DB3301T 1089-2017 甘薯脫毒種苗標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程　

DB3301DB3301/T1089—20172017-12-15發(fā)布2018-01-15實(shí)施杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由杭州市農(nóng)業(yè)局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、建德市種子管理站、余杭區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心、淳安縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心、臨安區(qū)農(nóng)林技術(shù)推廣中心、浙江大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：石江、趙琳、嚴(yán)百元、方文英、余建忠、駱樂(lè)談、朱月清、孫鐘毓、馬華升。11范圍件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB7413甘薯種苗產(chǎn)地檢疫規(guī)程N(yùn)Y/T1200甘薯脫毒種薯DB52/T854甘薯脫毒原原種(苗)生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程應(yīng)用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得，經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)不帶甘薯(SPCFV)、甘薯病毒G(SPVG)、甘薯病毒2(SPV2)、甘薯褪綠矮縮病毒(SPCSV)的組培苗。脫毒種苗4.1基地選擇2脫毒組培苗移栽前40天，密閉大棚，用二氧化氯土壤消毒劑(2kg/667m2)通過(guò)噴灌或滴灌對(duì)基參照4.6.3三級(jí)脫毒種苗繁育的方法。a)甘薯羽狀斑駁病毒(sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV);b)甘薯褪綠斑病毒(sweetpotatochloroticflecksvirus,SPCFV);e)甘薯褪綠矮縮病毒(sweetpotatochloroticstuntvirus,SPCSV);f)黑斑病(Blackrot,病原CeratocystisfimbriataELL.&Halst);g)瘡痂病(Scab,病原SphacelomabatatasSawada);h)蔓割病[Stemrot,Fusariumwilt;病原Fusariumoxysporumf.sp.batatas(Wollenweber)3i)莖線蟲病(Stemnematode,Brownring;病原DitylenchusdestructorThorne)。5.2淘汰的病蟲害不能在達(dá)到質(zhì)量要求的脫毒種苗上發(fā)生的病蟲害：a)根結(jié)線蟲病[Root-knotnematode,病原Meloidogyneincognita(Kofoid&White)Chitwood];b)細(xì)菌性萎蔫病(甘薯瘟)(Bacterialwilt,病原PseudomonassolanacearumE.F.Sm.);c)根腐病[Rootrot,病原Fusariumsolani(Mart.)Sacc.f.sp.batatasMcClure];d)甘薯小象甲(蟻象)[Weevil,Cylas.formicarius(Fabricius)];e)莖腐病(bacterialstemandrootrot;病原ErwiniacA/ysanfAmi)。6病蟲害防治6.1主要病蟲害主要病蟲害有甘薯黑斑病、根腐病、病毒病、蚜蟲、地老虎、蠐蠟等。6.2防治原則6.3農(nóng)業(yè)防治保持防蟲網(wǎng)的完整，加強(qiáng)操作人員進(jìn)入衛(wèi)生與進(jìn)出管理，及時(shí)關(guān)閉防蟲網(wǎng)，合理調(diào)節(jié)環(huán)境因子、改善栽培條件、優(yōu)化水肥管理，創(chuàng)造有利于甘薯生長(zhǎng)發(fā)育而不利于病害發(fā)生的環(huán)境條件。6.4物理防治采用殺蟲燈、黃板以及性誘劑誘殺害蟲。6.5生物防治釋放天敵，保護(hù)天敵，創(chuàng)造有利于天敵生存的環(huán)境，選擇對(duì)天敵殺傷力低的農(nóng)藥。6.6化學(xué)防治6.6.1防治原則對(duì)癥下藥，適期用藥，交替使用。運(yùn)用適當(dāng)?shù)臐舛扰c劑量，合理混配，嚴(yán)格控制用量。再進(jìn)行扦插。6.6.3根腐病用77%氫氧化銅可濕性粉劑500倍液等噴霧防治。6.6.4蚜蟲用10%啶蟲脒3000倍液噴霧防治。47抽樣7.1.2擴(kuò)繁組培苗隨機(jī)抽取1%～2%。8檢測(cè)8.1生物學(xué)方法8.1.1目測(cè)法(外觀癥狀診斷法)可根據(jù)甘薯葉片上出現(xiàn)的典型癥狀判斷甘薯是否帶毒。甘薯病毒接穗，巴西牽牛為砧木。將待檢樣品莖蔓中下部莖段切成3段~5段，每個(gè)接穗帶一個(gè)單芽及葉片，去葉后將底端削成楔形，插入巴西牽牛砧木切口內(nèi)，封口膜扎緊。巴西牽牛生長(zhǎng)出1~2片真葉時(shí)嫁接，嫁接后白天保持氣溫26～32℃,相對(duì)濕度80%～90%,適當(dāng)遮蔭，嫁接成功后，給予充足光照。嫁接后2周～3周顯癥，在所有嫁接指示植物中只要有一株植物葉片表現(xiàn)羽狀斑駁癥狀即存在羽狀斑駁病毒，8.3RT-PCR技術(shù)9質(zhì)量要求凡酶聯(lián)免疫檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)或指示植物檢測(cè)呈陽(yáng)性者為帶毒(苗),其中原種病毒病株允許率≤2.0%,生產(chǎn)用種病毒病株允許率≤10%。脫毒種苗分級(jí)以繁殖田播種的種薯級(jí)別、帶病植株比率、混雜植株比率為定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。只要檢出根腐病、根結(jié)線蟲病、甘薯瘟、甘薯莖腐病、甘薯小象甲(蟻象),即5次級(jí)脫毒種苗及三、四級(jí)脫毒種苗均可作為生產(chǎn)用脫毒種苗，作生產(chǎn)用脫毒種苗時(shí)，應(yīng)剪取3～4節(jié)為1株苗。不同品種單收單放，做好標(biāo)記嚴(yán)禁混雜。生產(chǎn)技術(shù)模式見(jiàn)附錄C。6(資料性附錄)甘薯主要病蟲害癥狀病害名稱植株塊根甘薯病毒病苗期葉片褪綠斑點(diǎn)或輕微褪綠半透明斑，邊緣上卷，生長(zhǎng)后期，有些斑點(diǎn)四周呈紫褐色或形成紫環(huán)斑，多數(shù)品種沿葉脈形成紫色羽紋狀；發(fā)展到一定時(shí)期，葉片皺縮黃化，葉緣不整齊或扭曲，有與中脈平行的褪綠半透明斑，個(gè)別植株有叢生現(xiàn)象。薯塊上產(chǎn)生黑褐色或黃褐色龜裂紋，排列成橫帶狀或貯藏后內(nèi)部薯肉木栓化，剖開(kāi)病薯可見(jiàn)肉質(zhì)部具黃褐色硬脆斑塊。甘薯細(xì)菌性萎蔫病(甘薯從育苗到結(jié)薯均能發(fā)病。晴天中午，病苗頂部葉片萎垂，莖基呈現(xiàn)黑褐色水爛狀，維管束從上而下黃褐色條紋狀，嚴(yán)重時(shí)，莖內(nèi)全部腐爛，僅殘留纖維。成株發(fā)病，葉色暗淡，無(wú)光澤，蔓出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，呈黑褐色，剖視維管束，褐色條紋用手拉易脫皮，留下纖維。輕病薯塊乳汁明顯減少，有臭味，煮后不爛，外表癥狀常部明顯，僅薯蒂附近呈黑褐色或尾根呈不同程度病變，剖開(kāi)橫切面為分散的褐色小斑點(diǎn)或黃褐色至深褐色斑塊，縱切面從藤頭或自尾根始，維管束呈黃褐色條紋狀，可擠出乳狀菌膿。重癥薯塊，整塊呈黑褐色腐爛或一端腐爛，有膿液狀或淡黃色菌液，臭味濃烈。甘薯黑斑病莖基部形成黑褐色梭形或橢圓形病斑，稍凹陷，病斑初期有灰色霉層，后變?yōu)楹谏蹱钗?，病斑逐漸擴(kuò)大，重者基部全部變黑，枯死。薯塊上形成黑色近圓形病斑，病部稍凹陷，病健交界明顯，組織堅(jiān)實(shí)，如用刀橫割病斑部，可見(jiàn)薯皮下的薯肉呈青褐色或黑褐色，深0.5cm~ 2cm,有強(qiáng)烈的臭味。病部木栓化，堅(jiān)硬，干腐，在適當(dāng)條件下，病斑中央會(huì)長(zhǎng)出黑色刺毛狀物---子囊殼。甘薯瘡痂病葉片卷皺呈木耳形；芽僵縮；莖蔓和葉柄生出凸凹粗糙的病斑，病蔓先端硬化僵直不再完全伏地；頂芽受害病斑初為透明深紅色，擴(kuò)大后逐漸變黑褐色而枯死；新梢和幼葉不能長(zhǎng)大，整個(gè)頂梢收縮僵硬而直立，表現(xiàn)粗糙成麻臉狀。薯塊表面產(chǎn)生暗褐色至灰褐色小點(diǎn)或于斑，干燥時(shí)瘡痂易脫落，殘留疹狀斑或疤痕。甘薯蔓割病幼苗、葉脈間葉肉變黃，莖內(nèi)維管束變褐色。潮濕時(shí)，病部產(chǎn)生白色至粉紅色的霉層。輕者分枝增生和節(jié)間縮短，莖基膨大，出現(xiàn)青暈，表皮似裂呈絲狀。罹病植株發(fā)生全株性枯萎、死亡，地上部葉片自下而上變黃脫落，莖開(kāi)裂。維管束變褐，橫切薯塊蒂部，可見(jiàn)褐色圓環(huán)形斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)，上部莖蔓枯死，而薯塊并不腐爛，且在土表抽出很多幼蔓。甘薯根腐病根系腐爛，多從不定根的尖端或中部開(kāi)始變黑，逐漸向上蔓延至根莖部位1～2個(gè)葉節(jié)，形成黑褐色病斑。病斑表皮縱裂，重病株地下根莖大部分變黑，地上部莖蔓縮短，分枝少或無(wú)分枝，形成獨(dú)桿苗，葉片發(fā)黃、反卷、葉變小，組織硬化且脆，葉片自下而上干枯脫落，植株大量現(xiàn)蕾開(kāi)花，常造成大片死苗，重者全部死亡。一般不結(jié)薯，輕病株結(jié)薯畸形，呈大腸狀或葫蘆狀，表皮松軟，表面小病斑，用手一拉就下來(lái)，未向薯肉深入。7甘薯根結(jié)線蟲病根系形成繩結(jié)狀，使地下部多牛蒡狀，毛根縱生，細(xì)跟上有米粒大小的根結(jié)，有的成串，剝開(kāi)根結(jié)，可見(jiàn)一至數(shù)個(gè)雌蟲。龜裂型：塊根畸形，褐色縱裂口棒根型：粗1cm～2cm,棒狀塊根線根型：只有線狀牛蒡根，不膨大成薯塊。甘薯莖線蟲病苗期：發(fā)病重的出苗稀、矮小、發(fā)黃，剖視莖基部，內(nèi)有褐色空隙，剪斷后不流或很少流白漿。后期侵入部位表皮裂成小口，髓部呈褐色干腐狀，剪斷后無(wú)白漿。莖蔓癥狀：主蔓基部髓部先白色干腐，后漸變褐色，嚴(yán)重時(shí)基部蔓短、葉黃，甚至主蔓枯死。根部癥狀：根部表皮壞裂?？沸男停菏砻纭⒎N薯帶病，先塊根縱剖面內(nèi)部呈稀絮狀白色糠道，后期由于伴隨其他雜菌形成褐色相間的褐色糠道。有時(shí)內(nèi)部雖毀壞，但外表接近健者。裂皮型：發(fā)病輕肉眼不易看出，開(kāi)始外皮褪色，不久變青，有的稍凹陷，有的有小裂口，皮下組織變褐，最后皮色呈暗紫色，并多龜裂，內(nèi)呈褐白相間的干腐。甘薯莖腐病甘薯莖枝在發(fā)病初期，病株生長(zhǎng)較為緩慢，在與土壤接觸的莖基部會(huì)產(chǎn)生褐至黑色、水漬狀的病斑，最后軟化解離，導(dǎo)致枝條末端的部分萎凋。此外，根莖維管束組織有明顯的黑色條紋、并有惡臭。在高溫高濕的條件下，莖部腐爛迅速向上擴(kuò)展，呈黑色，莖、葉組織開(kāi)始變軟、腐爛，整個(gè)植株發(fā)病倒伏，最后全株枯萎死亡。薯塊表面有黑色凹陷病斑，或外部無(wú)癥狀，內(nèi)部腐爛，受侵染組織呈水浸狀。甘薯小象甲(蟻象)外露的塊根和莖葉被啃食，常使植株變黃，重者死亡，造成田間缺苗。幼蟲危害薯塊，取食成蛀道，且排泄物充斥于蛀道中，能誘導(dǎo)薯塊產(chǎn)生萜類和酚類物質(zhì)，使薯塊變苦。8DB3301/T1089—2017B.1試劑B.1.1三羥甲基氨基甲烷(TBS)(pH7.5)TirsBase4.84g氯化鈉(NaCl)58.44g疊氮鈉(NaN?)0.40g溶于1990ml蒸餾水中，用鹽酸(37%)調(diào)pH至7.5,定容至2000ml。B.1.3抽提緩沖液亞硫酸鈉(Na?SO?)0.2g溶于TBS中，定容至100ml。B.1.4封閉緩沖液(現(xiàn)用現(xiàn)配)脫脂奶粉粹通X-100(TritonX-100)25mlTBSTrisBase6.0氯化鈉(NaCl)2.92g氯化鎂(MgCl?'6H?O)0.51g疊氮鈉(NaN?)0.05g溶于450ml蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至9.5,B.1.7硝基藍(lán)四唑鹽(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)儲(chǔ)備液NBT0.04g9DB3301/T1089—201770%N,N-二甲基甲酰胺混合均勻，4℃避光保存。BCIP混合均勻，4℃避光保存。B.1.8底物溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)底物緩沖液25mlB.2樣品制備葉制樣。B.3.2封閉將干燥后的膜浸泡在封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩(50r/min)1h。B.3.3孵育第一抗體將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗血清中，室溫下?lián)u床振蕩(50r/min)過(guò)夜。B.3.4洗滌用洗滌緩沖液洗膜3次，每次搖床振蕩(100r/min)3min。將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體中，室溫下?lián)u床振蕩(50r/min)1h。B.3.6洗滌洗滌4次，方法同A3.4。B.3.7顯色將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室溫下?lián)u床振蕩(50r/min)孵育30min。B.3.8終止反應(yīng)棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩(100r/min)3min。晾干后觀察顏色反應(yīng)，出現(xiàn)藍(lán)紫色顏色反應(yīng)的樣品為陽(yáng)性。(資料性附錄)甘薯脫毒種苗標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)模式DB3301/T基質(zhì)橫大棚組培苗組培苗培非空，脫季種苗脫母種苗擴(kuò)繁可根據(jù)甘墓葉片上出現(xiàn)的典型癥狀判斷甘要是否帶零控制和溝汰的病蟲音生物學(xué)方法酶聯(lián)允疫吸附法、RT-PCR技術(shù)，生產(chǎn)技術(shù)基地選擇選擇周邊500m內(nèi)無(wú)村莊，無(wú)甘要及旋花科、茄科、麗嚴(yán)科作物種植，無(wú)檢疫性病蟲警發(fā)生的區(qū)域，選用背風(fēng)向陽(yáng)、排淄方便、前作非以上作物種植及有隔商條件的地塊，建立塑料大棚，大棚外充全覆蓋60目尼龍網(wǎng)，共中入口處設(shè)拉鏈，方便人員進(jìn)出百苗基質(zhì)根據(jù)條件選用商用育苗基質(zhì)?；|(zhì)楠建立在保護(hù)大棚內(nèi)，按基質(zhì)槽充80cm,操作道寬40cm,建立基質(zhì)槽，橫底用約10cm細(xì)石子與土壤隔可根據(jù)甘墓葉片上出現(xiàn)的典型癥狀判斷甘要是否帶零控制和溝汰的病蟲音生物學(xué)方法酶聯(lián)允疫吸附法、RT-PCR技術(shù)，生產(chǎn)技術(shù)基地選擇選擇周邊500m內(nèi)無(wú)村莊，無(wú)甘要及旋花科、茄科、麗嚴(yán)科作物種植，無(wú)檢疫性病蟲警發(fā)生的區(qū)域，選用背風(fēng)向陽(yáng)、排淄方便、前作非以上作物種植及有隔商條件的地塊，建立塑料大棚，大棚外充全覆蓋60目尼龍網(wǎng)，共中入口處設(shè)拉鏈，方便人員進(jìn)出百苗基質(zhì)根據(jù)條件選用商用育苗基質(zhì)。基質(zhì)楠建立在保護(hù)大棚內(nèi)，按基質(zhì)槽充80cm,操作道寬40cm,建立基質(zhì)槽，橫底用約10cm細(xì)石子與土壤隔離，基質(zhì)鋪設(shè)厚度約20cm.移栽前1天澆水至基質(zhì)合水量70%左右.脫季組培苗移裁前40天，密閉大棚，用二氧化數(shù)土壤消零劑(2kg/667m2)通過(guò)噴淄或滴淄對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒，互到基質(zhì)底層先全濕潤(rùn)后關(guān)閉閥門，大棚密閉消琴7天，隨后通風(fēng)拌除殘留氧氣.將脫霉苗種植于防蟲網(wǎng)室內(nèi)，每株系3株，對(duì)照原品種的特征特性及生產(chǎn)力鑒定，剔除交異株系和混雜株系，選用生產(chǎn)力強(qiáng)的株系進(jìn)行擴(kuò)大繁殖.大棚基質(zhì)槽加設(shè)小拱想，當(dāng)小拱棚內(nèi)溫度穩(wěn)定在20℃以上時(shí)，選取植株長(zhǎng)勢(shì)好、經(jīng)鑒定無(wú)病毒攜帶的脫琴組培苗，洗去根部培雅基后即刻移栽至大棚，基質(zhì)槽內(nèi)出度為20cm×20cm.邊移戴邊澆水活苗，并遮麗3天.注意大棚、小拱棚內(nèi)通風(fēng)管理，保持苗生長(zhǎng)溫度在25-30℃,當(dāng)大棚內(nèi)溫度穩(wěn)定在20℃以上時(shí)，拆掉小拱棚，根措基質(zhì)類型、種菌生長(zhǎng)情況對(duì)其進(jìn)行肥水管理。脫毒種苗素百初級(jí)種苗。當(dāng)初級(jí)脫季種苗生長(zhǎng)至10節(jié)以上，以每2節(jié)作1株剪取種苗，母株留1~2個(gè)節(jié)位，用作次級(jí)脫季種苗生產(chǎn)，剪取的種苗立即在次級(jí)脫零種苗紫育大棚內(nèi)移栽，在基質(zhì)橫內(nèi)脫毒組培苗移栽出度約為40cm×10cm.管蓮與初級(jí)脫毒種苗的繁育相同.推季藥劑用量用法農(nóng)藥種類。60%唑醚·代森聯(lián)1000倍液浸泡盞基部6cm~10cm處10min~12min,然后葦進(jìn)行捍插。暴班病當(dāng)次級(jí)脫毒種苗生長(zhǎng)總節(jié)數(shù)至20節(jié)以上時(shí)，按照次級(jí)脫季種苗繁育的方法繁育三級(jí)25%唑面酯，25%噸醫(yī)酶1500倍液浸泡莖基部6cm~10cm處10min~12min,然后苒進(jìn)行扦插.四級(jí)種苗參照三級(jí)脫種苗繁育的方法繁育.根腐病77%氫氧化銷可濕性粉劑用77%氫氧化鋼可濕性粉劑500倍液等噴霧防治。必須每株都進(jìn)行檢脫毒核心材料。苗抽樣。葬