《水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測 膠體金免疫層析法》編制說明

廣東省分析測試協(xié)會團體標準

《水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測

膠體金免疫層析法》（征求意見稿）

編制說明

《水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測膠體金免疫層析法》編制組

2024年5月

1.任務(wù)來源及簡要起草過程

1.1任務(wù)來源

本文件方法來自申報2023年度廣東省分析測試協(xié)會團體標準項目，2023年10

月，獲廣東省分析測試協(xié)會2023年團體標準修訂計劃項目（第二批）（編號：

GAIA/JH20230201）立項，任務(wù)名稱為《水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測膠體金

免疫層析法》。

1.2起草單位、起草人

本文件起草單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、深圳市卓潤生物科技有限公司、廣州市輕

工職業(yè)技術(shù)學(xué)校、海南省檢驗檢測研究院食品檢驗檢測中心、廣州市輕工職業(yè)技

術(shù)學(xué)校、廣州萬聯(lián)生物科技有限公司、廣州市增城區(qū)農(nóng)產(chǎn)品推廣與質(zhì)量安全監(jiān)督

所、廣州市從化區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心、佛山市南海區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全

檢測中心、廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心）、廣州分析

測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司

本文件主要起草人：徐振林、張賽、黃艷、李備、陳遂、雷紅濤、魏靜、尹

青春、何健靈、徐杰偉、劉藴欣、楊熙、江林峰、韓金治、陳偉妍、陳鏡欽、鄧

永健、董家琿、韋天才、鐘鳴

1.3背景與意義

河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）一種低分子量的非蛋白類神經(jīng)毒素，廣泛存

在于河豚，織紋螺等海洋生物體內(nèi)。最早于20世紀10年代日本化學(xué)家田原良純

率先在河豚中發(fā)現(xiàn)。河豚毒素被認為是海洋中最致命的毒素之一，小鼠腹腔注

射的半致死劑量（LD50）僅為10.7μg/kg。據(jù)報道，等量的河豚毒素與氰化物相

比，毒性為氰化物的數(shù)萬倍，且0.5mg的河豚毒素可致一成年人死亡。它通過

選擇性阻斷神經(jīng)，骨骼肌和心肌膜的電壓門控Na+通道的動作電位而起作用。是

一種強大的鈉通道阻滯劑。人體攝入微量便可產(chǎn)生致命影響，主要導(dǎo)致肌肉和神

經(jīng)的麻痹,喪失運動能力，更嚴重者會出現(xiàn)呼吸衰竭和心血管衰竭。而在亞洲等

多個國家，因為河豚具有較高的營養(yǎng)價值，自古以來有食用河豚的習(xí)慣。并且我

國在2016年批準并建立了第一批河豚養(yǎng)殖基地，覆蓋我國的多個地區(qū)。近年來，

多次報道河豚毒素致人死亡的病例。鑒于河豚毒素確實具有嚴重的毒性作用且沒

有特效解毒劑，因此建立一種輕便，快速，靈敏，不需要大量成本投入的檢測方

法十分必要。

1

目前，水產(chǎn)品中河豚毒素的常用檢測方法有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法

（HPLC）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）等，該類儀器方法具有準確

性好、靈敏度高等特點，但需要專業(yè)人員操作，檢測過程復(fù)雜，時間長，成本高，

不利于大量樣品的現(xiàn)場快速篩查，也難于在基層檢測單位進行推廣應(yīng)用。

與儀器法相比，免疫檢測方法因其操作簡單、檢測時間短、成本低等優(yōu)點收

到廣大一線消費者和檢測人員的青睞。其中免疫層析檢測方法只需提取、稀釋、

點樣等簡單步驟5~10min后便可直接通過肉眼判斷檢測結(jié)果，無需其他專業(yè)的

操作和任何專業(yè)儀器，但目前市面上暫無針對水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測標準。

本項目旨在開發(fā)一種簡單快速、適用于水產(chǎn)品中河豚毒素的膠體金免疫層析

快速檢測方法來滿足大量樣品現(xiàn)場篩選和監(jiān)控和提高我國食品監(jiān)管部門的檢測

效率。

1.4簡要起草過程及技術(shù)路線

本方法研究過程中查閱了國內(nèi)外相關(guān)標準法規(guī)和參考文獻，研究了水產(chǎn)品

中河豚毒素膠體金免疫層析試紙條，確定了檢測產(chǎn)品的基質(zhì)適用性、檢測項目、

檢測限、檢測步驟、結(jié)果判斷等內(nèi)容，選擇了1種滿足檢測要求的膠體金金試紙

條進行方法學(xué)考察。根據(jù)原國家食藥總局發(fā)布的《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)

范》（食藥監(jiān)辦科[2017]43號）的要求，對河豚毒素膠體金免疫層析試紙條進行

了性能指標（靈敏度、特異性）的分析，建立了水產(chǎn)品中河豚毒素膠體金免疫層

析試紙條快速定性檢測方法，依據(jù)GB/T1.1《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準的

結(jié)構(gòu)和編寫》編寫了“水產(chǎn)品中的河豚毒素的快速檢測膠體金免疫層析法”標準

草案。

標準制定技術(shù)路線圖：

2.起草原則與其他標準、法規(guī)的關(guān)系

2.1起草原則

本方法在起草過程中，查閱國內(nèi)外有關(guān)文獻資料以及各行業(yè)部門制訂的同

類標準方法，并按照《國家標準管理辦法》的程序與基本要求進行。在方法制定

的過程中嚴格遵循國家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)章，嚴格執(zhí)行國家強制性標準

和行業(yè)標準。按照GB/T1.1-2020和GB/T20001.4-2015的要求進行制定，與同

體系標準及相關(guān)的各種基礎(chǔ)標準互銜接，遵循政策協(xié)調(diào)統(tǒng)一性原則。在標準制定

2

過程中遵循“先進性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，注重方法的可行性。

將GB5009.206—2016《食品安全國家標準水產(chǎn)品中河豚毒素的測定》作為

參比方法，并按照《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》（食藥監(jiān)辦科〔2017〕43

號）要求進行方法學(xué)考察。

2.2與其他標準、法規(guī)的關(guān)系

國際上，2017年歐盟食品安全局（EFSA）對海洋雙殼類和腹足類動物體

內(nèi)河豚毒素（TTX）對公共健康的風(fēng)險發(fā)布意見，經(jīng)過風(fēng)險評估，歐盟食品

安全局認為，貝肉中河豚毒素濃度低于44μg/kg不會對人體產(chǎn)生不利影響。液

相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）最適合檢測河豚毒素及其類似物，定量限為

0.1-25μg/kg。

國內(nèi)，2016年中華人民共和國國家標準發(fā)布的《食品安全國家標準水產(chǎn)

品中河豚毒素的測定》（GB5009.206-2016）中，規(guī)定了四種水產(chǎn)品中河豚毒

素的測定方法。針對河豚魚肌肉，肝臟，皮膚和性腺組織的小鼠生物法、液相

色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及酶聯(lián)免疫吸附法檢出限分別是3.11MU/g、1μg/kg、3

μg/kg。針對河豚魚、織紋螺、蝦、牡蠣、花蛤和魷魚的液相色譜-熒光檢測法

檢出限為50μg/kg。這些方法靈敏度、準確性高，但檢測時間長、樣品前處理

復(fù)雜，不利于大量樣品的現(xiàn)場篩查和檢測。本項目針對此問題開發(fā)膠體金免疫

層析方法，可用于大量樣品的現(xiàn)場篩查和檢測。

3.技術(shù)內(nèi)容的確定

3.1方法原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中經(jīng)提取后的河豚毒素與膠體金標

記的河豚毒素特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和檢測卡中檢測線（T線）上河豚毒素

抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與質(zhì)控線（C線）顏

色深淺比較，對樣品中目標河豚毒素進行定性判定。

3.2目標化合物的基本信息

表1河豚毒素基本信息表

中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量

河豚毒素Tetrodotoxin4368-28-9C11H17O8N3319

注：經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。

3

3.3確定適用范圍及檢出限

適用范圍：水產(chǎn)品中河豚毒素的膠體金免疫層析快速篩查方法。本方法適

用于河豚魚、織紋螺、蝦等水產(chǎn)品中的河豚毒素成分的快速篩查。

檢出限：10μg/kg。

3.4樣品前處理

3.4.1河豚魚

河豚去皮去內(nèi)臟，將肌肉部分用水清洗魚體表面的污物,濾紙吸干魚體表面

的水分后用剪刀將魚體分解成肌肉、肝臟、皮膚和性腺(精巢或卵巢)等部分,各部

分組織分別用水洗去血污,濾紙吸干表面的水分后將各組織剪碎,充分均質(zhì),裝入

清潔容器內(nèi),并標明標記。準確稱取試樣2g±0.1g于15mL離心管中，加入2

mL對甲苯磺酸溶液，渦旋30s，4000rpm離心2min使固液分離。取200μL上

清液于5mL離心管中，加入400μL樣品稀釋液，渦旋混合30s，作為待測液。

3.4.2織紋螺

去除織紋螺體表面的泥漿及污物，打開螺殼，將其內(nèi)容物剪碎，充分均質(zhì),

裝入清潔容器內(nèi)。準確稱取試樣2g±0.1g于15mL離心管中，加入2mL對

甲苯磺酸溶液，渦旋30s，4000rpm離心2min使固液分離。取200μL上清液

于5mL離心管中，加入400μL樣品稀釋液，渦旋混合30s，作為待測液。

3.4.3蝦

蝦去頭和殼后進行取樣，充分均質(zhì),裝入清潔容器內(nèi)。準確稱取試樣2g±

0.1g于15mL離心管中，加入2mL對甲苯磺酸溶液，渦旋30s，4000rpm離

心2min使固液分離。取200μL上清液于5mL離心管中，加入400μL樣品稀

釋液，渦旋混合30s，作為待測液。

3.5樣品分析步驟的確定

參照國家市場監(jiān)督管理總局已發(fā)布的基于膠體金免疫層析原理的快速檢測

方法（KJ201701-KJ201703、KJ201705-KJ201710、KJ201801、KJ201901-KJ201903、

KJ201905-KJ201907、KJ201910、KJ201913等）的分析步驟進行分析。

3.5.1試紙條與金標微孔測定步驟

取100μL樣品待測液加入金標微孔中，使用移液槍反復(fù)吸打6-10次混合

均勻，室溫孵育3min，隨后將試紙條插入金標微孔中反應(yīng)5min，取出試紙條去

除樣品墊，進行結(jié)果判定。

4

注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。

3.5.2檢測卡測定步驟

取100μL樣品待測液加入檢測卡樣品孔中，反應(yīng)5min，隨后進行結(jié)果判

定。

注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。

3.6結(jié)果判定方法的確定

參照國家市場監(jiān)督管理總局已發(fā)布基于膠體金免疫層析原理的快速檢測方

法（KJ201701-KJ201703、KJ201705-KJ201710、KJ201801、KJ201901-KJ201903、

KJ201905-KJ201907、KJ201910、KJ201913等）的結(jié)果判斷。

通過對比質(zhì)控線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結(jié)果判定。目視

判定示意圖見圖2或3。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。

3.6.1無效

質(zhì)控線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

3.6.2陰性結(jié)果

質(zhì)控線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比質(zhì)控線（C線）顏色深或檢測

線（T線）顏色與質(zhì)控線（C線）顏色相當，均表示樣品中不含待測組分或含量

低于方法檢測限，判為陰性。

3.6.3陽性結(jié)果

質(zhì)控線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比質(zhì)控線（C線）顏色明顯淺或

檢測線（T線）不顯色，均表示樣品中待測組分含量高于方法檢測限，判為陽性。

圖2試紙條目視判定示意圖

5

圖3檢測卡目視判定示意圖

3.7方法性能的確定

本方法的檢測性能（檢出限）設(shè)定為10μg/kg。

3.8標準品

標準品用乙酸溶解標準品粉末，用磷酸鹽緩沖液稀釋。

標準品：河豚毒素（Tetrodotoxin）

3.9實際用到的樣品

空白樣品：選用經(jīng)實驗室儀器檢測確認不含河豚毒素的水產(chǎn)品作為空白樣

品。

加標樣品：用空白樣品添加標準物質(zhì)的方式制備陽性樣品。

4.方法學(xué)考察

按照《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》（食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號）要求

進行方法學(xué)考察。

經(jīng)參比方法確認河豚魚、織紋螺、蝦3種基質(zhì)的水產(chǎn)品空白樣品中，采用

加標的方式進行方法學(xué)考察，根據(jù)檢出限分別添加0倍檢出限、0.5倍檢出限、

1倍檢出限、2倍檢出限。每個濃度水平測定50個樣品，按照《食品快速檢測方

法評價技術(shù)規(guī)范》附表快速檢測方法性能指標計算表要求對方法的靈敏度和特異

性進行計算，測定結(jié)果見表2：

表2保健食品基質(zhì)測定結(jié)果

添加濃度假陰假陽

基質(zhì)檢測結(jié)果靈敏度特異性

（μg/kg）性率性率

6

00(+),50(-)

51(+),49(-)

河豚魚100%99%0%1%

100(-),50(+)

200(-),50(+)

00(+),50(-)

52(+),48(-)

織紋螺100%98%0%2%

100(-),50(+)

200(-),50(+)

00(+),50(-)

53(+),47(-)

蝦99%97%1%3%

101(-),49(+)

200(-),50(+)

4.1檢出限

檢出限是指陽性檢出率為100%的空白樣品中標準物質(zhì)的添加濃度，實驗結(jié)

果表明，該項目研究的方法的檢出限為10μg/kg。

4.2靈敏度和特異性

靈敏度是指方法在實驗條件下達到的實際最低檢出水平時，檢出陽性結(jié)果的

陽性樣品數(shù)占總陽性樣品數(shù)的百分比；特異性是指方法在實驗條件下達到的實際

最低檢出水平時，檢出陰性結(jié)果的陰性樣品數(shù)占總陰性樣品數(shù)的百分比，具體計

算要求見附表，評價中可描述為方法檢出限下不存在干擾的百分比。

按照靈敏度和特異性計算公式，該方法針對河豚魚等水產(chǎn)品的靈敏度≥99%，

特異性≥97%。

4.3假陽性率和假陰性率

假陰性率是指方法在實驗條件下達到的實際最低檢出水平時，陽性樣品中檢

出陰性結(jié)果的最大概率（以百分比計），假陽性率是指方法在實驗條件下達到的

實際最低檢出水平時，陰性樣品中檢出陽性結(jié)果的最大概率（以百分比計），具

體計算要求見附表，計算結(jié)果為方法最大假陽性率的結(jié)果。

7

按照假陰性率和假陽性率計算公式，該方法針對河豚魚等水產(chǎn)品的假陰性率

≤1%，假陽性率≤3%。

4.4與參比方法一致性

選用2016年中華人民共和國國家標準發(fā)布的《食品安全國家標準水產(chǎn)品中

河豚毒素的測定》（GB5009.206-2016）中的第三法作為參比方法，選用三種不

同基質(zhì)的水產(chǎn)品進行方法比對，每個基質(zhì)50個樣品，測定結(jié)果見表3。

評價方法如下：快速檢測方法應(yīng)與方法中規(guī)定的參比方法進行一致性比較。

與參比方法一致性分析統(tǒng)計方法常見卡方檢驗，具體可見附表中顯著性差異（χ2）

所示，一般：

χ2=（a-b-1）2/（a+b）

a：樣品被待確認方法證實為陽性而參比方法檢驗為陰性的數(shù)目；

b：樣品被待確認方法證實為陰性而參比方法檢驗為陽性的數(shù)目。

χ2<3.84表示待確認方法與參比方法的陽性確證比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒

有顯著性差異。但是如果待確認方法比參比方法存在更高的回收率，則以上兩種

方法的陽性確證比率存在顯著性差異是可以接受的。

χ2>3.84表示兩種方法的陽性確認比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異。

表3參比方法一致性分析

基質(zhì)添加濃度（μg/kg）本方法結(jié)果χ2

00(+),50(-)

51(+),49(-)

河豚魚1

100(-),50(+)

200(-),50(+)

00(+),50(-)

55(+),45(-)

織紋螺1.29

102(-),48(+)

200(-),50(+)

蝦00(+),50(-)1

8

53(+),47(-)

101(-),49(+)

200(-),50(+)

由測定結(jié)果可知，使用該方法對水產(chǎn)品中的河豚毒素進行測定，膠體金測定

結(jié)果與參比方法測定結(jié)果無顯著性差異。

4.4其他實驗室驗證結(jié)果

4.4.1驗證單位

方法建立過程中選取汕頭海關(guān)技術(shù)中心、廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗研究院、

海南省食品檢驗檢測中心3家機構(gòu)，對產(chǎn)品進行評價，評價樣品基質(zhì)為東方鲀、

織紋螺、花甲、草魚。

4.4.2驗證結(jié)果

本次驗證對東方鲀、織紋螺、花甲、草魚基質(zhì)空白、1倍檢出限、2倍檢出

限3個濃度梯度（每個濃度50批次）樣品進行驗證，3家機構(gòu)的驗證結(jié)果匯總

如下。

表4三家機構(gòu)驗證結(jié)果

汕頭海關(guān)技術(shù)廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗海南省食品檢驗檢測

中心研究院中心

總總總

項目名稱

驗證結(jié)果數(shù)驗證結(jié)果數(shù)驗證結(jié)果數(shù)

陽性陰性陽性陰性陽性陰性

陽性6006030003001600160

陰性1596003003003157160

總數(shù)6159120300300600163157320

靈敏度p+=60/60=100%p+=300/300=100%p+=160/160=100%

特異性p-=59/60=98.3%p-=300/300=100%p-=157/160=98.1%

假陽性率pf+=1/60=1.7%pf+=0/300=0%pf+=3/160=1.9%

假陰性率pf-=0/60=0%pf-=0/300=0%pf-=0/160=0%

由3家機構(gòu)驗證結(jié)果可知，該方法的靈敏度≥99.9%，特異性≥98.1%，假陽

性率≤2.0%，假陰性≤0.01%。

9

5.采用國際標準和國外先進標準情況及水平對比

目前已經(jīng)報道的河豚毒素定性和定量分析方法主要包括生物分析法、儀器分

析法、免疫分析方法等。但是已經(jīng)立項為標準只有儀器檢測法如液相色譜-串聯(lián)

質(zhì)譜法、液相色譜-熒光檢測法和小鼠生物法。本方法是基于河豚毒素抗體與河

豚毒素特異性識別而建立起來的膠體金免疫檢測方法，原理與儀器法和小鼠生物

法不同。在標準制定過程中，采用了儀器檢測方法中涉及樣品處理的部分方法，

本方法的檢出限為10μg/kg，靈敏度略低于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的1.0μg/kg，

但遠高于液相色譜法的50μg/kg。本方法作為一種補充，可以與現(xiàn)有國際標準和

國外先進標準相互補充。

6.與國內(nèi)現(xiàn)行法律、法規(guī)、政策及相關(guān)標準，特別是強制性標準的協(xié)

調(diào)性

河豚毒素污染的嚴重性受到了全世界的關(guān)注，尤其是亞洲，一些政府已經(jīng)禁

止或限制了帶有河豚毒素的海產(chǎn)品的消費和貿(mào)易。許多國家制定了具體的立法。

日本是立法最明確的國家，自1958年以來，規(guī)定廚師必須有許可證才能烹飪以

河豚為原料的菜肴。除日本外，中國、泰國、臺灣、越南、美國和歐洲也也出臺

了相應(yīng)法規(guī)對河豚毒素進行了限制。其中，歐洲食品安全協(xié)會（EFSA）對TTX

的限量標準為44μg/kg。目前，關(guān)于河豚毒素的殘留限量和檢測方法均無強制性

標準，僅有河豚毒素的檢測方法標準《食品安全國家標準水產(chǎn)品中河豚毒素的測

定》（GB5009.206—2016）。本項目方法作為一種儀器方法的補充，與現(xiàn)有國際

標準和國外先進標準相互補充。法律法規(guī)、政策無沖突，具有良好的協(xié)調(diào)下。

7.公開標準涉及專利的信息，注明專利權(quán)人的談判許可聲明

目前公開涉及河豚毒素的快速檢測專利主要包括：一種快速靈敏檢測河豚毒

素TTX的方法（CN201811019418）、一種河豚毒素檢測試劑盒（CN201410251894）、

一種金磁納米顆粒的制備及其結(jié)合表面增強拉曼光譜法快速檢測河豚毒素

（CN201710307359）等。本項目所采用的方法均與上述專利無相關(guān)，不涉及任

何許可。

8.重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果

在標準制定過程中未有重大意見分歧。

10

9.預(yù)期的社會經(jīng)濟效益及貫徹實施標準的要求、措施等建議

本項目標準預(yù)期建立一種河豚毒素的快速檢測方法，該方法不僅使用方便，

且成本低、結(jié)果可靠，特別是檢測時間<30min，非常適合現(xiàn)場的快速檢測?，F(xiàn)有

儀器檢測方法通常需要5-7個工作日，無法現(xiàn)場出結(jié)果。本標準的立項可以推進

河豚毒素快速檢測方法的使用，對于防止河豚毒素中毒和保障消費者身心健康具

有重要的作用。

為進一步貫徹實施標準，需要加強對基層以及執(zhí)法機構(gòu)的科普以及使用方法

的培訓(xùn)，加強標準的宣貫等措施。

10.其他應(yīng)當說明的事項

無。