《動物微生物與免疫》課件-4. 細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷

4.細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)資源：下載中國大學(xué)慕課app，搜索動物微生物與免疫，參加學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)室診斷是在臨床診斷的基礎(chǔ)上進(jìn)行的注：疑似感染炭疽桿菌死亡的動物尸體嚴(yán)禁解剖或剝皮，應(yīng)立即報(bào)告上級防疫部門，嚴(yán)格診斷處理。細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法一、病料的采集二、病料的保存及運(yùn)送三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷能否成功分離到病原菌病料的采集和運(yùn)送是關(guān)鍵一、病料的采集什么是病料？從得病的動物(多為死后)身上采集的組織或器官，用來進(jìn)行疾病的研究工作。因此采集病料就要和得病的動物直接接觸一、病料的采集人畜共患?。盒鹿诜窝?、布氏桿菌病、禽流感、狂犬病、沙門氏菌病等很多病原微生物能在環(huán)境中長時間存在思考：為了自身健康和環(huán)境安全，我們在臨床上采集病料時應(yīng)該注意什么問題？東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生感染布氏桿菌病通過觀看視頻，28名師生感染布氏桿菌事件對我們有什么啟示？進(jìn)行人畜共患傳染病病尸的剖檢時：皮膚：戴手套，穿工作服（防護(hù)服）眼睛：有黏膜，因此要帶防護(hù)眼罩呼吸道、消化道：要帶口罩，口罩一定要罩住鼻子。防止自身感染：做好個人防護(hù)剖檢場所：剖檢前后都應(yīng)消毒剖檢后的器械、設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格消毒動物尸體處理：焚燒、高壓蒸汽滅菌或深埋防止病原散播：做好環(huán)境消毒一、病料的采集病料采集需要遵循哪些原則？無菌采樣適時采樣適當(dāng)部位適量采樣目的：防止病料被污染方法：—

所有器械和容器必須嚴(yán)格滅菌—

注意無菌操作病料采集的原則—無菌采樣細(xì)菌豐富增殖時期：取瀕死動物或剛死亡的動物。最好在使用抗生素前采集。病料應(yīng)該新鮮：死亡動物采集病料夏天不宜遲于6~8h,冬天不遲于24h，否則病料組織可能發(fā)生變性、腐敗。病料采集的原則—適時采樣目的：取含致病菌最多的組織或器官充分了解各種病原菌在患病動物體內(nèi)的分布情況，有目的地進(jìn)行采樣根據(jù)疾病的類型和表現(xiàn)采集病變最典型的部位病料采集的原則—適當(dāng)部位生前有神經(jīng)癥狀的疾病：腦、脊髓和腦脊液局部性疾?。翰∽儾课坏慕M織如壞死組織、膿腫病灶等敗血癥：血液、肝臟、腎等動物群體：一個動物的樣本量是不夠的，例如對患病雞群進(jìn)行樣品采集時會采集10只以上?；疾游铮簡蝹€樣本量要足夠，以便在復(fù)檢時還有足夠的樣本。病料采集的原則—適量采樣如何對病料進(jìn)行采集呢？一、病料的采集實(shí)質(zhì)臟器液體材料胃腸道及其內(nèi)容物病料采集的方法：實(shí)質(zhì)臟器一、病料的采集注：一個容器只裝一個動物的病料，不應(yīng)把數(shù)個動物的病料混合裝在一起。病料采集的方法：液體材料一、病料的采集體腔液可用注射器吸??；膿汁一般用滅菌的棉棒收集，放入滅菌試管內(nèi)，塞好棉塞送檢。血液：可無菌操作從靜脈或心臟采血，然后加抗凝劑（檸檬酸鈉）。血清：則采血后放在滅菌的容器中，擺成斜面，待血液凝固析出血清后，再將血清吸出，置于另一滅菌試管中送檢。病料采集的方法：胃腸道及其內(nèi)容物一、病料的采集腸道：只需選擇病變最明顯的部分，將其中內(nèi)容物去掉，用滅菌生理鹽水輕輕沖洗后放在平皿內(nèi)。糞便：應(yīng)采取新鮮的帶有膿、血、黏液的部分。剪一段兩端扎好的腸管，直接送檢。二、病料的保存及運(yùn)送冷藏箱液氮罐（-196℃）臨床標(biāo)本預(yù)處理增菌接種培養(yǎng)基，分離單個菌落各種鑒定試驗(yàn)涂片染色快速診斷試驗(yàn)生化試驗(yàn)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)動物試驗(yàn)初步診斷，決定是否進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)最終診斷報(bào)告分子生物學(xué)技術(shù)涂片染色三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷1）細(xì)菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷鏡檢看什么？細(xì)菌的有無、數(shù)量、形態(tài)、分布、結(jié)構(gòu)（有無莢膜、芽孢、鞭毛）等，進(jìn)行初步鑒定1）細(xì)菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷鏈球菌葡萄球菌1）細(xì)菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷巴氏桿菌（兩級染色）炭疽芽孢桿菌（如竹節(jié)狀）1）細(xì)菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌（莢膜染色法）破傷風(fēng)梭菌1）細(xì)菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷大腸桿菌沙門氏菌1）接種環(huán)是細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)必需的工具。2）超凈工作臺、無菌室三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷2）細(xì)菌的接種和分離培養(yǎng)接種工具三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷2）細(xì)菌的接種和分離培養(yǎng)增菌：方式：增菌培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基：選擇性、非選擇性）病料中病原菌少，或有抗生素殘留時，用固體培養(yǎng)基無法分離出菌落已污染的被檢材料：如飲水、糞便、已腐敗組織等，因含雜菌數(shù)遠(yuǎn)超過病原菌，需要增菌培養(yǎng)后再進(jìn)行分離。平板劃線分離：三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷2）細(xì)菌的分離培養(yǎng)涂布平板法、傾注平板法：三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷2）細(xì)菌的分離培養(yǎng)三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷2）細(xì)菌的分離培養(yǎng)通常選用適合目標(biāo)菌生長的平板培養(yǎng)基對細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。

也可采用選擇培養(yǎng)基或鑒別培養(yǎng)基，以起到抑制雜菌或快速鑒別的效果。比如腸道桿菌科可選擇麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂。—

不同細(xì)菌的菌落大小、形態(tài)、色澤、表面特征、邊緣狀態(tài)、隆起度、透明度等特征不同。有的細(xì)菌在鮮血瓊脂平板上形成溶血環(huán)。三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷2）細(xì)菌的分離培養(yǎng)大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤的菌落大腸埃希氏菌：邊緣整齊、稍凸起、表面光滑、濕潤的桃紅色菌落，周圍有渾濁膽鹽沉淀圈鼠傷寒沙門氏菌：無色或灰白色菌落，透明或半透明麥康凱瓊脂培養(yǎng)基三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定進(jìn)行生化試驗(yàn)的細(xì)菌必須是純培養(yǎng)物。通過檢測細(xì)菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)菌鑒定。例如，腸道菌種類繁多、形態(tài)、染色性和菌落等較為相似，但腸道菌生化反應(yīng)活潑，可根據(jù)其分解糖和蛋白質(zhì)的差異進(jìn)行區(qū)別。檢驗(yàn)時，根據(jù)可疑細(xì)菌的生化特性選擇特定的一組生化試驗(yàn)，將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，以確定病原菌的種類。細(xì)菌的生化試驗(yàn)：IMViC試驗(yàn)IMViC試驗(yàn)：吲哚實(shí)驗(yàn)（Indoltest）、甲基紅（MR）實(shí)驗(yàn)、乙二酰（VP）實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)（Citratetest)的合稱縮寫，常用來鑒定腸道桿菌。試驗(yàn)大腸桿菌吲哚+甲基紅+VP-檸檬酸鹽利用試驗(yàn)-吲哚實(shí)驗(yàn)甲基紅實(shí)驗(yàn)VP實(shí)驗(yàn)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)IMViC試驗(yàn)：吲哚實(shí)驗(yàn)吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果IMViC試驗(yàn)：甲基紅（MR）實(shí)驗(yàn)①試驗(yàn)菌用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24小時。②沿管壁加入甲基紅試劑3-4滴，紅的為陽性，黃的為陰性。甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸等IMViC試驗(yàn)：乙二酰（VP）實(shí)驗(yàn)VP實(shí)驗(yàn)結(jié)果+堿→二乙酰紅色化合物+蛋白胨中精氨酸所含胍基IMViC試驗(yàn)：檸檬（枸櫞）酸鹽利用試驗(yàn)VP實(shí)驗(yàn)結(jié)果某些細(xì)菌能利用培養(yǎng)基中的檸檬酸鈉為唯一碳源而獲得能量，能利用檸檬酸鹽的細(xì)菌，也能利用銨鹽作為唯一氮源，分解后生成碳酸鈉和氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)：用已知抗體檢測動物體內(nèi)的病原菌用已知的病原菌抗原檢測動物血清中的抗體血清學(xué)試驗(yàn)：檢測對象：細(xì)菌抗原或細(xì)菌的特異性抗體試驗(yàn)類型：凝集實(shí)驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)等布氏桿菌的檢疫已知未知陽性：塊狀凝集三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定觀察細(xì)菌的致病性：動物精神狀態(tài)、體溫、體重和血液變化等；病變和死亡情況測定細(xì)菌的毒力：半數(shù)致死量（LD50）細(xì)菌的純培養(yǎng)動物接種試驗(yàn)：將待檢菌液接種到動物體內(nèi)，觀察動物的發(fā)病情況，進(jìn)一步確認(rèn)可疑細(xì)菌的致病作用，從而進(jìn)一步鑒定細(xì)菌。三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定動物接種試驗(yàn)：常用的動物接種途徑：接種對象：本動物OR試驗(yàn)動物三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定分子生物學(xué)技術(shù)：基因水平鑒定細(xì)菌—PCR診斷技術(shù)—核酸雜交技術(shù)優(yōu)點(diǎn)（與傳統(tǒng)鑒定方法相比）：靈敏度高：理論上可以檢測出一個細(xì)菌簡便快速：2~4h獲得結(jié)果對檢測樣品的要求低：不需要活的病原體三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定分子生物學(xué)技術(shù)：分子生物學(xué)技術(shù)出現(xiàn)后，傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法是不是就沒有意義了？三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定分子生物學(xué)技術(shù)：缺點(diǎn)：無法區(qū)分或細(xì)胞和死細(xì)胞因靈敏度很高，環(huán)境中存在的抑制劑以及在樣品保存、濃縮和提純過程中所帶來的污染會抑制PCR反應(yīng)，或是造成假陽性后果，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。三、細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷3）細(xì)菌的鑒定分子生物學(xué)技術(shù)：分子生物學(xué)尚不能完全取代傳統(tǒng)微生物技術(shù)，還