《卵磷脂的分離純化實驗報告》6300字

卵磷脂的分離純化實驗報告目錄TOC\o"1-2"\h\u23135卵磷脂的分離純化實驗報告 1260861.1引言 1203491.2實驗儀器與試劑 250311.2.1實驗材料及試劑 251281.2.2實驗儀器 2320561.3實驗方法 3204511.3.1卵磷脂標準曲線的繪制及檢測方法 314411.3.2乙醇體系萃取卵磷脂 345731.3.3乙醇體系冷凍提取卵磷脂 41821.4實驗結果 4260341.4.2乙醇體系萃取過程中不同因素對卵磷脂含量的影響 575721.4.3乙醇體系冷凍過程中不同因素對卵磷脂含量的影響 938641.4.4卵磷脂含量分析 12引言磷脂廣泛分布于動植物體內，根據(jù)Sn-3位磷酸衍生物的不同分為磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酸（PA）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）。本文主要研究DLPC這一類特異性磷脂酰膽堿的純化。目前文獻中提及到的PC純化方法多以蛋黃和大豆為原料。盡管蛋黃磷脂中PC含量高于大豆磷脂，但它的Sn-2位主要是飽和脂肪酸。蛋黃PC中DLPC含量并不高，而DLPC是大豆PC的主要組成成分。所以純化富含DLPC的PC一般選擇價格低廉，磷脂含量高的大豆粉末磷脂作為原料。近幾年，大豆PC在食品、醫(yī)藥行業(yè)應用越來越廣泛。針對不同的功能需求相繼出現(xiàn)不同改性方法的研究。目前研究較多的有柱層析法、超（亞）臨界萃取法、膜分離法、有機溶劑萃取法。其中柱層析法能得到純度在90%以上的PC，純化效果最突出，但上樣量低，生產效率不高。超（亞）臨界萃取法和膜分離法工藝簡單、且不引入有毒試劑，但設備及耗材成本高。有機溶劑萃取法操作簡易，產量大，成本低，但純化程度不夠高，一般可作為純化步驟的預處理方法。同時，還存在一些不太熱門的PC純化方法，酶水解法主要用于提取蛋黃卵磷脂，通過水解雞蛋中的蛋白質的方式提高磷脂含量，無法分離大類磷脂，純化效果有限；無機鹽沉淀法會引入的有毒沉淀劑，難以脫除徹底。而用乙醇冷凍法研究較少，但因其操作方法簡單，處理量大，無需借助高成本維護的儀器，可將經預分離的磷脂酰膽堿進一步純化。因此，乙醇冷凍法可與有機溶劑萃取法結合探索出一種生產高純度PC的方式。本章內容以大豆粉末磷脂為原料，采用乙醇萃取聯(lián)合乙醇冷凍法制備高純度PC，研究乙醇萃取過程中乙醇濃度、料液比、萃取時間、萃取溫度、萃取次數(shù)對乙醇萃取效果的影響，和乙醇冷凍過程中乙醇濃度、固液比、冷凍時間對冷凍純化效果的影響。實驗儀器與試劑實驗材料及試劑表2-1主要材料及試劑名稱純度生產廠家乙腈色譜純天津市科密歐化學試劑公司甲醇色譜純上海國藥試劑公司85%磷酸色譜純阿拉丁試劑有限公司乙醇分析純上海國藥試劑公司丙酮分析純上海國藥試劑公司乙醚分析純上海國藥試劑公司大豆粉末磷脂≥97%安徽素之味生物科技有限公司大豆L-α-磷脂酰膽堿標準品≥98%北京百靈威科技有限公司實驗儀器表2-2主要儀器名稱型號廠家鼓風干燥箱DHG-9140A鞏義市予華儀器公司集熱式恒溫磁力攪拌器DF-101S常州國華電器公司液相色譜儀LC-10F天津博納艾杰爾公司超聲波清洗機SK3300上?？茖С晝x器有限公司IKA懸臂攪拌器EUROSTAR40digital德國艾卡儀器設備有限公司分析天平FA2104N奧豪斯（上海）公司旋轉蒸發(fā)儀YRE2000E鞏義市予華儀器公司自動雙重純水蒸餾器SZ-93上海亞榮生化儀器廠快速高低溫程序控制恒溫槽CK-4010GD寧波新芝生物科技股份有限公司真空干燥箱DZF上海精宏實驗設備有限公司InnovaSilica柱5μm4.6×250mm天津博納爾艾杰爾有限公司實驗方法圖2-1PC制備工藝流程本章實驗具體工藝流程如圖2-1所示。卵磷脂標準曲線的繪制及檢測方法（1）PC標準曲線繪制分別配制濃度梯度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mg/mL的PC標準溶液，過0.22μm尼龍濾膜，待液相分析檢測。以PC濃度為橫坐標，對應目標峰面積為縱坐標繪制標準曲線。（2）進樣溶液配制稱取30-50mg待測磷脂于5mL塑料離心管，加少量乙醇超聲溶解，后轉入25mL容量瓶中，塑料離心管用乙醇潤洗3次，潤洗液轉入25mL容量瓶，最后用乙醇定容待檢測。（3）液相檢測方法HPLC色譜方法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>張維農</Author><Year>2004</Year><RecNum>266</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[69]</style></DisplayText><record><rec-number>266</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">266</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>張維農</author></authors></contributors><titles><title>天然磷脂的置換色譜分離純化及其脂質體色譜研究</title></titles><dates><year>2004</year></dates><publisher>武漢大學</publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[69]：檢測器為UV檢測器，檢測波長：203nm；流動相：乙睛:甲醇:85%磷酸=180:3:1（V/V/V）；流量：0.5mL/min；色譜柱：InnovaSilica5μm4.6×250mm；柱溫：24°C；進樣量：20μL。乙醇體系萃取卵磷脂取20g大豆粉末磷脂于150mL或100mL燒杯中，根據(jù)固液比加入不同體積不同濃度的乙醇溶液。在不同溫度下250r/min水浴攪拌，萃取不同次數(shù)，取上清液轉入100mL圓底燒瓶中，50°C真空脫溶，脫溶物用10mL丙酮洗滌3次后真空脫溶去除丙酮，得到粗提PC。此時產品PC含量不足90%，粗提PC需經過乙醇冷凍法進一步提純。得率計算公式如下：式2.1粗提PC得率=粗提PC質量大豆粉末乙醇體系冷凍提取卵磷脂優(yōu)化乙醇冷凍實驗條件需要大量的粗提PC，以下為獲取冷凍法原料的操作方法：取500g粉末磷脂于2L燒杯中，選擇2.3.2優(yōu)化得到的乙醇萃取條件萃取大豆粉末磷脂。經旋蒸后的粗提PC質地粘稠，附著于圓底燒瓶瓶壁，不易取出。將150mL乙醚分三次加入圓底燒瓶超聲溶解并反復沖洗，乙醚磷脂溶液轉移至1L燒杯，45°C水浴30min，揮干部分乙醚。加入750mL丙酮使磷脂沉淀。倒掉上清液，將沉淀平鋪于表面皿，50°C真空干燥24h，得到粗提PC。取10g粗提PC于100mL旋蓋試劑瓶中，根據(jù)固液比加入不同體積不同濃度的乙醇溶液，60°C水浴溶解，置于高低溫程序控制恒溫槽中，1h內從60°C降溫至-7°C，保溫不同時間。取上清液，50°C旋蒸去除溶劑，得到制備PC。得率計算公式如下：式2.2制備PC得率=制備PC質量粗提PC質量×10實驗結果卵磷脂標準曲線圖2-2PC的標準曲線以PC的濃度為橫坐標，目標峰面積為縱坐標，繪制的標準曲線如圖2-2所示，PC標準曲線方程為y=16395145.6254x+571837.0205，R2=0.9997。乙醇體系萃取過程中不同因素對卵磷脂含量的影響為了得到乙醇體系萃取PC的最優(yōu)條件，通過單因素實驗對各個影響因子進行探討。本實驗考察乙醇濃度（%）、固液比（g/mL）、萃取時間（min）、萃取溫度（°C）和萃取次數(shù)這些因素對PC含量的影響，以粗提物PC含量（%）和得率（%）作為考察指標。乙醇濃度對乙醇萃取效果的影響圖2-3乙醇濃度對乙醇萃取PC含量和得率的影響固定實驗條件：固液比1:4（g/mL），萃取時間30min，萃取溫度60°C，萃取次數(shù)1次。探索80%、85%、90%、95%、100%濃度乙醇對乙醇萃取PC含量和得率的影響。磷脂在乙醇和水中溶解度不同，不同乙醇-水比例的溶液萃取PC的效果也會有差異。PC在乙醇中溶解度遠高于其他磷脂，水分添加過量會降低PC的溶解性，同時溶解更多如PA、PE這一類比PC水溶性更強的磷脂，使PC含量降低。故本章只對80%以上乙醇濃度的萃取結果進行探討。具體結果如圖2-3所示。由圖2-3可看出，乙醇濃度在80-95%時，PC含量和得率隨著乙醇濃度增加而逐漸上升。因為此時PC在溶液中的溶解度高于其他磷脂，同時水分的添加促使磷脂與其結合形成膠體，磷脂在攪拌萃取過程中結團成塊，不利于磷脂與溶劑體系接觸，造成了水分添加而PC含量降低的現(xiàn)象。當乙醇濃度大于95%時，PC含量和得率反而隨著乙醇濃度的增加而降低。可能是因為少量水分的添加降低了乙醇-水溶液的黏度，使體系的傳質效率增加ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王成濤</Author><Year>2010</Year><RecNum>265</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[70]</style></DisplayText><record><rec-number>265</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">265</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>王成濤</author></authors></contributors><titles><title>大豆磷脂制備高純度磷脂酰膽堿的研究</title></titles><dates><year>2010</year></dates><publisher>河南工業(yè)大學</publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[70]，促進了除PC磷脂的溶解，而此時PC的溶解速率上升緩慢甚至可能低于95%乙醇濃度時PC的溶解速率，導致在無水乙醇體系下PC含量得率均低于95%乙醇濃度體系。因此選擇95%乙醇濃度進行下一步因素的探索，該條件下PC含量為76.2%，得率為21.5%。固液比對乙醇萃取效果的影響圖2-4固液比對乙醇萃取PC含量和得率的影響固定實驗條件：乙醇濃度95%，萃取時間30min，萃取溫度60°C，萃取次數(shù)1次。探索1:1.5、1:2、1:4、1:6、1:8固液比（g/mL）對乙醇萃取PC含量和得率的影響。PC含量與PC在溶液中的濃度和是否處于飽和狀態(tài)有直接關系，探索不同固液比對PC以及其他磷脂在溶液中的濃度影響可通過PC含量和得率來反映。選擇合適的固液比，觀察PC從飽和狀態(tài)到濃度逐漸變低的含量趨勢至關重要。因為固液比在1:1（g/mL）時，固體含量過高，難以在攪拌時均勻分散在溶液中，故選擇固液比范圍為1:1.5-1:8（g/mL）。由圖2-4可知，固液比范圍在1:1.5–1:2（g/mL）時，PC含量隨溶液體積的增加而上升。該過程中固比為1:1.5（g/mL）時，溶液中PC過度飽和，多數(shù)PC未溶解，乙醇溶液增加時，PC與其他磷脂的溶解差異變大，使得PC含量提高。固液比范圍在1:2–1:8時，隨著溶液體積的增加，PC含量隨之下降，而得率逐漸上升。萃取溶液用量低于實驗萃取常用量，一般多數(shù)文獻中乙醇萃取PC固液比范圍在1:4-1:20，造成PC含量隨溶液體積增加而下降的現(xiàn)象。此時PC在溶液中的濃度遠低于飽和度，而乙醇-水溶液的添加會溶解更多其他磷脂，導致PC含量越來越低。磷脂整體溶解質量隨溶液體積增加而增加，故PC得率呈現(xiàn)一直上升的趨勢。根據(jù)圖2-4可知，固液比為1:2（g/mL）時，純度最高，與固液比1:4（g/mL）相比PC含量高約4%，得率低約2%。綜合考慮，選擇固液比1:2（g/mL）最佳，該條件下PC含量為80.0%，得率為19.2%。萃取時間對乙醇萃取效果的影響圖2-5萃取時間對乙醇萃取PC含量和得率的影響固定實驗條件：乙醇濃度95%，液比1:2（g/mL），萃取溫度60°C，萃取次數(shù)1次。探索10min、20min、30min、40min、50min萃取時間對乙醇萃取PC含量和得率的影響。萃取時間過短，PC未溶解完全，得率低。萃取時間過長，容易提高其他磷脂溶解量。因此需要選擇一個適合的萃取時間得到可觀的PC含量和得率。由圖2-5可知，萃取時間在20-40min時，PC含量隨著時間的推移而上升。此時溶液中PC未達到飽和，同時PC的溶解和擴散需要時間，此時PC含量與萃取時間成正比。而萃取時間在10-20min和40-50min時，PC含量隨時間增加而下降，而PC得率上升。因為在這段時間內，磷脂中PE等其他磷脂組分的溶解速率大于PC，導致了PC含量的下降。根據(jù)圖2-5可知萃取時間為40min時，PC含量最高，且得率僅比萃取50min時低0.5%。該條件下PC含量為80.3%，得率為22.1%。故選擇萃取時間為40min佳條件。萃取溫度對乙醇萃取效果的影響圖2-6萃取溫度對乙醇萃取PC含量和得率的影響固定實驗條件：乙醇濃度95%，固液比1:2（g/mL），萃取時間40min，萃取次數(shù)1次。探索30°C、40°C、50°C、60°C萃取溫度對乙醇萃取PC含量和得率的影響。乙醇萃取過程中，溫度的改變會影響溶液的黏度及磷脂的傳質速率，從而影響最終萃取效果。從工業(yè)生產的角度考慮，萃取溫度過高，會促進磷脂的氧化，增大設備耗能，萃取溫度過低，會降低萃取效率，因此要挑選一個合適的溫度范圍對萃取效果進行探索。由圖2-6可知，在溫度范圍為30-50°C時，隨著溫度升高，PC含量和得率上升，原因是該溫度范圍下，體系溫度升高，乙醇溶液粘度降低，磷脂各組分傳質速率增大，擴散系數(shù)增加，PC的溶解效率提高ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>葛玉卿</Author><Year>2004</Year><RecNum>262</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[71]</style></DisplayText><record><rec-number>262</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">262</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>葛玉卿</author></authors></contributors><titles><title>大豆磷脂酰膽堿的提取純化研究</title></titles><dates><year>2004</year></dates><publisher>中南大學</publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[71]。當溫度高于50°C時，PC含量和得率隨著溫度的升高而下降，此時溫度的升高促使磷脂與水和乙醇乳化，開始凝結成團，分散性降低，不易攪拌；同時，溫度的升高更有利于磷脂其他組分的溶解，導致最后PC含量和得率降低。萃取溫度為50°C時PC含量和得率最高，因此選擇該條件作為最優(yōu)條件，PC含量為83.8%，得率為23.2%。（5）萃取次數(shù)對乙醇萃取效果的影響圖2-7萃取次數(shù)對乙醇萃取PC含量和得率的影響固定實驗條件：乙醇濃度95%，固液比1:2（g/mL），萃取時間40min，萃取溫度50°C。探索1次、2次、3次、4次、5次萃取次數(shù)對乙醇萃取PC含量和得率的影響。萃取PC的過程中，僅萃取一次并不能將磷脂中的PC提取完全，從生產的角度考慮，往往要選擇高得率和萃取溶劑的消耗量低的實驗條件，確定合理的萃取次數(shù)。由圖2-7可知，相比萃取1次，萃取次數(shù)為2次時PC含量和得率更高，因為只萃取1次時，磷脂沉淀物中還殘留部分PC，經過乙醇-水溶液的再次溶解提高了PC的含量。當萃取次數(shù)超過兩次時，磷脂沉淀物中PC含量越來越少；此時，溶液溶解磷脂其他組分能力增強，溶解PC能力變弱，得率隨著萃取次數(shù)的增加而升高。在萃取次數(shù)達到4次時，得率的上升趨勢接近平緩。綜合PC含量、得率和溶劑消耗的考慮，萃取3次時，PC得率上升明顯且PC含量僅次于萃取2次的條件，故選擇萃取3次作為最優(yōu)條件，該條件下PC含量為84.4%，得率為36.2%。乙醇體系冷凍過程中不同因素對卵磷脂含量的影響利用低溫條件下PC與其他磷脂組分在乙醇溶液中溶解度差異被放大，更多非PC的磷脂組分析出，達到進一步提純PC的效果。以乙醇萃取法得到的粗提PC作為原料，其中PC含量約為84%。探索乙醇冷凍提取PC的最優(yōu)條件，通過單因素實驗對各個影響因子進行探討。本實驗考察乙醇濃度（%）、固液比（g/mL）、萃取時間（min）對PC中DLPC含量的影響，以制備PC含量（%）和得率（%）作為考察指標。乙醇濃度對冷凍純化效果的影響圖2-8乙醇濃度對冷凍純化PC含量和得率的影響固定實驗條件：固液比1:4（g/mL），冷凍時間24h，冷凍溫度-7°C。探索80%、85%、90%、95%、100%乙醇濃度對冷凍純化PC含量和得率的影響。乙醇溶液中的水在低溫下結晶，影響不同磷脂在冷凍過程的析出程度以及在乙醇中的溶解情況。挑選合適的乙醇濃度進行冷凍法有利于提高純化效果。磷脂通過與水形成膠體結晶析出ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李桂華</Author><Year>2010</Year><RecNum>263</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[36]</style></DisplayText><record><rec-number>263</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">263</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李桂華</author><author>王成濤</author><author>方芳</author></authors></contributors><titles><title>乙醇冷凍法純化分離大豆磷脂酰膽堿研究</title><secondary-title>糧食與油脂</secondary-title></titles><periodical><full-title>糧食與油脂</full-title></periodical><pages>17-19</pages><number>05</number><dates><year>2010</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[36]。由圖2-8可知，不同含水量條件下，乙醇與不同磷脂組分的結合能力也會發(fā)生變化。乙醇濃度范圍在85-95%時，PC含量隨著乙醇溶液中水分的減少而上升。當溶劑體系完全無水時，PC含量顯著降低。原因是在無水時，乙醇溶解PC的能力變差；或者無水時不利于其余磷脂組分的析出。從圖2-8可看出，PC含量最低值與最高值相差約4%。因為乙醇濃度對冷凍法純化效果影響顯著。本章實驗主要以提高PC含量為目的，乙醇濃度為95%時PC含量最高，故選擇95%乙醇濃度作為最優(yōu)條件，該條件下PC含量為92.4%，得率為58.3%。固液比對冷凍純化效果的影響圖2-9固液比對冷凍純化PC含量和得率的影響固定實驗條件：乙醇濃度95%、冷凍時間24h。冷凍溫度-7°C。探索1:2、1:4、1:6、1:8（g/mL）固液比對冷凍純化PC含量和得率的影響。溶劑的體積決定了溶解磷脂量的多少，不同固液比下各磷脂組分與水和乙醇結合的方式也有所區(qū)別，探索固液比對冷凍純化PC的影響至關重要。由圖2-9可知，隨著溶液體積的添加，PC得率逐漸上升，但上升的趨勢逐漸由明顯變?yōu)榫徛Ｒ驗樵谝欢ǚ秶鷥?，溶液體積越大，磷脂的溶解量越大，磷脂析出量越少；同時，溶劑體積的增加意味著PC逐漸脫離飽和狀態(tài)，磷脂其他組分逐漸在溶液中溶解，導致PC含量降低。圖2-9的結果中，固液比為1:2（g/mL）條件下PC含量最高，但此時得率最低。相比之下，固液比為1:4（g/mL）時，PC含量僅低0.8%，且得率高22.6%。為保證實驗的經濟價值，在提高PC含量的同時還需保證有足夠的得率。同時為了滿足得率，也不能以犧牲純度為代價，還要避免過度的溶劑消耗造成成本負擔。最后選擇固液比1:4（g/mL）作為本因素最優(yōu)條件，該條件下，PC含量為92.4%，得率為58.3%。冷凍時間對冷凍純化效果的影響圖2-10冷凍時間對冷凍純化PC含量和得率的影響固定實驗條件：乙醇濃度95%、固液比1:2（g/mL）。冷凍溫度-7°C。探索8h、12h、16h、20h、24h冷凍時間對冷凍純化PC含量和得率的影響。乙醇冷凍純化效果與冷凍時長有很大關聯(lián)。冷凍時間短，磷脂其他組分未沉淀完全，冷凍時間長可能導致更多PC析出。由圖2-10可知，當冷凍時間低于20h時，PC含量隨冷凍時間的增加而上升，隨著時間的推移，更多其他磷脂組分析出。有文獻報道溶液與環(huán)境存在溫度差時，因溫度驟降，飽和度高的其他磷脂會析出，同時夾帶部分PC析出ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李召妍</Author><Year>2010</Year><RecNum>264</RecNum><DisplayText>