒抗體間接磁微粒CLIA檢測(cè)方法

檢測(cè)5次，計(jì)算平均值，質(zhì)控范圍為Mean±3SD。

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T/CVMAXX-20XX

附錄D

(資料性)