固相膜免疫分析技術(shù)

第十一章固相膜免疫分析技術(shù)徐廣賢目錄第一節(jié)概述第二節(jié)免疫層析試驗第三節(jié)免疫滲濾試驗第四節(jié)

斑點酶免疫吸附試驗第五節(jié)

免疫印跡試驗第六節(jié)影響固相膜免疫試驗的主要因素第七節(jié)固相膜免疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用第一節(jié)概述重點提示固相膜免疫分析技術(shù)常用的固相膜和標(biāo)志物固相膜的技術(shù)要求固相膜免疫分析技術(shù)是以微孔膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測樣本后，經(jīng)微孔膜滲濾作用或毛細管虹吸作用使樣本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標(biāo)記物或酶標(biāo)記物與之反應(yīng)形成肉眼可見的顯色結(jié)果。常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍（nylon）膜硝酸纖維素（nitrocell-ulose，NC)膜NC膜或尼龍膜是常用的固相膜常用的標(biāo)志物酶和有色微粒子彩色膠乳熒光素膠體金和膠體硒等其中以膠體金和熒光素最為常用

固相膜的技術(shù)要求孔徑：穿流法的膜一般選擇0.4μm左右；橫流法的膜可選擇5μm?10μm。流速：孔徑和分布結(jié)構(gòu)影響膜的流動速率，孔徑大，流速快。蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強，以μg/cm2表示。均一性：優(yōu)質(zhì)的膜具有良好的均一性。第二節(jié)免疫層析試驗重點提示原理常用的免疫層析試驗?zāi)z體金免疫層析試驗的測定模式熒光免疫層析試驗技術(shù)要點原理免疫層析試驗是以硝酸纖維素膜為固相載體，樣品溶液借助毛細作用在層析條上泳動，同時樣品中的待測物與層析材料上待測物的受體（抗原或抗體）發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測帶），通過檢測標(biāo)記物膠體金顆粒或熒光素等，在短時間內(nèi)（20min)聚集而得到直觀的試驗結(jié)果（顯色）。常用的免疫層析試驗根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫層析試驗可以分為：膠體金免疫層析試驗：標(biāo)記物為膠體金，多用于檢測抗原，但亦可用于檢測抗體。熒光免疫層析試驗：標(biāo)記物為熒光素，標(biāo)記相應(yīng)的抗體或抗原，然后利用熒光檢測儀檢測試劑條上富集的反應(yīng)結(jié)合物激發(fā)產(chǎn)生的熒光強度，從而對標(biāo)記物濃度進行檢測的一種方法。膠體金免疫層析試驗的測定模式雙抗體夾心法檢測大分子抗原競爭法檢測小分子抗原間接法雙抗體夾心法檢測大分子抗原G處為金標(biāo)特異性抗體，T處為包被特異性抗體，C處為包被抗免疫球蛋白抗體，B處為吸水紙。測試時A端滴加待測標(biāo)本，通過層析作用，待測標(biāo)本向B端移動，流經(jīng)G處時將金標(biāo)抗體復(fù)溶，若待測標(biāo)本中含待測抗原，即形成金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物，移至T區(qū)時，形成金標(biāo)抗體-抗原-抗體復(fù)合物，金標(biāo)抗體被固定下來，在T區(qū)顯示紅色線條，呈陽性反應(yīng)，多余的金標(biāo)記抗體移至C區(qū)被抗金標(biāo)抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色質(zhì)控線條。圖11-1免疫層析試驗雙抗體夾心法原理示意圖競爭法檢測小分子抗原圖11-2免疫層析試驗競爭法原理示意圖G處為金標(biāo)抗體，T處包被標(biāo)準(zhǔn)抗原，C處包被抗金標(biāo)抗體，測試時待測標(biāo)本加于A端，若待測標(biāo)本中含有待測抗原，流經(jīng)G處時結(jié)合金標(biāo)抗體，當(dāng)混合物移至T處時，因無足夠游離的金標(biāo)抗體與膜上標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)合，T處無紅色線條出現(xiàn)，實驗結(jié)果為陽性，游離金標(biāo)抗體或金標(biāo)抗體復(fù)合物流經(jīng)C處，與該處的抗金標(biāo)抗體結(jié)合出現(xiàn)紅色的質(zhì)控帶，若標(biāo)本中不含待測抗原，金標(biāo)抗體則與T處膜上的標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)合，在T處出現(xiàn)紅色的線條，實驗結(jié)果為陰性。間接法利用間接法檢測抗體時，待測血清標(biāo)本中大量的非特異性IgG可以與特異性IgG競爭性結(jié)合膠體金標(biāo)記的抗人IgG，從而影響試驗的敏感性，為了消除其影響，常采用反流免疫層析法排除非特異性抗體對測試的干擾。熒光免疫層析試驗熒光免疫層析試驗是在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用熒光素標(biāo)記相應(yīng)的抗體或抗原，然后利用熒光檢測儀檢測試劑條上富集的反應(yīng)結(jié)合物激發(fā)產(chǎn)生的熒光強度，從而對標(biāo)記物濃度進行檢測的一種方法。熒光免疫層析實驗與膠體金免疫層析實驗的基本步驟是一樣的，但所用的標(biāo)記物不一樣，前者采用的是熒光素，后者采用的是膠體金。常用的方法有夾心法、競爭法等。技術(shù)要點膠體金層析試驗：加樣、結(jié)果判定。熒光層析試驗：不同的熒光標(biāo)記物具有不同的檢測波長，需根據(jù)試劑盒的熒光標(biāo)記物的特性，選擇合適的檢測波長，或使用試劑盒提供的專用熒光檢測儀器。第三節(jié)免疫滲濾試驗重點提示原理測定模式技術(shù)要點原理DIGFA是將抗原或抗體點加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制成抗原或抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上，依次在膜上滴加樣品、免疫膠體金及洗滌液等試劑并與硝酸纖維素膜上的相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，起到親和層析的濃縮作用，達到快速檢測的目的。抗原抗體反應(yīng)后，形成大分子膠體金復(fù)合物，從而使陽性結(jié)果在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。測定模式1.雙抗體夾心法測抗原：AB包被抗體的試紙滴加金標(biāo)抗體滴加待檢樣品于試紙上測定模式2.間接法測特異性抗體：試劑盒組成主要由滲濾裝置、膠體金標(biāo)記物、洗滌液、抗原參照品或抗體陽性對照品四部分組成。其中滲濾裝置是由塑料小盒、吸水墊料和已點加抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。試劑盒一般都設(shè)有質(zhì)控點，質(zhì)控點的大小或形狀都不同于檢測點，有的用大小點區(qū)分、有的用點橫線區(qū)分，有的用橫豎線區(qū)分。圖11-3DIGFA結(jié)構(gòu)示意圖技術(shù)要點加樣：將滲濾裝置平放于實驗臺面上，于小孔內(nèi)依次滴加含待測樣品及相應(yīng)的試劑。結(jié)果判定：在膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點者判為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。斑點呈色的深淺相應(yīng)地表示陽性反應(yīng)的強弱。第四節(jié)斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗重點提示原理技術(shù)要點方法學(xué)評價原理Dot-ELISA的實驗原理與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于Dot-ELISA所用載體為NC膜。其原理為樣品中的抗體或抗原與預(yù)先包被在NC膜上的抗原或抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，然后再加入相應(yīng)的酶標(biāo)二抗進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過酶催化底物，形成有色的沉淀物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，根據(jù)染色條帶或斑點的有無或深淺，對抗體或抗原進行檢測。陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色條帶或斑點。圖11-4Dot-ELISA示意圖技術(shù)要點抗原包被：優(yōu)化抗原的濃度?？乖贵w反應(yīng)：滴加樣品血清，待檢抗體與NC膜上抗原結(jié)合。確定酶結(jié)合物最佳稀釋度：一般以陰性樣品不顯色而陽性樣品顯色最強的酶結(jié)合物稀釋度為最佳稀釋度。顯色反應(yīng)：在鹽酸聯(lián)苯胺和過氧化氫為底物時，溶液pH值應(yīng)在5.8～6.0，此時反應(yīng)最靈敏。方法學(xué)評價優(yōu)點：1.吸附蛋白能力強2.可同時檢測多種抗體3.其它：實驗和結(jié)果判斷不需特殊設(shè)備條件，結(jié)果可長期保存第五節(jié)免疫印跡試驗重點提示原理技術(shù)要點方法學(xué)評價原理技術(shù)要點抗原印跡與包被抗原抗體反應(yīng)檢測抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上放射自顯影法底物化學(xué)發(fā)光法底物熒光法和底物顯色法方法學(xué)評價特異性強，用于病原體確認13同時檢測多種抗體4膜條可重復(fù)檢測應(yīng)用吸附蛋白能力強

22第六節(jié)影響固相膜免疫試驗的主要因素重點提示試劑方面標(biāo)本方面實驗過程影響因素：試劑試劑的選擇：注意試劑的注冊號、批號、有效期和檢驗合格證等；不同批號的試劑不能混用；不能使用過期的試劑。試劑的準(zhǔn)備：試劑在開封前應(yīng)檢查是否漏液、漏氣；使用前要在室溫（18℃～25℃）下平衡20min～30min。影響因素：標(biāo)本標(biāo)本處理：臨床檢測的標(biāo)本有痰液、尿液、糞便、棉拭子、血清和血漿等。檢測前，需進行相應(yīng)的前處理，如痰液或糞便，需用緩沖液或生理鹽水稀釋后，低速離心，取上清進行檢測。標(biāo)本保存：對于采集的標(biāo)本如不能立即檢測，需要保存在2℃～8℃，不超過24小時，超過24小時以上，需保存在-20℃以下，忌反復(fù)凍融。影響因素：實驗過程溫度及時間結(jié)果判定檢測前要平衡至室溫（18～25℃）后再開袋使用。無特殊說明，檢測的溫度為18～25℃，時間在3Omin以內(nèi)。一些膠體金診斷試劑條只用于初步診斷，確診需采用免疫印跡實驗進行。試劑條平衡第七節(jié)

固相膜免疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用贈送精美圖標(biāo)1、字體安裝與設(shè)置如果您對PPT模板中的字體風(fēng)格不滿意，可進行批量替換，一次性更改各頁面字體。在“開始”選項卡中，點擊“替換”按鈕右側(cè)箭頭，選擇“替換字體”。（如下圖）在圖“替換”下拉列表中選擇要更改字體。（如下圖）在“替換為”下拉列表中選擇替換字體。點擊“替換”按鈕，完成。432、替換模板中的圖片模板中的圖片展示頁面，您可以根據(jù)需要替換這些圖片，下面介紹兩種替換方法。方法一：更改圖片選中模版中的圖片（有些圖片與其他對象進行了組合，選擇時一定要選中圖片本身，而不是組合）。單擊鼠標(biāo)右鍵，選擇“更改圖片”，選擇要替換的圖片。