細胞培養(yǎng)技術(shù)

春來花開艷，蜜蜂采蜜忙！1/18/20251請欣賞1/18/20252三、體外細胞生長的基本條件(一)細胞接種量(二）維持、促進細胞生長、繁殖的物質(zhì)

1.無機離子：Na+、K+、Ca2+、Cl-、PO43-、SO42-2.氨基酸：

3.碳水化合物：常用葡萄糖

4.維生素：維持細胞生長的生物活性物質(zhì)

5.蛋白質(zhì)：必不可少的成分，動物血清是蛋白質(zhì)的來源1/18/20253三、體外細胞生長的基本條件(三）酸堿度：最適pH為7.0~7.4，細胞能承受的范圍是6.6~7.8。細胞抗酸能力比抗堿能力好。

(四）氣體條件：O2和CO2(五)溫度：一般最適溫度為33℃~37℃，對高溫的抵抗力弱于對低溫的抵抗力。1/18/20254三、體外細胞生長的基本條件(六）水：雙蒸水，玻璃蒸餾器重蒸，最好現(xiàn)制現(xiàn)用。

(七）無菌條件在培養(yǎng)液中加入青、鏈霉素防止細菌污染；制霉菌素或兩性霉素防霉菌污染；卡那霉素防支原體污染。1/18/20255第二節(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)1/18/20256細胞培養(yǎng)操作人環(huán)境生長條件1/18/20257細胞培養(yǎng)技術(shù)要解決的問題：儀器設(shè)備如何培養(yǎng)細胞如何培養(yǎng)病毒如何檢查病毒1/18/20258一、細胞培養(yǎng)的基本設(shè)施與條件

（一）實驗室：

1.清潔區(qū)：所有無菌操作均應(yīng)在此區(qū)域完成。超凈工作臺離墻放置以利清潔。無菌器械應(yīng)置于該區(qū)域相鄰的位置，便于取用。操作臺等表面應(yīng)耐日常消毒和紫外線照射

2.工作區(qū)：應(yīng)有適當(dāng)?shù)耐L(fēng)和溫度控制。盡量減少走動以避免空氣混流及灰塵污染。表面應(yīng)耐水，并易于消毒。同時應(yīng)有防塵的抽屜、櫥柜，用于儲存實驗用品。

3.洗滌區(qū)：安排在實驗室的入口處。存放標本的冰箱，壓力蒸汽滅菌器及其它設(shè)備。并應(yīng)設(shè)有工作人員更換衣服鞋帽的位置。

1/18/20259一、細胞培養(yǎng)的基本設(shè)施與條件

細胞培養(yǎng)必需避免細菌和真菌污染，因此，細胞培養(yǎng)區(qū)域最好處于濾過空氣的正壓狀態(tài)，且該區(qū)域內(nèi)的設(shè)備及家具應(yīng)盡量少放置，以利清掃及減少積塵。細胞培養(yǎng)實驗室設(shè)計的原則是保證無微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影響。1/18/202510一、細胞培養(yǎng)的基本設(shè)施與條件與細胞培養(yǎng)相反，病毒工作區(qū)域最好處于負壓狀態(tài)，空氣經(jīng)過濾后排出室外。理想的病毒實驗室應(yīng)有多個房間并有單獨的通氣和排污系統(tǒng)。

1/18/202511

（二）設(shè)備

1.超凈工作臺或生物安全柜

2.顯微鏡：倒置顯微鏡

3.水浴箱

4.離心機

5.培養(yǎng)箱：CO2培養(yǎng)箱、普通培養(yǎng)箱

6.冰箱、冷柜與液氮罐

7.壓力蒸汽滅菌器和干烤箱1/18/202512二、實驗室常用洗滌、消毒和處理方法（一）無菌間的消毒處理：可采用紫外線照射、福爾馬林熏蒸等方法進行消毒處理。（二）實驗室桌面及地面的消毒處理：可采用一定濃度的新潔爾滅、過氧乙酸、含氯消毒劑進行消毒處理。1/18/202513

1、玻璃器材的選擇：

2、玻璃器材的處理

1）新玻璃器材的處理：

2）使用后之玻璃器材的處理：

3、玻璃器材的清潔：

4、玻璃器材的滅菌：

濕熱、干熱（三）玻璃器材的洗滌、消毒處理中性硬質(zhì)、耐酸、耐高溫、透明度好、壁光滑去塵、中和堿去除污染清潔液浸泡、沖洗、浸泡濕熱、干熱1/18/202514清潔液的配制配制與使用時應(yīng)注意何問題？1/18/2025151/18/202516

培養(yǎng)瓶1/18/202517培養(yǎng)板1/18/202518（四）濾器的清潔消毒

在細胞培養(yǎng)中，濾器是常常要用到的器材之一，主要用于不能或不宜采用高壓滅菌手段進行消毒的試劑或液體的除菌。實驗室常用的除菌濾器有玻璃濾器和蔡氏濾器兩種。1/18/2025191、玻璃濾器：新購置玻璃濾器的處理:

除塵濾器孔徑是否一致除菌效果合格后方可使用。消毒處理:用過濾的方法進行消毒處理。即自來水沖洗干凈，晾干后將玻璃濾器斗內(nèi)裝滿硫酸一重酪酸鉀清潔液，下接濾瓶，讓清潔液自然滴落，待斗內(nèi)清潔液全部滴落完畢時，再用蒸餾水抽洗到濾過的蒸餾水pH為中性時止。晾干后與過濾瓶分別包裝，15磅蒸汽15分鐘滅菌。1/18/202520

用于感染性或可疑感染性材料后的玻璃濾器，在使用后須經(jīng)1％次氯酸鈉浸漬過夜后，再按上述方法清潔、滅菌。2、蔡氏濾器：蔡氏濾器是用金屬器將石棉板夾在中間，作為除菌過濾之用。每次使用后，棄去用過的石棉板，洗凈金屬器，晾干。使用前，夾入新石棉板(光面向下)，將金屬筒扭緊，包裝后與過濾瓶分別經(jīng)15磅蒸汽15分鐘滅菌即可。1/18/202521濾器1/18/2025221/18/202523（五）橡皮塞和橡皮管的清潔消毒

要求質(zhì)軟、彈性力強、能耐高壓、對細胞無毒性。新橡皮管（塞）處理：2%氫氧化鈉溶液中煮沸15分鐘，自來水洗滌；再用4%鹽酸溶液煮沸15分鐘，自來水洗滌多次，再用蒸餾水沖洗5次以上。橡皮塞于使用前，用蒸餾水煮沸10分鐘滅菌，趁熱將煮盒內(nèi)蒸餾水倒凈，置已斷電源尚有余熱的電爐上烘烤2-3分鐘，使其干燥。橡皮管可根據(jù)試驗要求采用煮沸或蒸汽滅菌。1/18/202524

三、細胞培養(yǎng)的主要試劑在體內(nèi)，循環(huán)的體液能持續(xù)地提供細胞和組織營養(yǎng)物質(zhì)并排出代謝廢物。這些體液能夠提供細胞在體內(nèi)存活、分化和生長的所有成分。在體外生長的細胞也完全依賴于培養(yǎng)液而獲得營養(yǎng)需要。培養(yǎng)用液是與細胞直接接觸的液體，是細胞的外環(huán)境。因此，要求在配制過程中嚴格謹慎，以保證質(zhì)量，使細胞培養(yǎng)順利進行。1/18/202525三、細胞培養(yǎng)的主要試劑

（一）培養(yǎng)用液和試劑

1.平衡鹽溶液(BalancedsaltsolutionBSS)Hank’s液、Earle液、PBS主要成分：無機離子、葡萄糖、指示劑制備時的注意點見P21Hank’s液、D-Hank’s液作用？用途？1/18/202526三、細胞培養(yǎng)的主要試劑2.培養(yǎng)液：分為二類

生長液：用于促進培養(yǎng)物的生長，一般含有血清和其它促進細胞迅速繁殖的物質(zhì)。維持液：使培養(yǎng)物的代謝維持在穩(wěn)定的狀態(tài)，溶液中促進細胞代謝和繁殖的物質(zhì)較生長液少。

1/18/202527三、細胞培養(yǎng)的主要試劑生長液：天然生長液：合成生長液：常用的有Eagle：常用的是低限量Eagle培養(yǎng)液（minimumEaglemedium，MEM）及改良Eagle基本培養(yǎng)基（basalmediumEagle，BME）、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco‘smodifiedEaglemedium，DMEM）RPMI1640（RooseveltParkInstitutemedium1640）種類：水解乳蛋白、小牛血清優(yōu)點：含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及各種細胞生長因子、激素類物質(zhì)，滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)境相似。缺點：成分不明確的混合物、可能會引入污染、個體差異導(dǎo)致結(jié)果的不一致。是否需要選擇培養(yǎng)基1/18/202528三、細胞培養(yǎng)的主要試劑3.細胞分散劑：用于分離組織和細胞

1）胰蛋白酶液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。濃度0.25%或0.125%；溫度37℃或室溫；pH7.8，D-Hanks液配制。酶的活性可被血清滅活。

2）EDTA液：主要作用是與維持組織完整的Ca2+、Mg2+離子結(jié)合，使細胞分散。使用濃度0.02%。

3）胰酶-EDTA消化液：0.25%-0.02%1/18/202529三、細胞培養(yǎng)的主要試劑4.酸堿調(diào)節(jié)劑：

在大多數(shù)培養(yǎng)基中，Na+、K+、HCO3-和HPO42-是主要的pH調(diào)節(jié)成分。磷酸鹽緩沖液和碳酸／碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)與血液中的緩沖系統(tǒng)相似，常用于細胞培養(yǎng)中的pH調(diào)控。盡管在生理pH時，碳酸氫鹽的緩沖能力較低，但因費用低廉且無毒性，故仍然是最常用的。HEPES：在生理pH的整個范圍內(nèi)，具有更強的緩沖能力。在有血清的培養(yǎng)液內(nèi)，10～25mmol/LHEPES對大多數(shù)細胞無毒性。

7.5%NaHCO31/18/202530三、細胞培養(yǎng)的主要試劑

5.酸堿指示劑:用于指示溶液酸堿度的變化情況。以便用肉眼觀察pH的改變。

0.4%酚紅溶液

對細胞基本無毒

pH6.8時，酚紅呈現(xiàn)黃色，pH7.0時為桔紅色，pH7.4時為紅色，pH7.8以上時則為紫紅色。顏色十分容易觀察。對細胞的毒性變色范圍顏色的變化1/18/202531三、細胞培養(yǎng)的主要試劑6.抗生素

青霉素G的使用濃度為100～250U／ml，抑制大多數(shù)G+菌，但青霉素G不穩(wěn)定，35～37℃48h后,即被降解滅活。硫酸鏈霉素較青霉素穩(wěn)定，35～37℃可維持4d,抑制許多G-菌。常聯(lián)合應(yīng)用青霉素(100～250U／ml)和鏈霉素(100ug／ml)。

慶大霉素對多種G+和G-均有效，并且能抑制常污染細胞培養(yǎng)的多種支原體，常用濃度為5～10ug／ml，35～37℃能維持2周。1/18/202532三、細胞培養(yǎng)的主要試劑二性霉素B等抗真菌抗生素，可根據(jù)需要選用，濃度：l~4ug／ml，35~37℃時半衰期為4d，抑制真菌生長而非殺死真菌。長期使用可致低水平的、常常是隱性的真菌污染。當(dāng)細胞適應(yīng)了這種低水平污染所致的培養(yǎng)條件改變時，其表型常可出現(xiàn)改變。因此，二性霉素B不宜常規(guī)應(yīng)用于細胞傳代。如確需使用，則應(yīng)定時撤除。病毒分離時不涉及細胞傳代，可以常規(guī)使用二性霉素B。1/18/202533

四、各種細胞培養(yǎng)方法1/18/202534

胰蛋白酶EDTA

單個細胞

完好細胞膜損傷 死亡細胞核完好

良好的生長條件 貼瓶

繁殖 單層細胞培養(yǎng)過程新鮮的組織小塊1/18/202535細胞培養(yǎng)的基本程序組織的獲得與處理：無菌取組織，洗滌，剪碎，洗滌分散組織：方法（機械法、消化法），洗滌獲得單個細胞懸液：吹打分散（維持液?）細胞計數(shù)與分裝：活力檢查，一定濃度，分裝培養(yǎng)與觀察1/18/2025361/18/202537觀察的內(nèi)容：

是否被污染；細胞生長狀況；生長液的pH。觀察時的注意事項：

1）初培養(yǎng)：48h內(nèi)，不應(yīng)鏡檢或搖動，以免影響細胞貼壁。2）鏡檢或換液時，培養(yǎng)瓶不宜在室溫放置過久，要隨用隨取，速放回。3）培養(yǎng)瓶鏡檢完畢，注意細胞面朝下放平，使培養(yǎng)液浸漬整個細胞面。切勿倒置。

1/18/2025381/18/2025391/18/202540四、各種細胞培養(yǎng)方法

1、原代細胞培養(yǎng)

2、傳代細胞培養(yǎng)（二倍體細胞株、傳代細胞系）

3、同管兩種細胞培養(yǎng)

4、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法

5、微量細胞培養(yǎng)

P24-271/18/202541傳代細胞培養(yǎng)的過程圖示致密單層細胞在細胞瓶上呈霧狀，使瓶壁呈半透明：棄去培養(yǎng)液，在此可先搖動細胞瓶，使老化死亡貼壁情況不好的細胞隨培養(yǎng)液棄去。1/18/202542細胞完全皺縮變圓，此時應(yīng)棄去胰酶，加入培養(yǎng)基后輕搖可將細胞從細胞瓶壁上洗下，將細胞懸液用吸管吹散后傳代：有經(jīng)驗后，可肉眼對光觀察帖壁半透明的細胞層，判斷消化程度。

細胞基本皺縮變圓，此時細胞吹打可下。

細胞開始皺縮但不明顯，仍維持細胞正常形態(tài)剛加入胰酶，細胞仍呈致密單層

細胞明顯皺縮變小，細胞間隙增大不再致密，部分細胞維持正常形態(tài)，部分細胞皺縮變圓

如消化過頭，會見到許多細胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失。也可以在倒數(shù)第二、三步時棄去胰酶，用瓶中殘留的胰酶繼續(xù)作用至最后一步的消化程度，這樣略有點過也影響不大。

1/18/202543四、各種細胞培養(yǎng)方法6、微載體培養(yǎng)(Micro—carrierculture)傳統(tǒng)的貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)通過靜止或轉(zhuǎn)瓶等培養(yǎng)來獲得，操作繁復(fù)，且耗費空間及人力。1967年，VanWezel首次提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng)，使貼壁依賴型細胞貼附在微載體上懸浮于液體培養(yǎng)基中生長，兼具平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢，增加培養(yǎng)面積同時獲得均一的環(huán)境培養(yǎng)條件(溫度、pH值、CO2

濃度、葡萄糖濃度等)，便于控制放大獲得高密度培養(yǎng)細胞和優(yōu)化下游控制。1/18/202544四、各種細胞培養(yǎng)方法7、中空纖維培養(yǎng)(Hollowfibresculture)1972年，RichardKnazek首次報道此技術(shù)。該技術(shù)是模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細管”即中空纖維給培養(yǎng)的細胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)．中空纖維表面具有海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，既能使水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體透過，也能使細胞在上面貼附生長。該技術(shù)的特點是：細胞培養(yǎng)環(huán)境溫和，培養(yǎng)細胞密度較高，產(chǎn)品較容易分離純化。1/18/202545四、各種細胞培養(yǎng)方法8、微囊法培養(yǎng)(Micro—encapsulationculture)微囊化培養(yǎng)技術(shù)是20世紀70年代由Lin和Sun創(chuàng)建的一種大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其要點是：在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液中的水和營養(yǎng)物質(zhì)可透過半透膜進入微囊供應(yīng)給細胞，細胞的代謝物也可透過半透膜被排出，而細胞分泌的大分子物質(zhì)則被阻留而積累在囊內(nèi)。微囊化培養(yǎng)的優(yōu)點：a.細胞能生長和維持在小體積的培養(yǎng)液中，這使培養(yǎng)液中的分泌產(chǎn)物變濃，簡化了下游加工；b.培養(yǎng)液易于迅速改變，且無分離細胞與培養(yǎng)液的困難；c.微囊固定化細胞還能使細胞較少暴露于物理損傷環(huán)境中。用微膠囊培養(yǎng)可保護細胞在膠囊內(nèi)，可起到中空纖維的某些作用，也可避免反應(yīng)器的剪切力對細胞的損傷。1/18/202546細胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的一些問題

1、消化時間問題：“透”！

2、細胞的保存問題：取到早代細胞種子時一定要及時地保存起來以防丟失或污染。

3、溫度的問題：溫度增加2-3℃對細胞產(chǎn)生不良影響，使之在24小時之內(nèi)死亡。低溫對細胞影響較小。細胞一般37℃放7天大部分脫落。室溫放10天不但脫落，形態(tài)都有一些代謝改變。在4℃放20天細胞能保持良好形態(tài)，如需使用時在37℃放置2—3小時即可。

4、血清問題：種類、質(zhì)量、濃度細胞相互已分離，間隙加大，胞體趨于變圓。1/18/202547五、細胞培養(yǎng)物的保存、復(fù)蘇及運輸1．保存①盛玻璃球的試管培養(yǎng)法：②降溫維持法：

③凍結(jié)保存法：冷凍保護劑：甘油、二甲基亞砜（DMSO）低溫要求：-70℃或液氮（-150℃至-196℃）

原則：慢凍？1/18/202548慢凍程序標準程序：

當(dāng)溫度在-25℃以上時，1～2℃/min；當(dāng)溫度達-25℃以下時，5～10℃/min；當(dāng)溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。簡易程序：

將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。1/18/202549五、細胞培養(yǎng)物的保存、運輸及復(fù)蘇2．凍存細胞的復(fù)蘇：原則快融3．運輸：

懸液狀態(tài)（每ml生長液含100萬個細胞），單層培養(yǎng)運輸時，生長液裝滿培養(yǎng)瓶，冰盒運輸。##1/18/202550細胞復(fù)蘇的方法

（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)后進行培養(yǎng)。***1/18/202551細胞懸液可用下述方法使之穩(wěn)定，以備運輸。①用生長液稀釋胰酶消化細胞，每毫升不要超過60萬個細胞，然后在0～4℃放24小時。②取出后，細胞懸液以200rpm沉淀30分鐘，棄去含細胞毒素的上清液，再加入生長液，使最終濃度為